蔡成呈++李欣遙++佟長(zhǎng)青++李偉

摘 要：以蘋(píng)果醋為主要原料，添加牡蠣多糖采用正交實(shí)驗(yàn)研制牡蠣多糖蘋(píng)果果醋，并測(cè)定了牡蠣多糖蘋(píng)果果醋、牡蠣多糖及蘋(píng)果醋的ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和還原能力。結(jié)果表明，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋的最佳配方為：牡蠣多糖添加量0.3%，酵母添加量0.1%，檸檬酸添加量0.1%，蜂蜜添加量10%，其感官評(píng)定得分為86.6?？寡趸瘻y(cè)定結(jié)果表明，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋ABTS自由基清除率為95.81%，DPPH自由基清除率為95.11%，還原力為0.66，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：牡蠣多糖；蘋(píng)果醋；正交實(shí)驗(yàn)；抗氧化活性

牡蠣（Oyster）是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類(lèi)之一。牡蠣中含有多種生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制腫瘤、延緩衰老、降血糖、降血脂等生物活性[1]。滕瑜等用牡蠣多糖對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的高血糖大鼠進(jìn)行降血糖的研究，發(fā)現(xiàn)牡蠣多糖提取物可降低血糖、尿糖，改善臨床癥狀[2]。于婭等采用酶解方法制備了牡蠣短肽，HPLC法定量馬尿酸測(cè)定ACE抑制活性，結(jié)果表明，0.4 mg/mL的牡蠣短肽的ACE抑制率為51.4%[3]。劉塞等發(fā)現(xiàn)牡蠣提取物能夠顯著降低高血脂鵪鶉的血漿總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白B的水平，從而起到降血脂作用[4]。Shi等發(fā)現(xiàn)牡蠣多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用[5]。

果醋被譽(yù)為第四代飲料，它不但具有醋原有的功能，還具有保健功能[6]。由于其具有濃郁的香味，果酸含量較為豐富，所以其風(fēng)味和口感都比食醋要好[7]。據(jù)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，果醋對(duì)人體具有良好的功效。它具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝、降低膽固醇的含量、加快酒精在人體內(nèi)的分解代謝、健胃消食等作用，因此是公認(rèn)的集多種療效于一身的健康飲品[8-14]。目前，尚未見(jiàn)到牡蠣多糖蘋(píng)果果醋的報(bào)道。本研究將牡蠣多糖添加到果醋中，研制出牡蠣多糖蘋(píng)果果醋。它不僅具有濃郁的果香及酸甜的口感，而且具有較好的抗氧化活性，是一種理想的保健飲品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘋(píng)果醋飲料 河南鄭新天源食品有限公司；雜花蜂蜜 大連蜂產(chǎn)品有限公司；高活性干酵母 安琪酵母有限公司；牡蠣多糖（CGPS-1） 實(shí)驗(yàn)室自制；DPPH（2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基）、ABTS（2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽） 美國(guó)Sigma 公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸及無(wú)水乙醇 大連沅義科技有限公司。

BS110S分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；IEC微量臺(tái)式小型離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司；UV-754紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣多糖蘋(píng)果果醋的制備 牡蠣多糖蘋(píng)果果醋的加工工藝如下：牡蠣多糖與酵母加水混合均勻，30 ℃發(fā)酵30 min；然后加入一定量的檸檬酸、蜂蜜及蘋(píng)果醋調(diào)味，8 000 r/min離心10 min使調(diào)制的果醋澄清，制得牡蠣多糖蘋(píng)果果醋。

1.2.2 感官評(píng)定 經(jīng)培訓(xùn)、考核、再培訓(xùn)選出十位感官評(píng)定員，對(duì)牡蠣多糖蘋(píng)果果醋外觀、風(fēng)味及口感進(jìn)行評(píng)分，三項(xiàng)評(píng)分的和即為最后得分，并進(jìn)行方差分析，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以感官評(píng)分表為標(biāo)準(zhǔn)，考察牡蠣多糖、酵母、檸檬酸、蜂蜜的添加量對(duì)牡蠣多糖蘋(píng)果果醋外觀、風(fēng)味及口感的影響。設(shè)定多糖添加量為0.3%，酵母添加量為0.25%，檸檬酸添加量為0.1%，蜂蜜添加量為10%，其他條件不變，依次改變單因素含量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。多糖添加量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；酵母、檸檬酸添加量為0.1%、0.25%、0.4%、055%、0.7%；蜂蜜添加量為2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 通過(guò)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定牡蠣多糖、酵母、檸檬酸、蜂蜜的添加量，進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表如表2所示。

1.2.5 果醋理化指標(biāo)的測(cè)定 總酸（以乙酸計(jì)）含量按照國(guó)標(biāo)《食品中總酸的測(cè)定》（GB/T 12456-2008）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。蘋(píng)果酸含量參照國(guó)標(biāo)《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》（GB/T 5009.157-2003）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。乳酸含量參照行標(biāo)《進(jìn)出口果汁中乳酸、檸檬酸、富馬酸含量檢測(cè)方法 高效液相色譜法》（SN/T 2007-2007）規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)pH計(jì)、糖度計(jì)對(duì)牡蠣多糖蘋(píng)果果醋pH、糖度含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 ABTS自由基清除能力測(cè)定 ABTS法測(cè)定的為物質(zhì)的總抗氧化能力，參照文獻(xiàn)[15]并略微改動(dòng)。將7.4 mmol/L的ABTS溶液與2.6 mmol/L的K2S2O8混合，黑暗室溫下放置12 h制得ABTS自由基溶液。用95%乙醇將ABTS自由基溶液稀釋至734 nm處吸光度值為0.7±0.01。將2 mL稀釋后的ABTS自由基溶液加入到0.9 mL不同濃度的樣液中，25 ℃水浴6 min，734 nm測(cè)定吸光度為Ai。相同條件下測(cè)定不同濃度的0.9 mL樣液溶液與2 mL 95%乙醇的吸光度值為Aj；2 mL ABTS+與0.9 mL蒸餾水的吸光度值為Ao。

ABTS自由基清除率（%）=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

式中：Ao為空白對(duì)照的吸光度值； Ai為樣液的吸光度值； Aj為本底的吸光度值。

1.2.7 DPPH自由基清除能力測(cè)定 DPPH可作為典型的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)[16]測(cè)定牡蠣多糖蘋(píng)果果醋對(duì)DPPH自由基清除能力。將不同濃度的2 mL樣液溶液與2 mL DPPH（0.2 mmol/L）溶液混合均勻，于室溫避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測(cè)定吸光度為Ai。相同條件下測(cè)定不同濃度的2 mL樣液溶液與2 mL 95%乙醇的吸光度值為Aj；2 mL DPPH·與2 mL蒸餾水的吸光度值為Ao。

DPPH自由基清除率（%）=（Ao-Ai+Aj）/Ao×100%

式中：Ao空白對(duì)照的吸光度值；Ai樣液的吸光度值；Aj本底的吸光度值。

1.2.8 還原力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[17]方法且略有改動(dòng)。取不同濃度的樣液0.5 mL，依次加入0.2 mol/L pH為6.6的磷酸緩沖液1.25 mL，1 g/100 mL的鐵氰化鉀溶液1.25 mL。充分混合均勻后，50 ℃恒溫水浴20 min，取出冷卻后，加入10 g/100 mL的三氯乙酸溶液1.25 mL，并于8 000 r/min的條件下離心10 min。移取1.25 mL上清液，加入1.25 mL蒸餾水及0.1 g/100 mL的三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻后于700 nm處測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)spss 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣多糖蘋(píng)果果醋制備

由圖1可知，隨著牡蠣多糖添加量的增加，得分先升高后下降，在0.2%～0.4%時(shí)得分較高，0.3%時(shí)得分達(dá)到最大值。因牡蠣多糖具有腥味，添加量過(guò)大時(shí)會(huì)使牡蠣多糖蘋(píng)果果醋口感不協(xié)調(diào)，而添加量過(guò)低會(huì)影響其生物活性，因此選擇添加量為0.2%～0.4%。

由圖2可知，酵母添加量為0.25%時(shí)得分最高為71.5。繼續(xù)增加酵母添加量后，得分不斷下降。原因是酵母本身具有特殊風(fēng)味，其添加量越大，對(duì)牡蠣多糖蘋(píng)果果醋口感及風(fēng)味影響越大。

由圖3可知，隨著檸檬酸添加量增加，得分下降，添加量為0.1%時(shí)得分最高。添加檸檬酸可掩蓋牡蠣多糖的腥味，起到調(diào)節(jié)口感的作用，但蘋(píng)果醋本身酸味較濃，檸檬酸添加量過(guò)高會(huì)使蘋(píng)果醋偏酸，讓人無(wú)法接受。

由圖4可知，蜂蜜添加量越大，得分越高，添加量為10%時(shí)，得分達(dá)到最大值。如果蜂蜜添加量繼續(xù)增大，就會(huì)使制得的果醋液體渾濁，嚴(yán)重影響其外觀及口感。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定牡蠣多糖添加量為0.2%、0.3%、0.4%；酵母及檸檬酸添加量為0.1%、0.25%、0.4%；蜂蜜添加量為6%、8%、10%，并以此設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

根據(jù)表3可知，影響牡蠣多糖蘋(píng)果果醋感官品質(zhì)的順序?yàn)锽>A>D>C，即酵母>牡蠣多糖>蜂蜜>檸檬酸。其極差分析得最優(yōu)組合為A2B1C1D3，即牡蠣多糖添加量為0.3%，酵母添加量為0.1%，檸檬酸添加量為0.1%，蜂蜜添加量為10%。

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得出了最優(yōu)組合并做了驗(yàn)證試驗(yàn)，此組合最終得分為86.6。因此確定牡蠣多糖蘋(píng)果果醋的最佳配方為多糖含量為0.3%、酵母0.1%、檸檬酸0.1%、蜂蜜10%。蔣楊等在研制近江牡蠣多糖口服液中采用活性炭濾紙脫腥法、酵母脫腥法和β-環(huán)糊精包埋法三種方法進(jìn)行脫腥。相比之下，酵母脫腥法具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉等特點(diǎn)[18]。本實(shí)驗(yàn)添加酵母去除牡蠣多糖的腥味，檸檬酸及蜂蜜可使果醋口感協(xié)調(diào)，因此制備的牡蠣多糖蘋(píng)果果醋口感清爽、風(fēng)味獨(dú)特、色澤金黃。

2.2 牡蠣多糖蘋(píng)果果醋理化指標(biāo)

牡蠣多糖蘋(píng)果果醋的理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表4。牡蠣多糖蘋(píng)果果醋的pH為2.69，糖度為9%，蘋(píng)果酸含量為560.5 mg/kg以及乳酸含量為17.79 mg/kg。有文獻(xiàn)報(bào)道果醋中總酸含量為4.6 g/kg、pH為3.0[19]，糖度為13.2%[20]。

2.2 牡蠣多糖蘋(píng)果果醋抗氧化活性

如圖5所示，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋與蘋(píng)果醋均具有較好的ABTS自由基清除能力且具有濃度依賴(lài)性。在濃度為0.51 mg/mL時(shí)，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋清除率為95.81%。本實(shí)驗(yàn)不再增加樣本濃度是因?yàn)樵?.51 mg/mL時(shí)，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋與蘋(píng)果醋的自由基清除率幾乎相同。

如圖6所示，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋展現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。隨濃度的增加，清除能力增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到1.65 mg/mL后，清除率緩慢增加，本實(shí)驗(yàn)樣本的最大濃度為1.95 mg/mL，此時(shí)清除率達(dá)到最大值為95.11%，均高于牡蠣多糖與蘋(píng)果醋。原因可能是牡蠣多糖蘋(píng)果果醋中一些其他具有生物活性的成分起到了協(xié)同增效的作用。

圖7為還原能力測(cè)定結(jié)果，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋的還原力與蘋(píng)果醋、牡蠣多糖相比較強(qiáng)，且具有濃度依賴(lài)性。還原能力可以作為潛在抗氧化性能的重要體現(xiàn)，還原能力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)制備出的牡蠣多糖蘋(píng)果果醋最佳配方為牡蠣多糖添加量為0.3%、酵母添加量為0.1%、檸檬酸添加量為0.1%及蜂蜜添加量為10%；制備出的牡蠣多糖蘋(píng)果果醋具有色澤金黃、果香濃郁、口感柔和飽滿(mǎn)、酸甜適中的特點(diǎn)。抗氧化活性研究表明，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋具有較強(qiáng)的抗氧化活性且高于牡蠣多糖及蘋(píng)果醋。因此，牡蠣多糖蘋(píng)果果醋不僅具有獨(dú)特的風(fēng)味，同時(shí)還具有較強(qiáng)的抗氧化活性，具有開(kāi)發(fā)價(jià)值。

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