陳玲玲++王洪云++楊發(fā)建++李銘

【摘要】目的：通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)齒瓣石斛多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。方法：采用苯酚-硫酸法考察提取容積、提取時(shí)間、提取次數(shù)、提取溫度等因素時(shí)多糖提取的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)找出最佳提取工藝。結(jié)果：多糖提取的最佳條件，提取溫度95℃、提取時(shí)間1h、提取次數(shù)2次、料液比1∶[KG-*3/5]25。結(jié)論：該工藝簡(jiǎn)單合理，多糖提取率高。

【關(guān)鍵詞】齒瓣石斛；多糖；提取工藝；正交實(shí)驗(yàn)

【中圖分類號(hào)】R917【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）01-0026-03

Research on the Crafts of Extracting Polysaccharide from Dendrobium

CHEN LinglingWANG HongyunYANG FajiangLI Ming*

Baoshan College of Traditionnal Chinese Medicine Department of TCM，Baoshan 678000，China

Abstract：Objective The author carried out optimization study of the crafts of extracting polysaccharide from dendrobium devonianum through orthogonal tests. Methods The author used phenol - sulfuric acid method to study the extraction volume， extraction period， extraction times， extraction temperature and other factors affect the polysaccharide extracted， and find the best extraction process by orthogonal test. Results The optimum conditions of polysaccharide extraction is that：temperature of 95℃， extraction time 1h， extraction times 2 times， solid-liquid ratio 1∶[KG-*3/5]25. Conclusion The process is simple，reasonable，with high rates of extraction of polysaccharide.

Keywords：Dendrobium Devonianum； Polysaccharide； Extraction Process； Orthogonal Experiment

[JP2]齒瓣石斛（Derdrobium devoninum Paxt.）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium） 亞熱帶附生型多年生草本植物，俗稱黃草。在云南共有石斛品種46種，保山市龍陵縣境內(nèi)就有40余種[1]，龍陵縣是最早實(shí)現(xiàn)齒瓣石斛產(chǎn)業(yè)化栽培的地區(qū)，占全國(guó)齒瓣石斛栽培面積的70%以上[2]。現(xiàn)代研究顯示，石解具有免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]及保肝護(hù)肝的功效，具有非常高的藥用價(jià)值，可用于多種疾病的防治。齒瓣石斛的主要有效物質(zhì)是石斛多糖，但目前對(duì)齒瓣石斛的多糖提取工藝研究較少，而水提法在石斛多糖提取的應(yīng)用非常廣泛，本文采用水提法[7]，并且通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)齒瓣石斛多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，為開發(fā)齒瓣石斛提供技術(shù)支撐，對(duì)云南保山龍陵齒瓣石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。

1儀器與材料

1.1儀器UV2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）；PL-203電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-250B超聲波清洗器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；TDZ5-WS湘式離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘式離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2材料無(wú)水葡萄糖（批號(hào)：20120417，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯酚（批號(hào)：20071228，天津市化學(xué)試劑三廠）；鹽酸氨基葡萄糖（批號(hào)：A308522，北京伊諾凱科技有限公司）；無(wú)水乙醇（批號(hào)：20111201，重慶川東化工集團(tuán)有限公司）。齒瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxt.） 鮮品，洗凈，60℃烘干，粉碎過(guò)60目篩，置干燥器中，備用。

2方法

2.1多糖的含量測(cè)定方法按2010版《中華人民共和國(guó)藥典》[8]一部鐵皮石斛多糖含量測(cè)定方法測(cè)定齒瓣石斛多糖含量。

2.1.1苯酚顯色溶液的配制取苯酚100g，加鋁粉0.1g和碳酸氫鈉0.05g，常壓蒸餾，收集182℃餾分。稱取該餾分5g，置100mL容量瓶中，加新鮮蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后，濾過(guò)至棕色試劑瓶中，得5%苯酚溶液（臨用配制）。

2.1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品12.35mg，置100mL容量瓶中加適量蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（每1mL含葡萄糖0.1235mg）。

2.1.3供試品溶液的制備取樣品粉末約0.3g，精密稱定，加水200mL，加熱回流2h，放冷，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液4mL，置15mL離心管中，精密加入無(wú)水乙醇10mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘4000轉(zhuǎn)）20min，棄去上清液（必要時(shí)濾過(guò)），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。測(cè)定方法：精密量取供試品溶液1.0mL，置于10mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自精密加入5%苯酚溶液1mL起，依法測(cè)定吸光度，按線性回歸方程計(jì)算多糖含量。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL至10mL具塞試管中，各以蒸餾水補(bǔ)至1.0mL，然后加入5%苯酚溶液1mL及5mL濃硫酸，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出后在自來(lái)水中迅速冷卻至室溫，然后以蒸餾水為空白，紫外分光光度法在488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，

2.3齒瓣石斛多糖提取的單因素考察

2.3.1提取溶劑水料液比對(duì)多糖含量的影響測(cè)定方法照供試品溶液制備項(xiàng)方法測(cè)定，固定其他因素，其中料液比為1∶[KG-*3/5]20 ，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置為4個(gè)水平，即分別為加水100、150、200、250mL試驗(yàn)。

2.3.2樣品提取時(shí)間測(cè)定方法照供試品溶液制備項(xiàng)方法測(cè)定，固定其他因素，其中加熱回流2h，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置為4個(gè)水平，即分別為加熱回流1、2、3、4h試驗(yàn)。

2.3.3提取次數(shù)測(cè)定方法照供試品溶液制備項(xiàng)方法測(cè)定，固定其他因素，其中加熱回流2h，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置為4個(gè)水平，即分別為加熱回流1次、2次、3次、4次試驗(yàn)。

2.3.4浸提提取溫度測(cè)定方法照供試品溶液制備項(xiàng)方法測(cè)定，固定其他因素，其中加熱浸提2h，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置為4個(gè)水平，即分別為加熱溫度70℃、80℃、90℃、95℃試驗(yàn)。

2.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為了優(yōu)化工藝，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比為實(shí)驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)L9（3）4正交試驗(yàn)。正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

3結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制紫外分光光度法在488nm的波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：Y = 0.0701X+0.0073，R=0.9998 （n=6）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

3.2多糖的含量測(cè)定結(jié)果由表3～6可知，用量水大，多糖的含量高；提取時(shí)間短多糖含量高；提取次數(shù)為2次多糖含量高；提取溫度越高多糖含量高。

3.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果齒瓣石斛提取正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果見(jiàn)表7。按照正交結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，齒瓣石斛多糖得率為 36.14%，RSD= 2.61%（n=3）。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定。

3.4多糖提取工藝優(yōu)化后的驗(yàn)證按照上述優(yōu)化條件，用20.5kg 新鮮齒瓣石斛進(jìn)行放大試驗(yàn)。鮮齒瓣石斛（20.5kg），曬干，得干品3.8kg，粉碎。料液比為1 ∶[KG-*2]25，加熱回流2次，每次回流1h，放冷，減壓濃縮至50L，加入4倍量無(wú)水乙醇，冷藏沉淀粗多糖，冷凍干燥得粗多糖1014.6g，即多糖含量為26.7%。

4討論

根據(jù)多糖性能，選用水煎煮工藝法，依據(jù)2010版藥典中供試品溶液制備方法，可發(fā)現(xiàn)多糖提取過(guò)程中有4個(gè)因素對(duì)多糖含量的影響較大，故而本次齒瓣石斛多糖提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)了4個(gè)因素4個(gè)水平的優(yōu)化試驗(yàn)。從單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著提取溶劑料液比的增大而增加，多糖提取率呈現(xiàn)出遞增的現(xiàn)象，在料液比1∶[KG-*3/5]25的時(shí)候多糖含量最高；提取時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)多糖提取率的影響則呈現(xiàn)遞減的現(xiàn)象，在2h以后，多糖含量呈遞減的現(xiàn)象；隨著提取次數(shù)的增加，多糖的含量增加，但提取次數(shù)大于2次以后，多糖的含量增加不明顯，可能原材料中的多糖接近全部溶出，說(shuō)明提取次數(shù)對(duì)于多糖的含量有影響；在不同溫度下提取多糖，70℃、80℃、90℃、95℃的條件下提取多糖，結(jié)果分別為28.3%、28.7%、29.5%、32.3%，隨著溫度的升高多糖的含量有所升高在100℃達(dá)到最高狀態(tài)。

由正交試驗(yàn)極差分析可知，提取溫度、提取次數(shù)、提取料液比及提取時(shí)間均對(duì)提取多糖的含量有顯著的影響，其因素主次順序?yàn)?A> C> D > B，即最重要的因素為提取溫度，其次是提取次數(shù)，再次是提取料液比，最后是提取時(shí)間。最佳組合為A3B1C2D3，可以確定齒瓣石斛多糖提取在料液比1∶[KG-*2]25，加熱回流1h，提取次數(shù)2次，提取溫度100℃條件下最優(yōu)。該工藝穩(wěn)定可行，可用于齒瓣石斛多糖的提取。齒瓣石斛為保山龍陵的珍貴藥物資源，對(duì)齒瓣石斛多糖提取工藝的優(yōu)化研究，有利于提高其利用率，為開發(fā)齒瓣石斛提供技術(shù)支撐。

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（編輯：穆麗華）