翟緒昭，曾海娟，王廣彬，董慶利，謝曼曼，丁承超，劉武康，王淑娟，李 杰，劉 箐,*

阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體的制備及其間接競(jìng)爭(zhēng)-ELISA檢測(cè)方法

翟緒昭1，曾海娟1，王廣彬2，董慶利1，謝曼曼1，丁承超1，劉武康1，王淑娟1，李 杰1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.徐州綠健乳品飲料有限公 司，江蘇 徐州 221006）

以阪崎克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29004免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，經(jīng)過(guò)兩次細(xì)胞融合共制備出7 株分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株（1E9、2A7、2D10、3E5、5B10、6E3、12A2）。其中2A7、2D10、3E5、12A2的效價(jià)達(dá)到了1∶256 000，6E3的效價(jià)為1∶128 000，5B10的效價(jià)為1∶64 000，1E9的效價(jià)為1∶32 000。亞型鑒定結(jié)果顯示1E9的亞型為IgG1，6E3的亞型為IgG2b，其余抗體2A7、2D10、3E5、5B10、12A2的亞型均為IgG2a。對(duì)7 株抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)結(jié)果顯示，2A7能與3 株阪崎克羅諾桿菌（ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868）都結(jié)合，1E9能與其中兩株（ATCC 29004、ATCC 12868）結(jié)合，且與其他11 株類似菌和常見(jiàn)致病菌交叉反應(yīng)結(jié)果顯示7 個(gè)抗體均有良好的特異性。用2A7建立的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法對(duì)阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到106CFU/mL。

阪崎克羅諾桿菌；單克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

阪崎克羅諾桿菌原名阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii，Cs），是一種革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，兼性厭氧，通過(guò)周生鞭毛運(yùn)動(dòng)，是腸道正常菌群的一種，屬于條件致病菌，嬰幼兒特別是低出生體質(zhì)量的早產(chǎn)兒（出生體質(zhì)量低于2 500 g）以及免疫缺陷的成年人和老人是其易感人群[1]。Cs感染的臨床癥狀包括壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥、腦膜炎等，致死率高達(dá)40%～80%，并且一些幸存者可能遭受?chē)?yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[2-3]。Cs感染事件爆發(fā)的污染源主要包括嬰幼兒配方奶粉、動(dòng)植物來(lái)源的原材料以及生鮮、冷凍食品等[4-5]。

目前，Cs的檢測(cè)主要依靠傳統(tǒng)的生化檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)。現(xiàn)今通用的ISO-TS 22964-2006檢測(cè)方法得到檢測(cè)結(jié)果需要5～7 d[6]。法國(guó)梅里埃公司的API 20E、ID 32E等自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)由于數(shù)據(jù)庫(kù)的限制也被證明檢測(cè)結(jié)果不夠準(zhǔn)確[7]。實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[8-9]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10]、熒光原位雜交[11]、變性高效液相色譜[12]等方法雖然特異性和靈敏度較好，但存在操作復(fù)雜，對(duì)操作人員技術(shù)要求較高，設(shè)備昂貴等問(wèn)題，不易于推廣應(yīng)用。

免疫分析技術(shù)主要是利用抗體能夠與相應(yīng)抗原及半抗原發(fā)生自發(fā)、高選擇性的特異性結(jié)合這一性質(zhì)，通過(guò)將特定抗體（或抗原）作為選擇性試劑來(lái)對(duì)相應(yīng)待測(cè)抗原（或抗體）進(jìn)行分析測(cè)定的方法，具有分析時(shí)間短、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)[13-14]。用于Cs檢測(cè)的免疫學(xué)方法主要包括酶聯(lián)免疫[15]、膠體金試紙條[16]、免疫磁珠[17]等，這些方法的靈敏度和特異性依賴于所使用抗體的性能?；诟咝阅軉慰寺】贵w的免疫分析技術(shù)為快速準(zhǔn)確檢測(cè)Cs提供了可能。本實(shí)驗(yàn)擬制備親和力高，特異性好的抗Cs單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一種間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定法用于Cs的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種

Cs標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868）、產(chǎn)氣腸桿菌（ATCC 13048）、甲型副傷寒沙門(mén)菌（CMCC（B）50093）、乙型副傷寒沙門(mén)菌（CMCC（B）50094）、肺炎克雷伯菌（CMCC（B）46117）、蠟樣芽孢桿菌（CMCC（B）63303）、副溶血性弧菌（ATCC 17802）、鮑氏志賀菌（ATCC 9207）、宋氏志賀菌（ATCC 25931）、腸出血性大腸埃希菌O157:H7（ATCC 43895）、單核細(xì)胞性李斯特菌（ATCC 19114）、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（ATCC 23715）為上海理工大學(xué)有害微生物危害與控制研究所保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0為上海理工大學(xué)有害微生物危害與控制研究所保存；6～8 周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.3 試劑

液體石蠟、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、HAT（50×）培養(yǎng)基、HT（50×）培養(yǎng)基、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體 美國(guó)Sigma公司；Taq DNA聚合酶及其他PCR試劑 上海生工生物工程有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清 上海Biosun公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、青鏈霉素混合液（雙抗） 美國(guó)Hyclone公司；單克隆抗體亞類鑒定二抗 洛陽(yáng)佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；Protein G親和層析柱 美國(guó)GE Healthcare公司；25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞凍存管、酶標(biāo)板 無(wú)錫耐思生物科技有限公司；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板美國(guó)Costar公司；其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；凝膠成像儀英國(guó)Syngene公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；Mini-power電泳儀、蛋白純化儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原準(zhǔn)備

將3 株Cs復(fù)蘇劃平板，挑選典型單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定引物由生工生物工程股份有限公司合成，其核苷酸序列為WFB1：GGG TTG TCT GCG AAA GCG AA；WFB2：GTC TTC GTG CTG CGA GTT TG。確定菌株的準(zhǔn)確性后將細(xì)菌養(yǎng)至飽和，測(cè)定3 株菌的飽和菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD值，選取OD值最高的一株菌用0.3%甲醛溶液進(jìn)行滅活處理，滅活后將細(xì)菌用PBS洗滌3 次，調(diào)整菌液濃度至OD600nm為0.6。

1.2.2 小鼠免疫

選用6 只狀態(tài)良好的6～8 周齡雌性BALB/c小鼠用制備好的菌液進(jìn)行全菌免疫，采用腹腔注射的方式，按免疫劑量分為3 組，每組2 只，免疫劑量分別為0.2、0.3、0.4 mL。初次免疫過(guò)后分別于第14天、第28天、第42天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，第4次免疫過(guò)后第7天進(jìn)行斷尾取血，收集小鼠血清，將小鼠血清分別倍比稀釋400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200 倍用間接ELISA方法進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定，以實(shí)驗(yàn)組OD450nm/陰性對(duì)照組OD450nm大于等于2.1判定為陽(yáng)性，以結(jié)果為陽(yáng)性的最大稀釋倍數(shù)為小鼠血清效價(jià)。選取效價(jià)最高的一組小鼠分別于融合前72 h進(jìn)行沖擊免疫，免疫劑量適當(dāng)增加。

1.2.3 細(xì)胞融合及篩選

融合前30 d進(jìn)行小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的復(fù)壯篩選。融合前1 d，取正常BALB/c小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞為飼養(yǎng)層細(xì)胞。將超免3 d后的小鼠脊椎脫臼致死后摘取脾臟，沖洗研磨出脾細(xì)胞，將SP2/0和脾細(xì)胞按1∶5的比例用50%的PEG作為融合劑進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后按1×105個(gè)/孔鋪于已鋪飼養(yǎng)層細(xì)胞的96 孔板中，放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用含HAT的培養(yǎng)基進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選，待細(xì)胞鋪滿50%孔底的時(shí)候，用間接ELASA法對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，選取陽(yáng)性孔用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。亞克隆過(guò)程中改用HT培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，共進(jìn)行兩次以上亞克隆，每次克隆的陽(yáng)性孔細(xì)胞都擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2.4 單克隆抗體腹水的制備

采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法[18]，選用狀態(tài)良好8 周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟。7 d后，將擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞用生理鹽水重懸后，按106個(gè)/只腹腔注射小鼠，待小鼠腹部明顯膨大后，收集腹水，4 000 r/min離心5 min，取上清液。腹水用飽和硫酸銨法粗提后，用Protien G柱親和層析進(jìn)行純化，純化后的抗體用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）進(jìn)行純度分析。

1.2.5 抗體亞型測(cè)定

采用間接ELISA方法，按照抗體亞型（IgA、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b、IgG 3、IgM）測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗體亞型的測(cè)定。

1.2.6 抗體效價(jià)測(cè)定

將純化后的抗體倍比稀釋1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、256 000 倍用間接ELISA法進(jìn)行抗體效價(jià)的測(cè)定，結(jié)果以陽(yáng)性的最大稀釋倍數(shù)為抗體的效價(jià)。

1.2.7 抗體特異性測(cè)定

采用間接ELISA方法，測(cè)定抗體與3 株Cs（ATCC 29004、ATCC 29213、ATCC 29544）以及產(chǎn)氣腸桿菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、副溶血性弧菌、鮑氏志賀菌、宋氏志賀菌、腸出血性大腸埃希菌O157:H7、單核細(xì)胞性李斯特菌等共14 株菌是否有交叉反應(yīng)。

1.2.8 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的過(guò)程為飽和Cs 100 μL/孔包被96 孔板，37 ℃孵育2 h，用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）洗3 次，然后用3%脫脂奶粉封閉1 h，將待測(cè)樣品與一抗混合，37 ℃孵育1 h，PBST洗3 次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，孵育1 h后用PBST洗3 次，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液顯色15 min，加入終止液后測(cè)定OD450nm值。選用兩塊96 孔板A、B進(jìn)行包被，A板為實(shí)驗(yàn)組，B板為對(duì)照組，以實(shí)驗(yàn)組OD450nm值/對(duì)照組OD450nm值為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的菌濃度為IC50值。本實(shí)驗(yàn)選用對(duì)照組OD450nm值為1.0時(shí)一抗的稀釋倍數(shù)為一抗的工作濃度，因而結(jié)果判定以O(shè)D450nm值低于0.5時(shí)判定為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原鑒定

選用Cs標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868）復(fù)蘇劃平板，挑選典型單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果如圖1所示，3 株Cs標(biāo)準(zhǔn)菌株均在282 bp處出現(xiàn)明顯電泳條帶，與Cs特異性基因條帶大小一致，說(shuō)明3 株菌株均為Cs。

圖1 克羅諾菌株P(guān)CR鑒定Fig. 1 PCR identifi cation of Cronobater sakazakii

2.2 小鼠血清效價(jià)

表1 小鼠血清效價(jià)（OD450 nm）Table 1 Serum antibody titers of mice (OD450 nm)

第4次免疫后，小鼠血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果如表1所示，陰性對(duì)照OD450nm為0.070 35，1～6號(hào)小鼠的血清效價(jià)分別為1∶51 200、1∶51 200、1∶25 600、1∶25 600、1∶25 600、1∶25 600，免疫劑量為0.2 mL的一組小鼠血清效價(jià)最高，因而選用該組小鼠進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞融合。

2.3 單克隆抗體純化效果分析

如圖2所示，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和Protien G柱親和層析后，7 個(gè)抗體SDS-PAGE圖均在25 kD左右出現(xiàn)一條輕鏈，在50～60 kD左右出現(xiàn)一條重鏈，且無(wú)明顯雜帶，這表明7 個(gè)抗體純化效果較好，純化后的抗體純度較高。

Fig. 2 SDS-PAGE patterns of monocolonal antibodies from serum of mice

2.4 抗體亞型鑒定結(jié)果

表2 抗體亞型測(cè)定結(jié)果（OD450 nm）Table 2 Identifi cation of antibody subtypes (OD450 nm)

7 個(gè)抗體亞型鑒定結(jié)果如表2所示，1E9的亞型為IgG1，6E3的亞型為IgG2b，其余5 個(gè)抗體2A7、2D10、3E5、5B10、12A2的亞型均為IgG2a。

2.5 抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，7 個(gè)抗體中2A7、2D10、3E5、12A2的效價(jià)達(dá)到了1∶256 000，6E3的效價(jià)為1∶128 000，5B10的效價(jià)為1∶64 000，1E9的效價(jià)為1∶32 000。

2.6 抗體特異性測(cè)定結(jié)果

7 個(gè)抗體分別與3 株Cs以及產(chǎn)氣腸桿菌、腸出血性大腸埃希菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌等11 株菌交叉反應(yīng)的結(jié)果如表3所示，其中2A7能夠和3 株Cs都交叉，1E9能夠和Cs ATCC 29004以及Cs ATCC 12868兩株克羅諾桿菌結(jié)合，且7 個(gè)抗體均有較好的特異性。鑒于2A7能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)3 株Cs的全檢，因而選用2A7進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立。

表3 抗體的特異性分析Table 3 Specifi city of antibodies

2.7 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

采用2A7進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立，當(dāng)抗體稀釋倍數(shù)為16 000時(shí)，OD450nm值為1.0，因而選用1∶16 000為一抗的工作濃度，即抗體用量為12.5 ng。靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，可知對(duì)Cs的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到106CFU/mL。

圖4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的檢測(cè)限分析Fig. 4 Detection limit of indirect-competitive ELISA

3 討 論

克羅諾桿菌是污染嬰幼兒配方奶粉的主要致病菌，是一種較低致病劑量的致病菌，關(guān)于克羅諾桿菌的檢測(cè)一直是全世界研究的熱點(diǎn)[19-20]。免疫學(xué)檢測(cè)方法是檢測(cè)致病菌的一種快速、有效的方法，主要包括酶聯(lián)免疫技術(shù)、量子點(diǎn)熒光免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、熒光偏振免疫技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)等。由于免疫分析技術(shù)是以抗原抗體的特異性結(jié)合為 基礎(chǔ)的，因而制備性能良好的抗體是免疫分析技術(shù)應(yīng)用于克羅諾桿菌檢測(cè)的關(guān)鍵。除了傳統(tǒng)的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)外，近年來(lái)出現(xiàn)了多種新的單克隆抗體制備技術(shù)，如嵌合單克隆抗體技術(shù)[21]、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)[22-23]、噬菌體展示技術(shù)[24-25]、核糖體展示技術(shù)[26]、共價(jià)展示技術(shù)[27]等，但由于這些技術(shù)尚未發(fā)展成熟，并且傳統(tǒng)的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)具有易于操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因而本實(shí)驗(yàn)仍然選用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)。

關(guān)于克羅諾桿菌抗體的制備之前已有研究，周鶴峰[28]和汪琳[29]等由于實(shí)驗(yàn)中篩選所用抗原為單株抗原，所得到的抗體并沒(méi)有檢測(cè)能否實(shí)現(xiàn)多株抗原覆蓋。Ishikawa等[30]在制備多抗的過(guò)程中，以ATCC 29544免疫新西蘭白兔，檢測(cè)所得抗體與ATCC 29544和其他12 株分離菌株的交叉反應(yīng)性，結(jié)果抗體只與免疫菌株和另外1 株分離菌株結(jié)合。袁成剛等[31]嘗試用混合免疫的方法進(jìn)行克羅諾桿菌單克隆抗體的制備，結(jié)果所得抗體雖然與多株克羅諾桿菌結(jié)合，但也與其他所有陰性菌株有交叉反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)OD600nm比較3 株Cs的生長(zhǎng)快慢，選取生長(zhǎng)狀態(tài)最好的一株菌株免疫小鼠。然后通過(guò)不同的免疫劑量?jī)?yōu)化免疫條件，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)免疫劑量為0.2 mL的一組小鼠反而血清效價(jià)最高，這可能是由于過(guò)高的免疫劑量會(huì)影響小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)甚至導(dǎo)致小鼠死亡。經(jīng)過(guò)兩次細(xì)胞融合之后進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞篩選，腹水制備，抗體純化共獲得7 個(gè)Cs單克隆抗體，其中2A7能夠和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的3 株Cs全交叉，1E9能夠與其中兩株菌交叉。并且除了2A7與乙型副傷寒沙門(mén)菌（CMCC（B）50094）有微弱交叉外，7 個(gè)抗體與其他相似菌和常見(jiàn)致病菌都沒(méi)有交叉反應(yīng)，這對(duì)于免疫分析技術(shù)應(yīng)用于克羅諾桿菌的檢測(cè)意義重大。實(shí)驗(yàn)最后還建立了一種間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法用于Cs的快速檢測(cè)，其檢測(cè)限可達(dá)到106CFU/mL。

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Preparation of Monoclonal Antibodies against Cronobacter sakazakii and Development of an Indirect Competitive ELISA for Detection of This Bacterium

ZHAI Xuzhao1, ZENG Haijuan1, WANG Guangbin2, DONG Qingli1, XIE Manman1, DING Chengchao1,LIU Wukang1, WANG Shujuan1, LI Jie1, LIU Qing1,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Sc ience and Technology, Shanghai 200093, China;2. Xuzhou Lüjian-Dairy Beverage Co. Ltd., Xuzhou 221006, Chi na)

BALB/c mice were immunized with Cronobacter sakazakii type strain ATCC 29004. Seven strains (1E9, 2A7,2D10, 3E5, 5B10, 6E3, and 12A2) of hybridoma cell lines that secreted monoclonal antibodies were prepared by two cycles of cell fusion using hybridoma technique. The titers of 2A7, 2D10, 3E5 and 12A2 reached 1∶256 000, the titer of 6E3 was 1∶128 000, the titer of 5B10 was 1∶64 000 and the titer of 1E9 was 1∶32 000. The results of subtype identifi cation showed that the subtype of 1E9 was IgG1, the subtype of 6E3 was IgG2b, and the subtypes of the other antibodies 2A7, 2D10, 3E5,5B10 and 12A2 were all IgG2a. 2A7 could specifi cally bind to 3 strains of Cronobacter sakazakii (ATCC 29004, ATCC 29544, and ATCC 12868), and 1E9 could specifi cally bind to two of them (ATCC 29004 and ATCC 12868). The results of crossreaction with 11 other similar pathogens showed that 7 antibodies had good specifi city. The sensitivity of indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using 2A7 reached 106CFU/mL for the detection of Cronobacter sakazakii.

Cronobacter sakazakii; monoclonal antibodies; indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

TS207.4

A

1002-6630（2017）20-0268-05

翟緒昭, 曾海娟, 王廣彬, 等. 阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體的制備及其間接競(jìng)爭(zhēng)-ELISA檢測(cè)方法[J]. 食品科學(xué), 2017,38(20): 268-272. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720039. http∶//www.spkx.net.cn

ZHAI Xuzhao, ZENG Haijuan, WANG Guangbin, et al. Preparation of monoclonal antibodies against Cronobacter sakazakii and development of an indirect competitive elisa for detection of this bacterium[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 268-272. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720039. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-03

上海市科委“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”長(zhǎng)三角科技聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項(xiàng)目（15395810900）；

徐州綠健乳品飲料有限公司“乳制品生產(chǎn)體系致病菌快速檢測(cè)”項(xiàng)目（3A15308006）

翟緒昭（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【目焖贆z測(cè)。E-mail：huzhxzh@126.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭吃葱灾虏【虏C(jī)理、疫苗及快速檢測(cè)技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720039