魏蓮花，鄒鳳梅，劉剛，楊永清，王晚霞，吳玲，李軍春，王欣，陳玉芊，陳曉青，李可可，邵海鑫，朱吉超

(1.甘肅省人民醫(yī)院檢驗科，甘肅省臨床檢驗中心，蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004)

·質(zhì)量管理研究·

臨床微生物形態(tài)學(xué)及特殊耐藥性檢測室間質(zhì)量評價體系的建立及應(yīng)用

魏蓮花1，鄒鳳梅1，劉剛1，楊永清1，王晚霞1，吳玲1，李軍春1，王欣1，陳玉芊1，陳曉青2，李可可2，邵海鑫2，朱吉超3

(1.甘肅省人民醫(yī)院檢驗科，甘肅省臨床檢驗中心，蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004)

目的 研究臨床微生物形態(tài)學(xué)及特殊耐藥性檢測室間質(zhì)量評價(external quality assessment, EQA)體系的建立、運行與實施，探討該體系的臨床應(yīng)用價值。方法 每年2次定期在甘肅省對各參評實驗室發(fā)放已知的臨床微生物細(xì)(真)菌落、革蘭染色、抗酸染色圖片，以及美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)更新的知識點(特殊耐藥性檢測)結(jié)果圖片。要求各參評單位在規(guī)定時間內(nèi)完成判讀并上報結(jié)果?；貓蠼Y(jié)果以完全符合、基本符合和不符合的形式進行總結(jié)、分析。結(jié)果 臨床微生物形態(tài)學(xué)及特殊耐藥性檢測EQA體系運行2年，共進行24次，年度完全符合率逐年上升，2015年達(dá)到91.3%。結(jié)論 臨床微生物形態(tài)學(xué)及CLSI標(biāo)準(zhǔn)知識點考核EQA體系可督導(dǎo)二級以上醫(yī)院臨床微生物檢驗人員掌握形態(tài)學(xué)識別技能及學(xué)習(xí)CLSI知識點，全面提高臨床微生物人員專業(yè)技能。

微生物形態(tài)學(xué)；CLSI；特殊耐藥；室間質(zhì)量評價

近年來，隨著自動化細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀、質(zhì)譜技術(shù)等快速檢測技術(shù)在臨床微生物實驗室的廣泛應(yīng)用，部分檢驗人員過分依賴自動化儀器的現(xiàn)象較為嚴(yán)重，以致自動化儀器鑒定錯誤時不能結(jié)合微生物形態(tài)學(xué)等傳統(tǒng)手段加以綜合分析。微生物形態(tài)學(xué)檢測或傳統(tǒng)鑒定方法應(yīng)用已普遍成為當(dāng)前國內(nèi)臨床微生物檢驗人員的薄弱環(huán)節(jié)。而細(xì)(真)菌菌落形態(tài)、鏡下形態(tài)是準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌、真菌的重要手段之一。美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)制定的藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)是我國微生物實驗室遵循的指導(dǎo)性文件[1]，加上CLSI每年有更新，其中也涉及特殊耐藥性檢測的方法。很多臨床微生物檢驗人員對此主動學(xué)習(xí)不夠，致使缺乏相關(guān)知識和基本檢測技能?；诖?，2014年，我們在全國率先開始探索臨床微生物形態(tài)學(xué)、細(xì)菌特殊耐藥檢測室間質(zhì)量評價(external quality assessment,EQA)體系，并在全省范圍內(nèi)應(yīng)用。本研究通過對近2年EQA結(jié)果的分析，探討其臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 細(xì)(真)菌菌落圖片及鏡下形態(tài)圖片制作 收集質(zhì)控菌株、臨床標(biāo)本中分離的典型菌株。細(xì)菌按照標(biāo)準(zhǔn)劃線方法接種于血平板上，35 ℃溫育18 h；絲狀真菌接種于沙氏平板，25 ℃溫育48 h。用高像素相機拍攝菌落形態(tài)圖片；根據(jù)考核要求，按照常規(guī)方法涂片、革蘭染色、抗酸染色，油鏡下拍攝鏡下形態(tài)圖片。部分圖片見圖1-4。

圖1 黏液型銅綠假單胞菌革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

圖2 “鬼影細(xì)胞”革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

圖3 曲霉乳酸酚棉藍(lán)染色鏡下形態(tài)(×1 000)

圖4 諾卡菌革蘭染色鏡下形態(tài)(×1 000)

1.2 特殊耐藥檢測考核圖片制作 根據(jù)CLSI[2]要求進行特殊耐藥性檢測(如：ESBLs檢測、MRSA檢測、耐青霉素的交叉耐藥性檢測和協(xié)同試驗等)并拍照制成圖片。

1.3 EQA方法 根據(jù)已知的細(xì)菌、真菌菌落形態(tài)及細(xì)菌特殊耐藥現(xiàn)象檢測進行定靶。甘肅省臨床檢驗中心對全省130家二級以上醫(yī)院檢驗科，2014和2015年每年統(tǒng)一發(fā)放2次，每次發(fā)放6張圖片，共計24張圖片，分別按照年份加序號編號：2014年為201401-201412，2015年為201501-201512，并同時對患者主要癥狀、體征或臨床診斷等做簡明闡述。要求參評單位在規(guī)定時間內(nèi)回報結(jié)果，結(jié)果回報方式為選擇題或自主回答2種方式，如判斷特殊耐藥試驗的陰陽性，根據(jù)菌落形態(tài)或涂片染色鏡檢形態(tài)報告疑似菌名。檢驗中心收到回報結(jié)果后按照評價標(biāo)準(zhǔn)，將質(zhì)評結(jié)果、正確結(jié)果、誤差原因分析、有關(guān)新資料等信息及時反饋給參評實驗室。

2 結(jié)果

2.1 回報率 2次EQA共24張圖片，2014年參評單位119家，2次回報率均為68.07%(81/119);2015年參評單位103家，2次回報率分別為65.05%(67/103)和77.67%(80/103)?？偦貓舐视?014年的68.07%提高到2015年的71.36%。

2.2 考核結(jié)果符合率

2.2.1 菌落及顯微鏡下形態(tài)學(xué) 2014年臨床微生物菌落形態(tài)EQA考核內(nèi)容為衛(wèi)星試驗和馬爾尼菲藍(lán)狀菌，完全符合率分別為98.77%和61.73%；2015年的考核內(nèi)容為變形桿菌的遷徙現(xiàn)象，完全符合率為91.04%。2014年鏡下形態(tài)考核內(nèi)容有銅綠假單胞菌“臘腸樣”、抗酸染色陽性、淋球菌、“鬼影”細(xì)胞、絲狀真菌及奴卡菌等圖片，完全符合率分別為71.60%、97.53%、98.77%、66.67%、80.25%及98.77%。見表1。

表1 2014至2015年臨床微生物菌落及鏡下菌體形態(tài)室間質(zhì)評結(jié)果

2.2.2 細(xì)菌特殊耐藥現(xiàn)象 2014年細(xì)菌特殊耐藥現(xiàn)象考核內(nèi)容有D-試驗、ESBLs篩查試驗、β-內(nèi)酰胺酶試驗及肺炎鏈球菌青霉素E-試驗，完全符合率分別為96.30%、82.72%、92.59%及51.85%。2015年考核內(nèi)容有替加環(huán)素E-試驗、改良Hodge試驗結(jié)果判斷、MRSA篩選、Carba NP試驗、D-試驗、ESBLs篩查試驗及耐青霉素肺炎鏈球菌(PRSP)篩查，完全符合率分別為75.00%、98.51%、71.25%、92.50%、100%、97.50%及47.50%。見表2。

表2 2014至2015年臨床微生物特殊耐藥檢測方法圖片室間質(zhì)評結(jié)果回報

3 討論

甘肅省臨床檢驗中心自2014年開始在以往傳統(tǒng)的EQA項目的基礎(chǔ)上，結(jié)合省內(nèi)臨床技術(shù)人員的現(xiàn)狀，對臨床微生物室間質(zhì)評的調(diào)查內(nèi)容進行創(chuàng)新改革，增設(shè)細(xì)(真)菌形態(tài)學(xué)及特殊耐藥現(xiàn)象判斷的考核。通過將相關(guān)內(nèi)容制作成圖片，在省檢驗中心網(wǎng)站上統(tǒng)一發(fā)布，要求參評單位認(rèn)真參照圖片，按照要求回答考核點并及時回復(fù)結(jié)果。菌落質(zhì)評圖以細(xì)(真)菌常見典型菌落或特殊菌落為主；顯微鏡下形態(tài)以典型形態(tài)和特殊形態(tài)為主；細(xì)菌特殊耐藥考核涉及多方面，包括E-試驗判讀、特殊耐藥性檢測(ESBLs、AmpC、Hodge試驗、β-內(nèi)酰胺酶檢測及判斷等。發(fā)放范圍包括二級以上參評實驗室，以自愿參加為原則，質(zhì)評結(jié)果以“完全符合、部分符合及不符合”進行評價。每年固定進行2次，考核的內(nèi)容逐漸擴大，但保證每年有CLSI的最新更新內(nèi)容。

特殊試驗及菌落形態(tài)考核，我們設(shè)計了3個圖片：衛(wèi)星試驗是鑒定嗜血桿菌屬中流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌的關(guān)鍵試驗，第一次調(diào)查時衛(wèi)星試驗圖片參評實驗室合格率較高，達(dá)98.77%，說明各單位對判該實試驗的判斷要領(lǐng)已基本掌握。馬爾尼菲藍(lán)狀菌是引起艾滋病患者感染的真菌，為了讓參評實驗室認(rèn)識該真菌在沙氏瓊脂平板上培養(yǎng)2周左右呈玫瑰紅色菌落[3]，我們在2014年EQA活動中發(fā)放了1張該菌菌落形態(tài)圖片，完全符合率僅為61.73%，這也從一個側(cè)面反映出微生物實驗室在日常工作中對該菌存在漏檢或錯誤鑒定的問題。提示質(zhì)評組織者今后還需反復(fù)發(fā)放該菌菌落圖片，以強化檢驗人員真正認(rèn)識該菌。變形桿菌遷徙現(xiàn)象較常見，第一次發(fā)放完全符合率達(dá)到91.04%，提示組織者對一些基本理論及基本現(xiàn)象可以通過這種形式督導(dǎo)檢驗人員學(xué)習(xí)掌握。

顯微鏡下形態(tài)學(xué)考核圖片較多，包括黏液型銅綠假單胞菌“臘腸樣”、抗酸染色陽性、淋球菌、“鬼影”細(xì)胞、絲狀真菌、諾卡菌、曲霉、淋球菌、念珠菌、靈芝孢子等，其中，黏液型銅綠假單胞菌“臘腸樣”鏡下判斷符合率僅為71.60%。說明有一部分檢驗人員對此形態(tài)學(xué)并不認(rèn)識。

抗酸桿菌在革蘭染色時不易著色，有經(jīng)驗者在顯微鏡下可觀察到白色的條狀影子，稱之為“鬼影”細(xì)胞[4]，提示操作者可再進行抗酸染色以驗證，無經(jīng)驗者因不認(rèn)識這種形態(tài)就容易漏檢?！肮碛啊奔?xì)胞圖片第一次調(diào)查完全符合率僅有66.67%，今后還將繼續(xù)發(fā)放?；颊呖诜`芝孢子后留取痰液標(biāo)本時易受此污染，不熟悉或不認(rèn)識此形態(tài)者易將此判為寄生蟲卵，第一次調(diào)查時完全符合率僅為72.50%。其他圖片如抗酸染色、革蘭陰性雙球菌(疑似淋球菌)、絲狀真菌、奴卡菌、曲霉、念珠菌等有比較好的符合率。

特殊耐藥性檢測考核中設(shè)計了11項考核點，圍繞CLSI M100-S24、S25中規(guī)定的檢測方法進行。CLSI規(guī)定當(dāng)肺炎鏈球菌對青霉素抑菌環(huán)直徑小于19 mm時，必須用E-test或其他方法檢測該菌的最低抑菌濃度(MIC)，以確認(rèn)是否真正耐青霉素肺炎鏈球菌菌株。2014年第一次發(fā)放E-試驗結(jié)果判讀調(diào)查圖片，要求準(zhǔn)確判讀E-試驗結(jié)果，但由于很多實驗室日常工作中對CLSI M100-S24、S25中涉及到的檢測方法領(lǐng)會不深，甚至在工作中并未按照CLSI指南進行常規(guī)工作，因此，在結(jié)果判讀上出現(xiàn)很多錯誤，完全符合率僅為51.85%；2015年，進行第二次調(diào)查，要求通過圖片判斷是否“PRSP”，結(jié)果完全符合率甚至比第一次還低，僅僅為47.50%。說明參評實驗室對CLSI M100-S24、S25知識點的掌握還不夠牢固。相反，在室間質(zhì)評中也發(fā)現(xiàn)檢驗人員對CLSIM100-S24、S25上的一些簡單知識點掌握較好，如金黃色葡萄球菌D-試驗，第一次考核時完全符合率達(dá)到96.30%，第二次考核完全符合率為100%。

我們從2014年開始，通過設(shè)置一系列新的考核點，逐步建立、完善并實施微生物形態(tài)學(xué)EQA體系，對錯誤結(jié)果進行反饋分析并發(fā)放相關(guān)新資料，這種新形式的臨床微生物EQA體系的建立及實施使我省大部分實驗室開始重視形態(tài)學(xué)技能及CLSI知識點的學(xué)習(xí)。有的圖片如D-試驗，通過反復(fù)發(fā)放，完全符合率明顯提高，說明臨床微生物形態(tài)學(xué)及CLSI中規(guī)定的特殊耐藥檢測室間質(zhì)量評價體系的建立及應(yīng)用是提高細(xì)(真)菌檢驗及督促學(xué)習(xí)CLSI M100進而提高藥敏試驗水平的重要手段之一。另一方面，本研究中的部分結(jié)果，如淋球菌、馬爾尼菲藍(lán)狀菌等僅根據(jù)染色形態(tài)難以準(zhǔn)確鑒定到種，回報單位僅僅是報告疑似結(jié)果，不要求報告鑒定結(jié)果，這在一定程度上影響了回報結(jié)果的完全符合率，也是我們下一步需要著重解決的問題之一。

致謝：衛(wèi)生部北京醫(yī)院檢驗科微生物室陳東科老師提供部分圖片，特此致謝！

[1]張雅薇，王輝. 2016年CLSI M100S(第26版)主要更新內(nèi)容解讀[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，39(3)：165-169.

[2]Clinical and Laboratory Standards Institute. M100S. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-sixth edition[S].Wayne,PA:CLSI,2016.

[3]陳東科, 孫長貴. 實用臨床微生物學(xué)檢驗與圖譜[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社, 2011.

[4]Trifiro S, Bourgault AM, Lebel F,etal. Ghost mycobacteria on Gram stain[J]. J Clin Microbiol, 1990, 28(1):146-147.

(本文編輯：劉群)

Establishment and application of external quality assessment system for microbial morphology and detection of special drug-resistance in clinical laboratory

WEILian-hua1,ZOUFeng-mei1,LIUGang1,YANGYong-qing1,WANGWan-xia1,WULing1,LIJun-chun1,WANGXin1,CHENYu-qian1,CHENXiao-qing2,LIKe-ke2,SHAOHai-xing2,ZHUJi-chao3

( 1.DepartmentofClinicalLaboratory,GansuProvincialCenterforClinicalLaboratory,GansuProvincialHospital,Lanzhou730000,Gansu; 2.GansuUniversityofChineseMedicine,Lanzhou730000,Gansu; 3.SchoolofClinicalMedicine,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,Ningxia,China)

Objective To investigate the establishment, operation and performance of external quality assessment(EQA) system for microbial morphology and detection of special drug-resistance in clinical laboratory, and explore the value of the developed system in clinical application. Methods The pictures of known bacteria and fungi colony, gram staining and acid-fast staining from clinical microbiology were distributed to the participating laboratories in Gansu province twice a year at regular intervals. The pictures of standard knowledge points from CLSI, such as special drug resistance were distributed simultaneously. All the participating laboratories were required to complete the interpretation for the pictures and report their results in a scheduled time. Then the results were summarized and analyzed as 3 modes: complete consistency, general consistency and non-consistency. Results During the 2 years when the EQA system for microbial morphology and detection of special drug-resistance were performed for 24 times, the rate of annual complete consistency increased year by year and reached to 91.3% in 2015. Conclusion The EQA system based on the examinations of microbial morphology and CLSI standard knowledge points for clinical laboratory may supervise the staff of clinical microbiology laboratories in the hospitals at second grade or above to master the skills of morphological identification and learn CLSI knowledge points, so their professional skills of clinical microbiology could be comprehensively improved.

microbial morphology; CLSI; special drug-resistance; external quality assessment

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.16

魏蓮花，1965年生，女，主任技師，博士，從事臨床微生物檢驗及臨床微生物室間質(zhì)量評價管理工作。

R446.5

A

2017-03-02)