于宏偉，何京，程闊，馬偉立，楊子軒，馮軍花，張金艷

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000)

·臨床檢驗(yàn)技術(shù)研究·

改良快速Carba NP試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶的應(yīng)用價值

于宏偉，何京，程闊，馬偉立，楊子軒，馮軍花，張金艷

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000)

目的 探討改良快速Carba NP試驗(yàn)用于檢測碳青霉烯酶的可行性，并對比分析其與Carba NP試驗(yàn)的差異。方法 選取264株革蘭陰性桿菌，其中耐藥菌株164株，敏感菌株100株。分別采用Carba NP試驗(yàn)、改良快速Carba NP試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶表型，并以PCR檢測結(jié)果為參比，評價上述檢測方法的差異。結(jié)果 164株耐藥菌株中，耐藥基因陽性144株；100株敏感菌株耐藥基因均為陰性。164株耐藥菌株中Carba NP試驗(yàn)陽性135株；改良快速Carba NP試驗(yàn)陽性130株。100株敏感菌株中，2種方法均為陰性。與PCR檢測結(jié)果相比，Carba NP試驗(yàn)的敏感性和特異性分別為91.7%(132/144)和97.5%(117/120)，Kappa值0.886；改良快速Carba NP試驗(yàn)敏感性和特異性分別為89.6%(129/144)和99.2%(119/120)，Kappa值0.879。Carba NP試驗(yàn)與改良快速Carba NP試驗(yàn)的陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.45，P>0.05)。結(jié)論 改良快速Carba NP試驗(yàn)與PCR方法一致性高，較Carba NP試驗(yàn)更為快速、廉價，適用于流行病學(xué)調(diào)查和院內(nèi)感染的早期監(jiān)測。

Carba NP試驗(yàn)；改良快速Carba NP試驗(yàn)；碳青霉烯酶

美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2015年標(biāo)準(zhǔn)推薦Carba NP試驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵菌碳青霉烯酶表型篩選，具有較高的敏感性和特異性，且將檢測時間縮短至2 h[1]。2017年CLSI推薦改良碳青霉烯酶滅活法(mCIM)用于腸桿菌科細(xì)菌檢測，無需特殊試劑，結(jié)果客觀易于觀察，但所需溫育時間較長[2]?？焖貱arba NP試驗(yàn)由Srisrattakarn等[3]提出，對受試菌株的處理過程由研磨代替溫育，在保證Carba NP試驗(yàn)高敏感性和特異性的同時將檢測時間由2 h縮短至15 min，提高了檢測效率。本研究在快速Carba NP試驗(yàn)的基礎(chǔ)上增加5 mol/L NaCl溶液[4](簡稱為改良快速Carba NP試驗(yàn))，探討其在檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2014年1月至2016年8月臨床分離菌株264株，其中碳青霉烯類耐藥菌株164株(亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度≥4 μg/mL)，敏感菌株100株(亞胺培南、美羅培南均敏感)。其中肺炎克雷伯菌69株(敏感菌株25株，耐藥菌株44株)、大腸埃希菌60株(敏感菌株25株，耐藥菌株35株)、鮑曼不動桿菌68株(敏感菌株25株，耐藥菌株43株)、銅綠假單胞菌67株(敏感菌株25株，耐藥菌株42株)。所有菌株均由Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀進(jìn)行鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，藥敏結(jié)果采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)核。肺炎克雷伯菌ATCC 1705為陽性對照，大腸埃希菌ATCC 25922及銅綠假單胞菌ATCC 27853為陰性對照，均購自美國MicroBiologics 公司。

1.2 主要儀器及試劑 Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀及配套GN、AST-GN09卡片(法國生物梅里埃公司)；M-H瓊脂培養(yǎng)基(鄭州安圖生物公司)；細(xì)菌總蛋白質(zhì)抽提試劑(美國Thermo公司)；亞胺培南西司他丁鈉(上海海正輝瑞公司)；ZnSO4·7H2O粉末(美國Sigma公司)；酚紅粉末(美國Amresco公司)；PCR擴(kuò)增儀、2×Taq PCR Master Mix(美國ABI公司)；電泳儀(法國西比亞公司)；PCR引物由上海生工公司合成；細(xì)菌基因組DNA提取試劑(北京天根生物公司)。

1.3 Carba NP試驗(yàn)[5-6]用1 μL接種環(huán)從37 ℃培養(yǎng)24 h血平板上挑取受試菌株，加入裝有100 μL細(xì)菌總蛋白質(zhì)抽提液的1.5 mL離心管中，振蕩混勻5 s，制備2管分別標(biāo)記A、B。將100 μL A液(含0.1 mmol/L硫酸鋅的酚紅溶液，pH值調(diào)至7.8±0.1)、100 μL B液(A液中加入6 mg/mL亞胺培南西司他丁鈉，pH值調(diào)至7.8±0.1)，分別加入上述微量離心管中，37 ℃溫育2 h。若受試菌株產(chǎn)碳青霉烯酶，水解亞胺培南釋放H+，使溶液pH降低，酚紅指示劑由紅變黃。反之指示劑不變色。肺炎克雷伯菌ATCC 1705和大腸埃希菌ATCC 25922分別作為陽性對照和陰性對照。

1.4 改良快速Carba NP試驗(yàn) 用1 μL接種環(huán)從37 ℃培養(yǎng)24 h M-H平板上挑取受試菌株，分別在滴加50 μL檢測液A(含0.1 mmol/L硫酸鋅、5 mmol/L NaCl的酚紅溶液，pH值調(diào)至7.8±0.1)和滴加50 μL檢測液B(A液中加入6 mg/mL亞胺培南西司他丁鈉、pH值調(diào)至7.8±0.1)的紙片上充分研磨，15 min內(nèi)觀察結(jié)果。若受試菌株產(chǎn)碳青霉烯酶則在研磨過程中檢測液由紅變黃，反之，檢測液不變色。肺炎克雷伯菌ATCC 1705和大腸埃希菌ATCC 25922作為陽性對照和陰性對照。

1.5 PCR擴(kuò)增耐藥基因 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA并作為模板。參照文獻(xiàn)[7]合成A類碳青霉烯酶基因blaKPC、blaSME、blaGES、blaIMI，B類碳青霉烯酶基因blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaSPM、blaGIM和D類碳青霉烯酶基因blaOXA-48、blaOXA-24、blaOXA-23。引物由上海生工公司合成，見表1。PCR擴(kuò)增體系50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，模板4 μL，10 pmol/μL上、下游引物各2 μL，ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，退火溫度(見表1)下60 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。所得產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，目的片段純化后由上海生工公司雙向測序，用BLAST軟件與GenBank上已公布的基因序列進(jìn)行比對。

表1 耐藥基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 21.0軟件進(jìn)行。Carba NP試驗(yàn)、改良快速Carba NP試驗(yàn)同PCR檢測結(jié)果行一致性檢驗(yàn)，Kappa值>0.75一致性較好；Carba NP試驗(yàn)與改良快速Carba NP試驗(yàn)的陽性檢出率比較采用McNemarχ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢測 164株耐藥菌株中，耐藥基因陽性為144株，陰性為20株。其中，肺炎克雷伯菌中檢出blaKPC-2型39株，blaNDM-1型5株；大腸埃希菌中35株均為blaNDM-1型；鮑曼不動桿菌中檢出blaOXA-23型28株，15株耐藥基因陰性；銅綠假單胞菌中blaIMP-4型20株，blaVIM-2型17株，5株為耐藥基因陰性；100株敏感菌株中耐藥基因均為陰性，見表2。

表2 Carba NP試驗(yàn)與改良快速Carba NP試驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 Carba NP試驗(yàn)、改良快速Carba NP試驗(yàn)檢測碳青霉烯酶的結(jié)果分析 164株耐藥菌株中，Carba NP試驗(yàn)陰性29株，陽性135株，存在15株表型與基因不一致，其中12株表型陰性而基因檢測陽性，3株基因陰性而表型陽性。改良快速Carba NP試驗(yàn)陰性34株，陽性130株，存在16株表型與基因不一致，15株耐藥基因陽性而表型陰性，1株為耐藥基因陰性而表型陽性。見表3。100株敏感菌中，Carba NP試驗(yàn)、改良快速Carba NP試驗(yàn)均為陰性。以耐藥基因擴(kuò)增為金標(biāo)準(zhǔn)，Carba NP試驗(yàn)陽性135株，陰性129株，敏感性和特異性分別為91.7%(132/144)、97.5%(117/120)，Kappa值0.886；改良快速Carba NP試驗(yàn)陽性130株，陰性134株，敏感性和特異性分別為89.6%(129/144)、99.2%(119/120)，Kappa值0.879。見表2。Carba NP試驗(yàn)與改良快速Carba NP試驗(yàn)陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.45，P=0.227)。

表3 Carba NP試驗(yàn)、改良快速Carba NP試驗(yàn)檢測結(jié)果分析

3 討論

本研究采用的改良快速Carba NP試驗(yàn)在Carba NP試驗(yàn)原理的基礎(chǔ)上，用研磨法代替溫育受試菌株，通過在高滲性檢測液中充分研磨受試菌株，促使菌體破壞，加快碳青霉烯酶的釋放速度[4]，將反應(yīng)時間縮短至15 min，提高了檢測效率；同時減少了試劑用量，去除了細(xì)菌總蛋白質(zhì)抽提步驟，節(jié)約了檢測成本。改良快速Carba NP試驗(yàn)在與PCR方法的一致性檢驗(yàn)中，Kappa值雖稍低于Carba NP試驗(yàn)，但仍大于0.75，一致性良好，敏感性和特異性均大于85%。Carba NP試驗(yàn)將待測菌株同細(xì)菌總蛋白質(zhì)抽提試劑混合后，與檢測液共同溫育2 h，增加了碳青霉烯酶的利用率，相比改良快速Carba NP試驗(yàn)，其敏感性稍高，但2種檢測方法陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌科細(xì)菌中，5株肺炎克雷伯菌和2株大腸埃希菌Carba NP試驗(yàn)假陰性；6株肺炎克雷伯菌和2株大腸埃希菌改良快速Carba NP試驗(yàn)假陰性。其中包括3株黏液型肺炎克雷伯菌，兩方法均出現(xiàn)假陰性。有文獻(xiàn)表明，黏液型菌株易導(dǎo)致Carba NP試驗(yàn)假陰性結(jié)果[8]。此外，可能存在弱產(chǎn)酶菌株或產(chǎn)酶活性較差菌株[9]，pH改變較小，顏色變化不明顯，從而導(dǎo)致兩表型試驗(yàn)均出現(xiàn)假陰性。有1株肺炎克雷伯菌兩試驗(yàn)檢測結(jié)果不一致，其原因可能與Carba NP試驗(yàn)溫育時間長，敏感性稍高于改良快速Carba NP試驗(yàn)相關(guān)。非發(fā)酵菌中，2株鮑曼不動桿菌和3株銅綠假單胞菌Carba NP試驗(yàn)假陰性，4株鮑曼不動桿菌和3株銅綠假單胞菌改良快速Carba NP試驗(yàn)假陰性。本研究中鮑曼不動桿菌的產(chǎn)酶類型主要為D類酶，D類酶水解活性較弱，且Carba NP試驗(yàn)所用緩沖液緩沖作用強(qiáng)，所以易出現(xiàn)假陰性[4]。改良快速Carba NP試驗(yàn)用5 mol/L NaCl溶液代替裂解緩沖液，可能導(dǎo)致其較Carba NP試驗(yàn)假陰性菌株稍多。此外，研究中存在6株銅綠假單胞菌兩種表型試驗(yàn)檢測結(jié)果不一致，其中包括3株黏液型銅綠假單胞菌，因不利于研磨而導(dǎo)致改良快速Carba NP試驗(yàn)假陰性。其余結(jié)果不一致菌株可能與兩方法的敏感性、特異性，菌落自身性質(zhì)及瓊脂類型相關(guān)[10]。改良快速Carba NP試驗(yàn)選用M-H平板，與Srisrattakarn等[3]研究一致。本研究也嘗試用血平板進(jìn)行試驗(yàn)，但結(jié)果多為陰性，具體機(jī)制不明。此外，研究中存在部分非發(fā)酵菌對碳青霉烯類抗生素耐藥，但基因及產(chǎn)酶表型檢測均為陰性，其具體耐藥機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究存在基因檢測為陰性但對碳青霉烯類抗生素耐藥，表型檢測均為陽性的銅綠假單胞菌1株，僅Carba NP試驗(yàn)陽性的鮑曼不動桿菌2株，提示本研究可能在基因檢測的全面性方面尚存不足，需后續(xù)研究予以完善。

改良快速Carba NP試驗(yàn)可應(yīng)用于大批量的流行病學(xué)調(diào)查，但尚不能用于檢測產(chǎn)酶表型。

[1]孫長貴, 成軍, 楊燕. 2015年CLSI M100-S25文件主要更新內(nèi)容解讀[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2015, 33(4): 241-245.

[2]程闊, 于宏偉, 馬偉立, 等. imCIM檢測B類碳青霉烯酶的效果評價[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2017, 35(1): 31-35.

[3]Srisrattakarn A, Lulitanond A, Wilailuckana C,etal. Modification and evaluation of the Carba NP test by use of paper strip for simple and rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2016, 32: 117.

[4]Dortet L, Poirel L, Errera C,etal. CarbAcineto NP test for rapid detection of carbapenemase-produingAcinetobacterspp.[J]. J Clin Microbiol, 2014, 5(7): 2359-2364.

[5]Nordmann P, Poirel L, Dortet L. Rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae [J]. Emerg Infect Dis, 2012, 18(9): 1503-1507.

[6]Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standands for antimicrobial susceptibility testing: Twenty-fifth informational supplement. CLSI document M100-S25[S]. Wayne, PA: CLSI, 2015.

[7]Pasanen T, Koskela S, Mero S,etal. Rapid molecular characterization ofAcinetobacterbaumanniiclones with rep-PCR and evaluation of carbapenemase genes by new multiplex PCR in hospital district of Helsinki and Uusimaa[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e85854．

[8]Yamada K, Kashiwa M, Arai K,etal. Comparison of the Modified-Hodge test, Carba NP test, and carbapenem inactivation method as screening methods for carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J]. J Microbiol Methods, 2016, 128:48-51.

[9]曹蕾, 李小月, 周萬青, 等. CIM和Carba NP篩選腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的比較[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2016, 34(9): 646-649.

[10]Hombach M, Von GB, Castelberg C,etal. Evaluation of the rapid Carba NP test for detection of carbapenemases in Enterobacteriaceae[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(12): 3828-3833.

(本文編輯：周萬青，劉群)

Application value of modified rapid Carba NP test for the detection of carbapenemase-producing strains

YUHong-wei,HEJing,CHENGKuo,MAWei-li,YANGZi-xuan,FENGJun-hua,ZHANGJin-yan

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,Hebei,China)

Objective To investigate the feasibility of modified rapid Carba NP test for the detection of carbapenemase, and analyze the differences between the modified method and Carba NP test. Methods A total of 264 strains of gram-negative bacillus, including 164 carbapenem-resistant strains and 100 sensitive strains, were collected, and their carbapenemase were detected by Carba NP test and the modified rapid Carba NP test, respectively. The differences between the two tests were evaluated based on PCR as a reference. Results Among 164 carbapenem-resistant strains, carbapenemase gene was detected in 144 strains by PCR. The carbapenemase gene was negative in 100 sensitive strains. Among 164 carbapenem-resistant strains, 135 were positive for the Carba NP test, while 130 for the modified rapid Carba NP test. One hundred of sensitive strains were negative for the two Carba NP tests. Compared with the results of PCR, the sensitivity, specificity andKappavalue of the Carba NP test were 91.7%(132/144), 97.5%(117/120) and 0.886, respectively, while those of the modified rapid Carba NP test were 89.6%(129/144), 99.2%(119/120) and 0.879, respectively. There was no significant difference in the positive rates between Carba NP test and the modified rapid Carba NP test(χ2=1.45,P>0.05). Conclusion The modified rapid Carba NP test which has high consistency with the PCR method，is faster and cheaper than the Carba NP test, and may be applied to epidemiologic survey and the early monitoring of nosocomial infections.

Carba NP test; modified rapid Carba NP test; carbapenemase

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.03

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃基金(20150332)。

于宏偉，1993年生，女，碩士研究生，從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)研究。

張金艷，主任技師，E-mail：jinyanzhang66@163.com。

R446.5

A

2017-05-03)