楊銳，屈平華，陳東科

(1.張掖市甘州區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅張掖 734000；2.廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510006；3.北京醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730)

·案例分析·

闌尾周圍膿腫中檢出未分類新型鏈球菌1例

楊銳1，屈平華2，陳東科3

(1.張掖市甘州區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，甘肅張掖 734000；2.廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510006；3.北京醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730)

闌尾；膿腫；新型鏈球菌

隨著16S rRNA基因序列分析為代表的分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)菌分類鑒定中的廣泛應(yīng)用，鏈球菌(Streptococcus)的菌群劃分發(fā)生了很大變化。原先一些鏈球菌群先后被劃分出，獨(dú)立成屬，如腸球菌屬、孿生球菌屬、乳球菌屬、乏養(yǎng)球菌屬、顆粒鏈菌屬等；同時(shí)，一些新的菌種不斷被分離、命名和補(bǔ)充增加，成為鏈球菌屬的新成員[1]，如中華鏈球菌(S.sinesis)[2]、香港鏈球菌(S.hongkongensis)[3]。我們于2013年3月自1例急性化膿性闌尾炎患者闌尾周圍膿腫中分離出1株鏈球菌，經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序，初步鑒定為一未分類的新型鏈球菌，報(bào)道如下。

1 病歷摘要

患者，男，50歲。2013年2月因右下腹疼痛，伴惡心、嘔吐數(shù)次，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為闌尾炎，輸液治療后疼痛緩解(具體藥物不詳)。2013年3月4日，右下腹疼痛再次發(fā)作，且逐漸加重，伴惡心，無(wú)嘔吐，以“慢性闌尾炎急性發(fā)作”收入本院?；颊哂新宰枞苑尾?、肺結(jié)核、肺大泡、胸膜炎、冠心病等基礎(chǔ)疾病。入院查體：體溫38.6 ℃，脈搏72次/分鐘，呼吸20次/分鐘，血壓120/80 mmHg；腹部平坦，未見(jiàn)腹壁靜脈曲張，未見(jiàn)腸型及蠕動(dòng)波，腹軟，右下腹壓痛明顯，反跳痛存在，無(wú)肌緊張，未扣及包快，肝脾肋下未觸及，Murphy征陰性；肝腎區(qū)扣擊痛陰性，移動(dòng)性濁音陰性，腸鳴音正常，結(jié)腸充氣試驗(yàn)陰性，腰大肌試驗(yàn)陰性，閉孔內(nèi)肌試驗(yàn)陰性。血液常規(guī)檢查：WBC 7.5×109/L，N 77.8%，L 12.8%，M 9.4%。腹部超聲檢查提示：右下腹混合性包塊。急診在硬膜外麻醉下行闌尾切除術(shù)，術(shù)中見(jiàn)闌尾發(fā)黑，壞疽，周圍形成膿腫，抽吸膿液做細(xì)菌培養(yǎng)，檢出大腸埃希菌和鏈球菌各1株。術(shù)后給予頭孢吡肟抗感染治療，并止血、補(bǔ)液對(duì)癥治療，7 d后患者切口愈合良好出院。

2 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定

無(wú)菌抽取膿汁接種哥倫比亞血瓊脂平板(英國(guó)Oxoid公司)和麥康凱平板(英國(guó)Oxoid公司)，其中哥倫比亞血瓊脂平板放入CO2產(chǎn)氣袋(法國(guó)生物梅里埃公司)中，35 ℃培養(yǎng)24 h后觀察到2種菌落：一種為濕潤(rùn)、扁平、灰白色的直徑約2 mm的大菌落，涂片革蘭染色(珠海貝索公司)鏡檢為革蘭陰性桿菌；另一種為圓形突起、邊緣整齊、半透明、濕潤(rùn)、易乳化、β溶血、菌落直徑約0.5 mm的小菌落，涂片革蘭染色為革蘭陽(yáng)性球菌，呈成雙或成短鏈排列。麥康凱平板上則僅生長(zhǎng)一種菌落，其發(fā)酵乳糖，呈桃紅色，菌落直徑和形態(tài)與哥倫比亞血瓊脂平板上生長(zhǎng)的陰性桿菌一致。革蘭陰性桿菌經(jīng)法國(guó)生物梅里埃公司ID 32E試條鑒定為大腸埃希菌，生物編碼為54465743420，鑒定百分率99.9%，T值為0.93。革蘭陽(yáng)性球菌觸酶試驗(yàn)陰性、吡咯烷酮芳基酰胺酶(PYR)試驗(yàn)陽(yáng)性、CAMP試驗(yàn)陰性、精氨酸水解試驗(yàn)陽(yáng)性、V-P試驗(yàn)陽(yáng)性、6.5%NaCl肉湯生長(zhǎng)、桿菌肽耐藥、復(fù)方磺胺甲噁唑敏感。采用法國(guó)生物梅里埃公司Lancefield血清F群凝集，Rapid ID 32 Strep條鑒定為豕鏈球菌，生物編碼3732305110，鑒定百分率為99.9%，T值為0.7。在硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基(杭州天和公司)中呈顆粒狀沉淀生長(zhǎng)，上層澄清。采用16S rRNA基因通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′和1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]。PCR產(chǎn)物送上海英駿廣州分公司進(jìn)行測(cè)序，獲得>1 400 bp的有效序列(部分峰圖見(jiàn)圖1)。測(cè)序序列在EzBioCloud(http://www.ezbiocloud.net/ eztaxon/)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該菌與假豕鏈球菌、香港鏈球菌和豕鏈球菌的相似度較高，分別為98.0%、97.5%和97.3%。按Stackebrandt等[5]2006年修訂的16S rRNA基因低于99.2%的新分類單元標(biāo)準(zhǔn)，初步鑒定為一未分類的新菌種。

圖1 16S rRNA部分測(cè)序結(jié)果

3 討論

鏈球菌屬內(nèi)種別多、分類方法多，種間鑒別較復(fù)雜，傳統(tǒng)的鑒定方法技術(shù)復(fù)雜，影響因素多，商品化鑒定系統(tǒng)和儀器有時(shí)難以將菌種準(zhǔn)確區(qū)分鑒定，尤其一些不常見(jiàn)和新型菌株，僅依靠形態(tài)學(xué)和生化反應(yīng)等表型特征難以準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定。以16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)為代表的分子鑒定方法是傳統(tǒng)表型鑒定方案之外的常用替代方案，特別是在臨床不常見(jiàn)菌、苛養(yǎng)菌和新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌鑒定中[6]。16S rRNA基因測(cè)序鑒定是在細(xì)菌進(jìn)化和親緣關(guān)系基礎(chǔ)上對(duì)已有菌種進(jìn)行的一種序列相似性分析，其相對(duì)于傳統(tǒng)表型分析方法而言更具客觀性和準(zhǔn)確性。目前，針對(duì)臨床細(xì)菌和真菌的基因測(cè)序鑒定，美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室和標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)已制定了相應(yīng)的指南文件[7]。隨著國(guó)內(nèi)16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)的迅速開(kāi)展和普及，國(guó)內(nèi)臨床微生物室人員亦應(yīng)認(rèn)真對(duì)待少見(jiàn)的觸酶陰性革蘭陽(yáng)性球菌，并結(jié)合16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)做出正確的分類鑒定。

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(本文編輯：周萬(wàn)青，劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.21

楊銳，1972年生，男，副主任技師，大學(xué)本科，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)工作。

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2017-03-17)