周暉 ，江楚文，方偉，梁敏文，黃錦維 ，侯鐵英

(廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院a.檢驗科，b.廣東省臨床檢驗中心，廣州 510080)

·質(zhì)量管理研究·

ELISA定量檢測抗dsDNA抗體試劑盒性能驗證方法的探討

周暉a，江楚文b，方偉a，梁敏文a，黃錦維a，侯鐵英a

(廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院a.檢驗科，b.廣東省臨床檢驗中心，廣州 510080)

目的 探討ELISA定量檢測抗雙鏈DNA抗體(下簡稱抗dsDNA抗體)試劑盒的性能驗證方法。方法 依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)批準(zhǔn)的EP15-A2文件方法驗證精密度。通過檢測過往室間質(zhì)量評價(external quality assessment，EQA)質(zhì)評物、與比較試劑進行比較、回收試驗等3種方法驗證準(zhǔn)確度。通過檢測空白樣本驗證檢測低限(lower limit of detection, LLD)。通過《CNAS-CL39：醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》、CLSI C28-A3C文件提供的方法驗證臨界值。通過改良的Doumas法驗證線性范圍。結(jié)果 實測批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于廠家聲稱的變異系數(shù)或按EP15-A2公式計算的驗證值。檢測EQA質(zhì)評物陰性符合率為98.4%(63/64)，陽性符合率為100%(20/20)，總符合率為98.8%(83/84)。與比較試劑的陰性符合率為91.2%(52/57)，陽性符合率為87.0%(40/46)，總符合率為89.3%(92/103)，Kappa值為0.783(P=0.062)，兩種試劑具有優(yōu)秀的一致性。平均回收率為99.65%。3種方法驗證準(zhǔn)確性均通過。實測LLD為0.5 IU/mL，低于廠家聲稱的1 IU/mL。按CNAS-CL39方法，實測的臨界值為18.51 IU/mL，與說明書建議的20 IU/mL接近。按C28-A3C方法，臨界值驗證也通過。線性回歸方程為Y=0.978 8X-3.125 4，r2為0.996 1，截距項-3.125 4與0差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.772，P=0.483)。線性范圍是1.6～212.5 IU/mL，與廠家聲明一致，線性驗證通過。結(jié)論 候選抗ds-DNA抗體試劑盒的精密度、準(zhǔn)確度、LLD、臨界值、線性范圍與廠家的聲明一致，能滿足臨床診斷與治療的需要。本研究采用的一系列驗證方法為ELISA定量檢測試劑的性能驗證提供了新思路。

抗雙鏈DNA抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗；性能驗證

中國合格評定國家認可委員會(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)發(fā)布的《CNAS-CL02：醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則》(ISO 15189：2012，IDT)中5.5.1.2條款要求[1]：在常規(guī)應(yīng)用前，實驗室應(yīng)對未加修改而使用的已確認的檢驗程序進行獨立驗證?！禖NAS-CL39：醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)定性檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[2]中，則根據(jù)臨床免疫學(xué)檢驗的特性對此作了進一步的說明，要求檢驗方法和程序的分析性能驗證內(nèi)容至少應(yīng)包括：檢出限、符合率，如為定量方法應(yīng)驗證精密度。我國衛(wèi)生部頒布的《三級綜合醫(yī)院評審標(biāo)準(zhǔn)實施細則》(2011年版)也要求對檢驗程序進行方法學(xué)驗證。盡管如此，免疫學(xué)檢驗特別是ELISA方法并沒有統(tǒng)一、公認、可行性強的性能驗證指標(biāo)及方法。我科近期對德國ORGENTEC公司ELISA定量檢測抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體-IgG試劑盒進行了性能驗證，報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 檢驗科-70 ℃凍存的2010年至2015年國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心、美國病理學(xué)家協(xié)會(College of American Pathologists, CAP)、德國歐蒙公司等組織的室間質(zhì)量評價(external quality assessment，EQA)提供的抗dsDNA抗體質(zhì)評物共計84份，其中64份預(yù)期結(jié)果為陰性，20份為陽性。另收集在廣東省人民醫(yī)院進行抗dsDNA抗體檢測的患者血清樣本103份，已獲患者知情同意。

1.2 試劑與儀器 抗dsDNA(IgG)抗體定量檢測試劑盒(ELISA，德國ORGENTEC公司、德國歐蒙公司)，Multiskan FC酶標(biāo)儀、Wellwash Vesa洗板機(芬蘭Thermo Labsystems公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 精密度驗證 依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)批準(zhǔn)的EP15-A2文件方法[3]，取2份不同濃度血清樣本。每天檢測1批次，每份標(biāo)本每批平行檢測3孔，共測5 d，計算批內(nèi)變異系數(shù)(CVr)和實驗室內(nèi)變異系數(shù)(CVl)，CVl即批間變異系數(shù)。若測得的CVr、CVl小于廠家聲稱的批內(nèi)變異系數(shù)(CVr-廠)和批間變異系數(shù)(CVl-廠)，則精密度驗證通過；若大于廠家聲稱值，則按EP15-A2的公式計算驗證值，若測得的CVr、CVl小于驗證值，則精密度驗證通過。

1.3.2 準(zhǔn)確度驗證

1.3.2.1 檢測過往EQA質(zhì)評物 檢測本室凍存的過往EQA質(zhì)評物共計84份，計算陰性符合率、陽性符合率和總符合率。測定結(jié)果可接受性標(biāo)準(zhǔn)為陽性(反應(yīng)性)或陰性(非反應(yīng)性)結(jié)果符合。參照國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，計算能力比對分析(proficiency testing, PT)得分(可接受結(jié)果個數(shù)占總的測定樣本數(shù)的百分比，即總符合率)，≥80%則驗證通過。

1.3.2.2 與歐蒙公司試劑的比較 用歐蒙公司試劑、待驗證的ORGENTEC公司試劑同時檢測103份血清樣本抗dsDNA抗體。測量結(jié)果高于臨界值(cut-off值)判斷為陽性，低于臨界值判斷為陰性。由于2種試劑臨界值不同，歐蒙試劑為100 IU/mL、ORGENTEC試劑為20 IU/mL，因此僅計算定性結(jié)果的陰性、陽性符合率，評價一致程度。

1.3.2.3 回收試驗 選擇高、中、低濃度(含有臨界值附近濃度)的5份不同患者樣本，360 μL患者樣本分別加40 μL試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)品(濃度為200 IU/mL)或樣本稀釋液，分別制成回收樣本或?qū)φ諛颖?，每個樣本平行測試2次，計算回收率。評判標(biāo)準(zhǔn)參考國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)中IgG的可接受范圍±25%，回收率在75%～125%之間為合格。

方法二：參考CLSI C28-A3C文件[5]，測定40例體檢健康者標(biāo)本，結(jié)果用“1/3”規(guī)則進行離群值檢驗。發(fā)現(xiàn)的離群值均棄去，并用新的參考個體代替，確保40例測試結(jié)果不含離群值。若40例標(biāo)本檢測結(jié)果均小于cut-off值或僅有4個標(biāo)本超出，則驗證通過。否則，進行cut-off值確立試驗。

1.3.5 線性范圍驗證 按改良的Doumas法[6]，取低濃度(L)和高濃度(H)的患者混合血清各1份，濃度覆蓋試劑盒說明書給定的線性范圍，按L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、L+4H、H的比例配制成6個濃度系列血清，以預(yù)期值為橫坐標(biāo)(X)，實測值為縱坐標(biāo)(Y)，利用SPSS軟件求回歸方程Y=b0+b1X和相關(guān)系數(shù)(r)，若r2>0.95,b1在0.97～1.03之間,b0與0差異無統(tǒng)計學(xué)意義，則該測定方法的線性范圍在實驗已涉及濃度內(nèi)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 17.0 軟件進行。兩種試劑定性結(jié)果的比較采用McNemar檢驗，一致性采用κ系數(shù)檢驗，Kappa值大于0.75一般表示認為具有優(yōu)秀的一致性，0.40-0.75認為相當(dāng)好的一致性，低于0.40代表很差的一致性。數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk法?；貧w方程中的截距項b0與0的比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 抗dsDNA抗體精密度驗證結(jié)果 測得2個水平血清樣本的批內(nèi)變異系數(shù)(CVr)均小于CVr-廠。水平1的CVl小于CVl-廠, 水平2的CVl(7.7%)略大于CVl-廠(7.3%)，但小于按EP15-A2文件公式計算的實驗室內(nèi)驗證CV值(11.8%)。見表1。精密度驗證通過。

表1 抗dsDNA抗體精密度驗證結(jié)果

2.2 準(zhǔn)確度驗證結(jié)果

2.2.1 檢測過往EQA質(zhì)評物結(jié)果 陰性符合率為98.4%(63/64)，陽性符合率為100%(20/20)?？偡下蕿?8.8%(83/84)，大于80%，準(zhǔn)確度驗證通過。20份陽性樣品覆蓋了高、中、低濃度，其中6份結(jié)果>100 IU/mL，7份在41～100 IU/mL之間，7份在21～40 IU/mL之間。

2.2.2 與歐蒙公司試劑的比較 兩種試劑檢測103份患者樣本，歐蒙試劑陽性率為44.7%(46/103)，ORGENTEC試劑為43.7%(45/103)，兩種試劑檢測抗dsDNA抗體陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，McNemar檢驗P值為1.000。以歐蒙試劑為評價標(biāo)準(zhǔn)，陰性符合率為91.2%(52/57)，陽性符合率為87.0%(40/46)，總符合率為89.3%(92/103)，Kappa值為0.783，P=0.062，兩種試劑具有優(yōu)秀的一致性。46份歐蒙試劑陽性樣本覆蓋了高、中、低濃度，其中16份小于2倍cut-off值，20份在2～5倍cut-off值之間，10份大于5倍cut-off值。見表2。

表2 ORGENTEC試劑和歐蒙試劑檢測抗dsDNA抗體檢測結(jié)果

ORGENTEC試劑+-合計歐蒙試劑+40646-55257合計4558103

2.2.3 回收試驗 平均回收率為99.65%，準(zhǔn)確性驗證合格。見表3。

表3 抗dsDNA抗體檢測回收試驗結(jié)果

2.5 線性范圍驗證結(jié)果 求得回歸方程為Y=0.977 8X-3.125 4，r2為0.996 1，大于0.95。b1為0.978 8，在0.97～1.03之間。b0為-3.125 4，與0差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.772，P=0.483)，見圖1。線性范圍是1.6～212.5 IU/mL，與廠家聲明的0～200 IU/mL相符合，線性驗證通過。

圖1 抗dsDNA抗體檢測線性擬合曲線

3 討論

目前國內(nèi)外的指南、標(biāo)準(zhǔn)要求分析性能驗證的指標(biāo)主要有精密度、準(zhǔn)確度、檢測低限、參考范圍、線性范圍等。ELISA法屬于臨床免疫檢驗的范疇，雖然可以定量檢測，但仍具有不同于臨床化學(xué)定量分析的特點，為此本研究結(jié)合免疫學(xué)、臨床化學(xué)檢驗的特點，參考國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)，對試劑盒進行性能驗證。

ELISA法CVr通常小于10%～15%，CVl通常小于15%～20%，并且在不同濃度水平的精密度可能不同，濃度越高，精密度越好。本研究采用EP15-A2文件提供的方法[3]，選擇接近廠家聲稱水平的樣本對精密度進行驗證。結(jié)果cut-off值(20 IU/mL)附近的低水平、中水平樣本的批內(nèi)、批間CV均接近廠家聲稱值。聲稱及驗證的CVr均小于5.0%，CVl均小于13.0%，符合行內(nèi)共識。

準(zhǔn)確度的驗證方法常有：(1)檢測參考物質(zhì)，(2)檢測臨床診斷明確的陰陽性樣品，(3)檢測EQA質(zhì)評物，(4)與其他分析方法比對，(5)回收試驗[3，7]。首先，抗dsDNA抗體國際參考品是WHO Wo/80(200 IU/mL)，常規(guī)實驗室難以獲得；其次，抗dsDNA抗體在SLE中的陽性率為35.1%～78%[8]，且抗體水平隨病情、治療而變化。故不考慮采用第1、2種方法。國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心、美國CAP是組織臨床檢驗EQA的國內(nèi)外權(quán)威機構(gòu)，德國歐蒙公司也組織全球自身抗體EQA多年。用ORGENTEC試劑檢測上述3家機構(gòu)提供的84份EQA質(zhì)評物，總符合率達98.8%，高于評價標(biāo)準(zhǔn)的80%，驗證通過。由于參加EQA實驗室使用的方法、試劑、儀器均不統(tǒng)一及技術(shù)發(fā)展的局限性，目前國內(nèi)外在抗體檢測的EQA中均只評價定性結(jié)果，因而第3種方法僅驗證了定性結(jié)果的準(zhǔn)確性。使用第4種方法時，選擇了目前國內(nèi)應(yīng)用較廣泛的德國歐蒙公司ELISA法試劑。比對實驗發(fā)現(xiàn)2種試劑定性結(jié)果具有優(yōu)秀的一致性，驗證通過。第4種方法也僅驗證了定性結(jié)果的準(zhǔn)確性，為此本研究進一步設(shè)計回收試驗來驗證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，嚴格按照文獻介紹方法進行操作。由于目前沒有公認的抗dsDNA抗體的可接受范圍，評價標(biāo)準(zhǔn)借用了國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心EQA評價標(biāo)準(zhǔn)中IgG的可接受范圍(±25%),結(jié)果表明包括cut-off值附近濃度的低、中、高濃度的5份不同患者樣本，回收率在89.0%～115.3%之間，驗證通過。

定量ELISA方法的參考范圍上限即為cut-off值，作為判斷特定疾病、狀態(tài)或被測量存在或不存在的界限的量值[2]。本研究分別采用CLSI C28-A3、CNAS-CL39文件建議的2種方法驗證cut-off值[2，5]，均通過。CLSI C28-A3方法較簡單易行，主要針對定量臨床實驗。但是ELISA法具有臨床化學(xué)定量實驗不同的特點，標(biāo)本本身的因素可能增加或降低檢測值，從而造成假陽性或假陰性，如類風(fēng)濕因子、補體、藥物、內(nèi)分泌的改變等。CNAS-CL39方法正是充分考慮到內(nèi)源性因素的影響，使用了患者血清，且可計算cut-off值，因而更為全面可靠。

線性的評價與驗證主要有4種方法：目測法、CAP設(shè)備委員會(IRC)采用的CAP-IRC法、CLSI采用的EP6-A方法和改良Doumas方法[6]。目測法簡單直觀，但主觀性強、不可靠且不具重復(fù)性，CAP-IRC法和EP6-A法均采用了多項式回歸分析方法，可較為準(zhǔn)確地評價數(shù)據(jù)的線性模式，但統(tǒng)計處理復(fù)雜難懂，一些實驗室人員難接受。相比之下，改良Doumas方法簡單易懂，用Excel軟件即可得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)。本研究采用改良Doumas方法驗證了ORGENTEC試劑的線性范圍，結(jié)果通過。

綜上所述，德國ORGENTEC公司抗dsDNA抗體試劑盒的精密度、準(zhǔn)確度、檢測低限、臨界值、線性范圍經(jīng)方法學(xué)驗證，與廠家聲明一致，能滿足臨床診斷與治療的需要。實驗室在常規(guī)應(yīng)用新方法、新試劑前，對于自建檢測系統(tǒng)、非配套系統(tǒng)、修改過的檢驗程序等才需進行完整、繁瑣、高成本的性能評價；對于原裝配套試劑和儀器、且未加修改的檢驗程序(即封閉系統(tǒng))時，只要進行易操作、適用、經(jīng)濟的性能驗證，對于待驗證的某項指標(biāo)，采用一種方法即可。本研究采用的一系列方法既結(jié)合了免疫和生化，又綜合了定性和定量檢測的特點與要求，簡易、實用，為ELISA定量檢測試劑的性能驗證提供了新思路。

[1]中國合格評審國家認可委員會.ISO 15189：2012, 醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則[M]. 北京：中國計量出版社，2013.

[2]中國合格評審國家認可委員會.CNAS-CL39, 醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)定性檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明[M].北京：中國計量出版社,2012.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute. EP15-A2. User verification of performance for precision and trueness; Approved guideline-second Edition[S]. Wayne,PA:CLSI, 2005.

[4]張秀明，馮仁豐. 正確理解和使用分析靈敏度及檢出限[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 30(9): 669-672.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute. EP28-A3C. Defining, establishing, and verifying reference intervals in the clinical laboratory; approved guideline-third edition[S]. Wayne, PA: CLSI, 2010.

[6]馮仁豐．臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)[M]．上海：上海科學(xué)技術(shù)文獻出版社，2007：138-177．

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute. EP12-A2. User protocol for evaluation of qualitative test performance; Approved guideline-second editon[S]. Wayne, PA: CLSI, 2008.

[8]Borba EF, Araujo DB, Bonfá E,etal. Clinical and immunological features of 888 brazilian systemic lupus patients from a monocentric cohort: comparison with other populations[J]. Lupus, 2013, 22(7): 744-749.

(本文編輯：劉群)

Verification for performance of anti-dsDNA antibody quantitative ELISA kit

ZHOUHuia,JIANGChu-wenb,FANGWeia,LIANGMin-wena,HUANGJin-weia，HOUTie-yinga

(a.DepartmentofClinicalLaboratory,b.GuangdongCenterforClinicalLaboratory,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,Guangdong,China)

Objective To explore the verification methods for the performance of quantitative detection kit of anti-dsDNA antibodiy with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Methods The precision was verified according to the EP15-A2 document approved by the American Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI). The accuracy was verified by detecting the samples of previous external quality evaluation(EQA), compared with the comparative kits and recovery test. The lower limit of detection(LLD) was calculated by the results of blank samples. The cut-off value was verified according to the C28-A3C document approved by CLSI and "CNAS-CL39: Guidance on the Application of Accreditation Criteria for the Medical Laboratory Quality and Competence in the Field of Clinical Qualitative Immunology" respectively. The improved Doumas method was used to verify the range of linearity. Results The measured intra-assay and inter-assay coefficients of variation were lower than those announced by the manufacturer or the calculated values according to the EP15-A2 document. The coincidence rates for negative and positive EQA samples between detected and expected values were 98.4%(63/64) and 100%(20/20) respectively. The total coincidence rate was 98.8%(83/84). The coincidence rate for negative and positive samples between the results from candidate and comparative kits were 91.2%(52/57) and 87.0%(40/46) respectively. The total coincidence rate was 89.3%(92/103) and theKappavalue was 0.783(P=0.062), which implied excellent consistency between the two kits. The mean recovery rate was 99.65%. The measured LLD was 0.5 IU/mL which was lower than 1 IU/mL as claimed by the manufacturer. The measured cut-off value according to the CNAS-CL39 document was 18.51 IU/mL, which was close to 20 IU/mL announced by the manufacturer. Based on the C28-A3C method, the cut-off value could be approved. The linear regression equation wasY=0.978 8X-3.125 4,r2=0.996 1. There was no statistical difference between the intercept(-3.125 4) and 0(t=-0.772，P=0.483). The range of linearity was from 1.6 to 212.5 IU/mL, which was consistent with the values declared by the manufacturer. All the verifications of the five performances above-mentioned could be passed. Conclusion The precision, accuracy, LLD, cut-off value and range of linearity of the candidate quantitative ELISA kit for anti-dsDNA antibody were consistent with the statement of the manufacturer, which indicated the performance of the kits may meet the requirements of clinic diagnosis and treatment. A series of methods used in this study provided a simple protocol for verifying the performance of quantitative ELISA kits.

anti-dsDNA antibody; enzyme-linked immunosorbent assay; verification for performance

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.15

廣東省省級科技計劃項目(2015A050502033)。

周暉，1969年生，女，主任技師，碩士，從事臨床免疫學(xué)檢驗工作。

侯鐵英，主任醫(yī)師，碩士，E-mail：houtieying001@126.com。

R446.6

A

2017-05-03)