李 光

南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院/江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇南京 210024

尿微量清蛋白在臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)已廣泛普及,全自動(dòng)化分析儀的使用極大地提高了工作效率和檢測(cè)結(jié)果的精密度。但在實(shí)際臨床工作中發(fā)現(xiàn),雅培全自動(dòng)生化分析儀沒有尿微量清蛋白的原裝配套試劑,國(guó)內(nèi)大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室在開展這個(gè)項(xiàng)目的時(shí)候,使用的都是國(guó)產(chǎn)試劑,而國(guó)產(chǎn)試劑生產(chǎn)廠家眾多,各廠家提供的試劑說明書在檢驗(yàn)方法中對(duì)副波長(zhǎng)的要求也不盡相同,甚至有說明書對(duì)副波長(zhǎng)只字未提,有些雖然在說明書中有要求,但廠家試劑應(yīng)用工程師在儀器的參數(shù)設(shè)置中并未設(shè)置有副波長(zhǎng),本研究旨在通過根據(jù)ISO15189方法或性能驗(yàn)證的要求[1],比較添加副波長(zhǎng)前后,尿微量清蛋白精密度的變化[2],評(píng)估副波長(zhǎng)對(duì)尿微量清蛋白重復(fù)性的影響,同時(shí)觀察不同濃度標(biāo)本精密度的變化。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2018年11月12-16日本院門診和住院患者尿液標(biāo)本4份,要求:微量清蛋白濃度分別為10、100、200、400 mg/L的尿液標(biāo)本各一份,確保每份標(biāo)本的總量足夠25次檢測(cè),并對(duì)每份標(biāo)本進(jìn)行分裝冷凍保存。

1.2儀器與試劑 雅培全自動(dòng)生化分析儀C16000(尿微量蛋白波長(zhǎng)參數(shù):主波長(zhǎng)340 nm,副波長(zhǎng)700 nm)。中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的尿微量清蛋白檢測(cè)試劑盒(R1、R2試劑)及配套校準(zhǔn)品；朗道實(shí)驗(yàn)診斷有限公司提供的尿微量清蛋白質(zhì)控品。

1.3精密度測(cè)定方法 按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì) (CLSI)頒布的EP15-A2(醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室精密度和準(zhǔn)確度的驗(yàn)證指南)中的精密度驗(yàn)證程序[3],在添加副波長(zhǎng)前后分別做如下操作:檢驗(yàn)程序按照5×1×5的方案檢測(cè)標(biāo)本。即:每個(gè)濃度標(biāo)本檢測(cè)5 d,每天一個(gè)分析批,每個(gè)分析批重復(fù)檢測(cè)5次。在每個(gè)運(yùn)行批內(nèi),運(yùn)行標(biāo)本。同時(shí)檢測(cè)質(zhì)控標(biāo)本。如果質(zhì)控結(jié)果超出可接受范圍,那么拒絕這個(gè)運(yùn)行批,丟棄該批次結(jié)果,糾正存在的問題,在下一個(gè)運(yùn)行批中重新檢測(cè)質(zhì)控標(biāo)本。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 按照EP15-A2文件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)算添加副波長(zhǎng)前后批內(nèi)精密度和總精密度,并與廠商聲明的精密度性能指標(biāo)進(jìn)行比較。如果≤對(duì)應(yīng)的允許不精密度,表示已驗(yàn)證批內(nèi)精密度和總精密度的驗(yàn)證目標(biāo)。反之,表示驗(yàn)證目標(biāo)未得到臨床實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)查找原因,或與試劑廠商聯(lián)系,并取得幫助。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在Excel2007軟件上進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1添加副波長(zhǎng)前后精密度變化 在10、100、200、400 mg/L 4個(gè)濃度的檢測(cè)結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)添加副波長(zhǎng)前,各個(gè)濃度的批內(nèi)精密度和總精密度均高于廠商聲明的允許不精密度要求5%,見表1。添加副波長(zhǎng)后,10、100 mg/L尿液標(biāo)本的批內(nèi)精密度和總精密度均高于廠商聲明的允許不精密度要求5%。同時(shí)，添加副波長(zhǎng)后,200 mg/L的尿液標(biāo)本的批內(nèi)精密度仍不符合廠商聲明的允許不精密度要求5%,而200 mg/L的尿液標(biāo)本總精密度,以及400 mg/L尿液標(biāo)本的批內(nèi)精密度、總精密度均符合廠商聲明的允許不精密度要求5%,見表2。

表1 添加副波長(zhǎng)前尿微量清蛋白精密度驗(yàn)證報(bào)告

表2 添加副波長(zhǎng)后尿微量清蛋白精密度驗(yàn)證報(bào)告

圖1 添加副波長(zhǎng)前反應(yīng)曲線

2.2添加副波長(zhǎng)前后反應(yīng)曲線的變化 添加副波長(zhǎng)之前,在加入試劑R1和標(biāo)本之后曲線有一明顯跳點(diǎn),加入試劑R2之后同樣也存在一個(gè)明顯的跳點(diǎn),見圖1。在添加副波長(zhǎng)之后,這兩個(gè)跳點(diǎn)均消失,見圖2。

圖2 添加副波長(zhǎng)后反應(yīng)曲線

3 討 論

本研究采用雙波長(zhǎng)分光光度法[4],其理論基礎(chǔ)是差吸光度和等吸收波長(zhǎng),它采用測(cè)量波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)某個(gè)標(biāo)本溶液,以提高檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度[5]。使用副波長(zhǎng)的目的是有效減少雜散光影響；消除噪聲干擾及降低標(biāo)本脂濁、黃疸和溶血等干擾[6-7]。全自動(dòng)生化分析儀在整個(gè)反應(yīng)的全程監(jiān)控中,主副波長(zhǎng)同時(shí)監(jiān)測(cè),全過程每點(diǎn)主波長(zhǎng)吸光度值都同時(shí)減去同點(diǎn)副波長(zhǎng)吸光度值,結(jié)合凹面光柵進(jìn)行后分光,分光后的各波長(zhǎng)由8～16個(gè)固定監(jiān)測(cè)器同時(shí)接收,對(duì)其中兩個(gè)波長(zhǎng)的信息用兩個(gè)前置放大器進(jìn)行對(duì)數(shù)放大,進(jìn)而求出其吸光度差。通過分析表1和表2可以看出尿微量清蛋白檢測(cè)同一濃度在添加副波長(zhǎng)前后精密度有較大變化,雖然10、100 mg/L標(biāo)本的批內(nèi)精密度和總精密度,以及200 mg/L標(biāo)本的批內(nèi)精密度標(biāo)本在添加副波長(zhǎng)后仍未達(dá)到廠商規(guī)定的允許不精密度要求,但是添加副波長(zhǎng)前標(biāo)本的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果均明顯高于添加后,說明添加副波長(zhǎng)后相關(guān)的干擾因素得以消除或降低,檢測(cè)值的穩(wěn)定性得以明顯改善。并且無論有無添加副波長(zhǎng),不精密度都會(huì)隨著標(biāo)本濃度的增加而減小,即使在添加了副波長(zhǎng)之后,濃度在10、100 mg/L及部分200 mg/L的標(biāo)本精密度驗(yàn)證結(jié)果仍然高于廠商聲明的標(biāo)準(zhǔn),說明該試劑在中低濃度,尤其低濃度區(qū)間的檢測(cè)值穩(wěn)定性較差。此外,正常的尿微量清蛋白反應(yīng)曲線一般比較平滑,無明顯跳點(diǎn)。而在加入副波長(zhǎng)之前,分別加入R1試劑、尿液標(biāo)本及R2試劑后均存在明顯的跳點(diǎn),說明在加入R1和R2之后均存在一個(gè)明顯的干擾。而在添加副波長(zhǎng)之后,這兩個(gè)跳點(diǎn)均消失,曲線平滑,說明干擾被消除或有效降低。

由于尿微量清蛋白的允許不精密度要求無可供參考的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),因此,總精密度可參考衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)臨檢中心的1/3室間質(zhì)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)(允許總不精密度誤差TEa)作為總允許不精密度要求[8],批內(nèi)精密度參考1/4TEa,這樣也能夠表明該項(xiàng)目的室內(nèi)質(zhì)量控制監(jiān)測(cè)項(xiàng)目允許不精密度要求符合質(zhì)量目標(biāo)。2018年臨床檢驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃尿微量清蛋白的允許總誤差為30%,因此,尿微量清蛋白的總精密度應(yīng)<10%,批內(nèi)精密度應(yīng)<7.5%,本研究發(fā)現(xiàn)添加副波長(zhǎng)前200 mg/L標(biāo)本的總精密度，以及400 mg/L的批內(nèi)精密度和總精密度均符合本實(shí)驗(yàn)室的參考允許不精密度的要求。而添加副波長(zhǎng)后100、200、400 mg/L尿液標(biāo)本的批內(nèi)精密度及總精密度均符合本實(shí)驗(yàn)室參考的允許不精密度的要求,表明除低濃度外,部分標(biāo)本雖未通過廠商聲明的允許不精密度,但并未超出本實(shí)驗(yàn)室的允許不精密度標(biāo)準(zhǔn),而部分標(biāo)本未通過精密度驗(yàn)證的原因有待進(jìn)一步研究,可能是儀器造成的,因?yàn)樵谏治鰞x上進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)定,其不精密度可能比在特定蛋白儀上要大,但不排除部分國(guó)產(chǎn)試劑精密度性能指標(biāo)可能存在虛標(biāo)。除此以外,本研究還發(fā)現(xiàn)隨著尿微量清蛋白水平的增加,尤其是濃度在200 mg/L以上的標(biāo)本,不精密度值在添加副波長(zhǎng)前后的變化明顯小于低濃度區(qū)域,表明副波長(zhǎng)對(duì)低濃度標(biāo)本精密度的影響大于高濃度。