劉秀卿，王革非，李卓成，黃磊

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣東汕頭 515041；2.深圳市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518035)

·臨床檢驗技術(shù)研究·

PCR-反向點雜交法在外陰陰道念珠菌病診斷及白念珠菌耐藥基因突變檢測中的應(yīng)用

劉秀卿1,2，王革非1，李卓成2，黃磊2

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣東汕頭 515041；2.深圳市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518035)

目的 評價PCR-反向點雜交法用于念珠菌菌種鑒定及白念珠菌耐藥基因突變檢測的應(yīng)用價值。方法 收集念珠菌性陰道炎患者及體檢健康婦女分泌物各285份和50份。用生物梅里埃酵母菌鑒定卡進行菌種鑒定，用最低抑菌濃度(MIC)法(鄭州安圖真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑)進行藥敏試驗；采用PCR-反向點雜交法(深圳亞能念珠菌菌種鑒定及白念珠菌耐藥基因突變檢測試劑)進行菌種鑒定和耐藥基因突變檢測；采用PCR及測序方法進行耐藥基因的檢測。分別以培養(yǎng)鑒定法、MIC法、核酸序列測定法為對比方法，評價PCR-反向點雜交法念珠菌菌種鑒定及白念珠菌耐藥基因突變檢測的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性。結(jié)果 與培養(yǎng)鑒定法相比，PCR-反向點雜交法檢測6種念珠菌菌種的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和總符合率分別為95%、96%、96%、98%、97%以上，2種方法檢測6種念珠菌(白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和季也蒙念珠菌)結(jié)果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為0.44、0、0、0、0和0，P均>0.05)，一致性較好(Kappa均>0.9)。與MIC法相比，PCR-反向點雜交法檢測白念珠菌耐藥的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和總符合率分別為98%、88%、98%、88%和96%，2種方法檢測結(jié)果的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.17，P>0.05)，一致性較好(Kappa>0.8)。PCR-反向點雜交法與核酸序列測定法相比，對6種白念珠菌耐藥基因突變位點的檢測結(jié)果完全一致。結(jié)論 PCR-反向點雜交法在念珠菌菌種鑒定及白念珠菌耐藥基因突變檢測上與培養(yǎng)鑒定法以及核酸序列測定法的一致性高，比傳統(tǒng)檢測方法更早期更快速，可應(yīng)用于外陰陰道念珠菌病(VVC)的輔助診斷。

外陰陰道念珠菌??；白念珠菌；PCR-反向點雜交法；ERG11點突變

由念珠菌感染引起的外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)在各年齡段育齡婦女中普遍存在，約75%以上的女性一生中患過一次[1-2]。其病原菌主要包括白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和季也蒙念珠菌。不同念珠菌對抗真菌藥物的敏感性相差甚遠[3-4]。隨著唑類藥物的普及使用，白念珠菌對唑類藥物的耐藥率呈逐年升高趨勢[3-4]。目前念珠菌菌種鑒定和白念珠菌的耐藥檢測方法均在念珠菌純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進行，耗時較長。因此，臨床急需建立一種簡便、快速、敏感、特異的早期診斷、鑒別念珠菌種及獲得耐藥信息的方法。亞能公司采用PCR-反向點雜交法，將PCR擴增產(chǎn)物與包含探針陣列的膜條進行分子雜交，通過膜條顯色來判斷念珠菌種類及與白念珠菌耐藥相關(guān)ERG11基因6個位點的突變。通過設(shè)立內(nèi)控(internal control，IC)及UNG酶防污染體系，消除可能的假陰性和假陽性。本研究以培養(yǎng)鑒定法為金標(biāo)準(zhǔn)，評價PCR-反向點雜交法在菌種鑒定的敏感性和特異性；以最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)法及核酸序列測定法為對比方法，評估其檢測白念珠菌耐藥基因突變的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2015年9至11月深圳市第二人民醫(yī)院婦科門診285例念珠菌性外陰陰道炎患者和50例體檢健康婦女陰道分泌物，年齡18～59歲，平均年齡33歲。VVC診斷依據(jù)[5]：外陰潮紅瘙癢、水腫疼痛、凝乳樣或豆腐渣樣的異常陰道分泌物增多；白帶常規(guī)鏡檢檢出霉菌。需在月經(jīng)來潮5 d后取樣，取樣前2天內(nèi)不作陰道沖洗，不用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥物，性生活后、因儀器或人為因素導(dǎo)致無法完成整個試驗過程的樣本剔除。陰道分泌物樣本在室溫放置不超過8 h，2～8 ℃保存不超過1周，-20 ℃以下保存不超過3個月。本研究經(jīng)深圳市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 核酸提取試劑盒、YN-H16雜交儀、念珠菌菌種鑒定及白念珠菌耐藥基因突變檢測試劑盒(深圳亞能生物公司)；Vitek 2全自動微生物鑒定儀及配套酵母菌鑒定卡(法國生物梅里埃公司)；真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒(MIC法，鄭州安圖生物公司)；HeMa9600核酸擴增儀(珠海黑馬公司)；沙氏瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物公司)。

1.3 念珠菌培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗 將分泌物接種沙氏瓊脂培養(yǎng)基，采用Vitek 2全自動細菌鑒定儀及配套酵母菌鑒定卡進行鑒定；采用真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑盒進行藥敏測定，藥物種類包括克霉唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、制霉菌素、5-氟胞嘧啶、伏立康唑、益康唑、咪康唑、兩性霉素B。參照CLSI M27-A3判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：克霉唑≥8 μg/mL、氟康唑≥64 μg/mL、酮康唑≥8 μg/mL、伊曲康唑≥1 μg/mL、制霉菌素≥8 μg/mL、5-氟胞嘧啶≥32 μg/mL、伏立康唑≥4 μg/mL、益康唑≥8 μg/mL、咪康唑≥8 μg/mL、兩性霉素B≥2 μg/mL為耐藥(R)。以上操作均參照儀器及試劑說明書進行。

1.4 PCR-反向點雜交法 將分泌物樣本按核酸提取試劑盒說明，用柱提法直接提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。取待測樣本DNA 4 μL，分別加入配制好的擴增反應(yīng)液中，PCR擴增反應(yīng)條件如下：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。反向點雜交：將包被特異性探針的雜交膜放入雜交儀中，通過反向點雜交檢測擴增變性產(chǎn)物，采用辣根過氧化物酶標(biāo)顯色。膜條上各位點代表的念珠菌種類有白念珠菌(CA)、光滑念珠菌(CG)、熱帶念珠菌(CT)、近平滑念珠菌(CP)、克柔念珠菌(CK)和季也蒙念珠菌(Cgu)；白念珠菌野生型探針132W、405W、467W、471W、464/465W，突變型探針Y132H、S405F、R467K、I471T、G464S、G465S；IC為膜條內(nèi)控點。結(jié)果判斷：檢測結(jié)果陽性點呈藍色，當(dāng)只有IC位點顯色，表明被檢樣本中無念珠菌DNA或者樣本中待檢測的念珠菌DNA含量在本試劑的檢測范圍之外(試劑檢測下限為1.0×104copies/mL)。

1.5 PCR測序法 采用Primer Premier 5.0軟件，依據(jù)132～471位點全野生序列(GenBank: KM881482.1)設(shè)計2對引物。405～471位點對應(yīng)的引物為ERG-F1(5′-TATGACGGTTTATTTAGGTC- 3′)、ERG-R1(5′-GCCAATGTTATGAAAACTC-3′)，片段大小為446 bp；132位點對應(yīng)的引物為ERG-F2(5′-CTCTTAGAATGCATATGCCA-3′)、ERG-R2(5′-TGCCTGACCCTGATTATAG-3′)，片段大小為211 bp。引物由英濰捷基(上海)公司合成。取1.4中提取的樣本DNA作為模板。PCR反應(yīng)體系50 μL：ddH2O 29.9 μL，10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dN(U)TP(25 mmol/L)0.4 μL，dUTP(100 mmol/L)0.1 μL，上、下游引物(100 μmol/L)各0.2 μL，UNG(1 U/μL)0.2 μL，Taq酶(5 U/μL)2 μL，DNA模板8 μL。PCR擴增反應(yīng)條件與PCR-反向點雜交法相同。擴增后產(chǎn)物由英濰捷基(上海)公司進行序列測定。與全野生序列在DNAMAN軟件中進行比對，并確定突變位點信息。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 17.0軟件進行。采用四格表進行分析，與培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗相比，評價PCR-反向點雜交法的敏感性、特異性、總符合率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值并進行配對卡方(χ2)檢驗與Kappa檢驗；評價PCR-反向點雜交法與核酸序列測定法的陽性符合率、陰性符合率、總符合率并進行配對卡方(χ2)檢驗與Kappa檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以Kappa>0.8說明2種方法檢測結(jié)果的一致性程度高。

2 結(jié)果

2.1 PCR-反向點雜交法中菌種鑒定與培養(yǎng)鑒定法

結(jié)果比較 培養(yǎng)鑒定法檢出285例念珠菌，以白念珠菌為主，為178株(62.46%)，其次為光滑念珠菌28株(9.82%)，熱帶念珠菌23株(8.07%)，季也蒙念珠菌11株(3.86%)，克柔念珠菌和近平滑念珠菌各10株(3.51%)，其他念珠菌25株(8.77%)。PCR-反向點雜交法檢測出262例念珠菌，菌種分布為白念珠菌181例，光滑念珠菌28例，熱帶念珠菌22例，季也蒙念珠菌11例，克柔念珠菌和近平滑念珠菌各10例。其中有9例白念珠菌鑒定2種方法不相符，見表1。另有1例培養(yǎng)鑒定為熱帶念珠菌，而PCR-反向點雜交法檢測陰性。50例體檢健康婦女標(biāo)本培養(yǎng)鑒定法和PCR-反向點雜交法的檢測結(jié)果均為陰性。PCR-反向點雜交法對6種念珠菌菌種鑒定的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和總符合率均為95%以上，見表2。2種檢測方法在6種念珠菌(CA、CT、CP、CK、CG和Cgu)菌種鑒定上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為0.44、0、0、0、0和0，P均>0.05)；Kappa值分別為0.946、0.976、1.0、1.0、1.0和1.0。

表1 PCR-反向點雜交法和培養(yǎng)鑒定法在白念珠菌菌種鑒定結(jié)果比較

PCR?反向點雜交法 培養(yǎng)鑒定法 陽性陰性合計陽性1756181陰性3151154合計178157335

表2 PCR-反向點雜交法與培養(yǎng)鑒定法比較的菌種鑒定效能分析

2.2 PCR-反向點雜交法檢測白念珠菌耐藥突變與白念珠菌藥敏結(jié)果比較 在培養(yǎng)鑒定法的檢出178例白念珠菌感染臨床樣本中，PCR-反向點雜交法檢出152例有耐藥突變基因；MIC法檢出152例對唑類藥物耐藥(白念珠菌對氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑、益康唑、咪康唑的耐藥率分別為8.6%、2.5%、50.6%、9.9%、76.0%、70.5%，一種唑類藥物耐藥即統(tǒng)計為耐藥樣本)。其中有6例2種方法的結(jié)果不相符，見表3。PCR-反向點雜交法檢測白念珠菌耐藥突變的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和總符合率分別為98.0%、88.5%、98.0%、88.5%、96.6%，2種檢測方法在白念珠菌耐藥性檢測上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.17，P=1.0)；Kappa值為0.865。

表3 PCR-反向點雜交法檢測白念珠菌耐藥突變基因與藥敏結(jié)果比較

PCR?反向點雜交法MIC法耐藥敏感合計耐藥1493152敏感32326合計15226178

2.3 PCR-反向點雜交法在白念珠菌耐藥突變基因檢測與核酸序列測定的結(jié)果比較 335例臨床樣本經(jīng)PCR-反向點雜交法共檢出156例白念珠菌耐藥基因突變樣本，包括Y132H突變107例，S405F突變11例，G464S突變15例，G465S突變24例，R467K突變12例，I471T突變11例，其中包含24例雙耐藥基因突變樣本。核酸序列測定結(jié)果與PCR-反向點雜交法的結(jié)果完全一致。50例健康體檢婦女標(biāo)本核酸序列測定和PCR-反向點雜交法均未檢出耐藥突變基因。6種白念珠菌耐藥基因突變位點檢測的總符合率為100%。

3 討論

在培養(yǎng)法檢出285株念珠菌中白念珠菌占比最高(62.46%)，表明白念珠菌仍然是VVC中最常見的病原菌。唑類藥物是治療白念珠菌感染的主要藥物，其作用靶酶是羊毛甾醇14α-去甲基化酶，該酶由ERG11基因編碼，是麥角甾醇合成通路中關(guān)鍵靶酶。與唑類耐藥相關(guān)的突變類型主要是Y132H、S405F、G464S、G465S、R467K和I471T[7]。本次藥敏結(jié)果顯示白念珠菌對益康唑、咪康唑的耐藥率高達70%以上，顯著高于國內(nèi)外的報道[3-4]，可能與選取的標(biāo)本類型、唑類抗真菌藥的經(jīng)驗性用藥及患者預(yù)防性使用藥物有關(guān)。與生物梅里埃酵母菌鑒定卡菌種鑒定結(jié)果相比，PCR-反向點雜交法在6種念珠菌菌種鑒定的敏感性、特異性均達95%以上。2種念珠菌菌種檢測試劑檢出率無明顯差別(Kappa均大于0.9)，一致性較好。其中3例培養(yǎng)鑒定為白念珠菌和1例培養(yǎng)鑒定為熱帶念珠菌，而PCR-反向點雜交法鑒定均為陰性，可能因為雜交探針覆蓋的范圍存在堿基多態(tài)性；還有6例PCR-反向點雜交法鑒定白念珠菌，而培養(yǎng)鑒定陰性，可能因為PCR-反向點雜交法的靈敏度高于培養(yǎng)，或者患者近期使用過抗真菌藥物而產(chǎn)生干擾，又或者取樣的菌為死菌故培養(yǎng)不出。

PCR-反向點雜交法與真菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏試劑(MIC法)藥敏檢測結(jié)果相比，敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和總符合率均達到88%以上，2種試劑盒檢測結(jié)果一致性較好(Kappa>0.8)。PCR-反向點雜交法檢測出白念珠菌耐藥突變基因以Y132H為主。178例白念珠菌中有3例PCR-反向點雜交法檢出耐藥突變基因，而MIC法敏感，可能由于方法學(xué)差異導(dǎo)致；另外3例MIC法耐藥，而PCR-反向點雜交法未檢出耐藥突變基因，可能耐藥雜交探針覆蓋的范圍存在堿基多態(tài)性，也可能由于造成菌株耐藥非麥角甾醇合成通路中關(guān)鍵靶酶改變引起，抑或由于編碼藥物外排泵基因表達增加或是生物被膜形成導(dǎo)致?；驒z測與MIC法的符合率達到96%，表明耐藥突變基因檢測與唑類耐藥表型檢測具有較好的相關(guān)性。由于檢測出雙耐藥突變基因的例數(shù)較少，無法分析雙耐藥突變基因?qū)е碌哪退幮允欠癖葐文退幫蛔兓驈?，有待擴大樣本量的研究。PCR-反向點雜交法與核酸序列測定檢測結(jié)果完全一致，驗證了PCR-反向點雜交法在白念珠菌耐藥突變基因檢測的高度準(zhǔn)確性。

PCR-反向點雜交法從DNA提取到PCR產(chǎn)物雜交直至出報告，僅需5 h。與傳統(tǒng)檢測方法相比，本方法具有敏感性及特異度高、不易受干擾、檢測耗時少等特點。但該方法只能鑒定6種常見念珠菌以及檢測白念珠菌耐藥基因突變。由于念珠菌屬于女性陰道內(nèi)的條件致病菌，只有當(dāng)大量繁殖才會導(dǎo)致VVC，如果無臨床癥狀只是培養(yǎng)陽性并不能診斷為VVC，故試劑檢測下限為1.0×104copies/mL，菌量少時檢測不出，可避免不必要的用藥。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Application of PCR-reverse dot blot hybridization in the diagnosis of vulvovaginal candidiasis and the detection ofCandidaalbicansdrug-resistant genes

LIUXiu-qing1,2,WANGGe-fei1,LIZhuo-cheng2,HUANGLei2

(1.DepartmentofMicrobiologyandImmunology,MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou515041,Guangdong; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,theSecondPeople′sHospitalofShenzhen,Shenzhen518035,Guangdong,China)

Objective To evaluate the application value of PCR-reverse dot blot hybridization in the identification ofCandidaand the detection ofCandidaalbicansdrug-resistant genes. Methods The vaginal secretion samples from 285 patients with candidal vaginitis and 50 healthy women were collected. The identification ofCandidaspecies and their drug susceptibility were detected by the bioMérieux Yeast identification cards and MIC method(Zhengzhou Antu kit), respectively. The identification ofCandidaspecies and the mutation ofCandidaalbicans, drug-resistant genes were also detected by the Shenzheng Yaneng test kit(PCR-reverse dot blot hybridization). The drug-resistant genes were also identified by PCR and nucleic acid sequencing. Based on the culture identification， MIC method and nucleic acid sequencing as the contrast methods, the sensitivity, specificity and accuracy of PCR-reverse dot blot hybridization in the identification ofCandidaspecies and the mutation detection ofCandidaalbicansdrug-resistant genes were evaluated. Results Compared with the bioMérieux Yeast identification method, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and total coincidence rate of PCR-reverse dot blot hybridization for detecting six kinds ofCandidaspecies, includingCandidaalbicans,Candidaglabrata,Candidatropicalis,Candidaparapsilosis,CandidakruseiandCandidaguilliermondii, were above 95%, 96%, 96%, 98% and 97%, respectively. There was no significant difference in detecting six kinds ofCandidaspecies between the two methods(χ2=0.44, 0, 0, 0, 0 and 0, respectively,P>0.05), and there was good consistency between them(Kappa>0.9). Compared with the MIC method, the sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value and total coincidence rate of PCR-reverse dot blot hybridization for detecting the drug resistance ofCandidaalbicanswere 98%, 88%, 98%, 88% and 96%, respectively. There was no significant difference in detecting the drug resistance ofCandidaalbicansbetween the two methods(χ2=0.17,P>0.05), and there was good consistency between them(Kappa>0.8). The results of PCR-reverse dot blot hybridization in detecting the mutation sites of six kinds ofCandidaalbicansdrug-resistant genes were 100% of coincidence with that of the nucleic acid sequencing method. Conclusion The PCR-reverse dot blot hybridization has high consistency with the culture method and the nucleic acid sequencing method in the identification ofCandidaspecies and the mutation detection ofCandidaalbicansdrug-resistant genes, which is more early and rapid than the traditional detection methods, and may be applied to the auxiliary diagnosis of vulvovaginal candidiasis(VVC).

vulvovaginal candidiasis;Candidaalbicans; PCR-reverse dot blot hybridization; ERG11 mutation

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.04

劉秀卿，1981年生，女，主管技師，大學(xué)本科，主要從事分子生物學(xué)臨床研究。

王革非，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師， E-mail: gefeiwang@stu.edu.cn。

R446.5

A

2017-03-31)