姚國強，張雪梅，高志敏，趙燕霞，孫天松，張和平*

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業(yè)部奶制品加工重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

Lactobacillus reuteri IMAU10240增殖培養(yǎng)基及高密度培養(yǎng)工藝優(yōu)化

姚國強，張雪梅，高志敏，趙燕霞，孫天松，張和平*

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業(yè)部奶制品加工重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

Lactobacillus reuteri IMAU10240（L. reuteri IMAU10240）是一株具有潛在益生特性的乳酸菌，為實現產業(yè)化應用，對其培養(yǎng)工藝進行優(yōu)化以提高其活菌數。本研究以MRS培養(yǎng)基為基礎，通過單因素篩選試驗、正交試驗和響應面優(yōu)化試驗對該菌株的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。通過實驗確定L. reuteri IMAU10240最適培養(yǎng)基：蔗糖100.00 g/L，大豆蛋白胨13.25 g/L，酵母粉8.84 g/L，酵母蛋白胨13.25 g/L，Na2HPO419.85 g/L，檸檬酸2.58 g/L，MnSO4·5H2O 0.12 g/L，MgSO4·7H2O 0.40 g/L，甘油2.76 g/L，吐溫-80 1.00 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.50 g/L。初始pH 6.5，通入氮氣37 ℃恒pH 5.5培養(yǎng)7～8 h。利用優(yōu)化好的配方工藝進行5 L/50 L/200 L發(fā)酵罐的小試及中試試驗，驗證L. reuteri IMAU10240的發(fā)酵工藝，活菌數為7.57×109CFU/mL，凍干菌粉活菌數為2.59×1011CFU/g，可以進行生產驗證。

羅伊氏乳桿菌；增殖培養(yǎng)基；高密度培養(yǎng)

羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）廣泛存在于酸面團、肉和奶等發(fā)酵食品中以及人與動物的胃腸道中[1-4]。L. reuteri具有降膽固醇、改善和調節(jié)腸道菌群、提升機體免疫力、抑制致病菌和腐敗菌（羅伊氏菌素）等功能[5-6]，可廣泛應用于奶酪和酸奶等奶制品、肉制品及功能性食品中。美國食品和藥品管理協(xié)會在1989年已將其列為安全的微生物菌種。我國衛(wèi)生部也于2010年將其納入了《可用于食品的菌種名單》，2014年批準L. reuteri DSM17938用于嬰幼兒食品。

乳桿菌屬作為益生菌被廣泛用來預防和治療斷奶幼畜的腹瀉癥狀，并且是替代抗生素促進家畜生長的一種有效手段[7-8]。研究發(fā)現L. reuteri能夠有效促進斷奶仔豬生長、降低死亡率，促進仔豬腸絨毛發(fā)育，有助于完善新生仔豬的腸黏膜屏障功能；緩減低溫對禽類的生長抑制，增加體重且降低死亡率；2015年我國學者完成了可用于仔豬健康養(yǎng)殖的L. reuteri 15007全基因組序列分析[9-13]。1989年美國食品藥物管理局和美國飼料公定協(xié)會公布了L. reuteri可用于飼料生產，2013年我國農業(yè)部也將其列入《飼料添加劑品種目錄（2013）》，允許在各種動物養(yǎng)殖中使用。

L. reuteri IMAU10240分離自內蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗大山羊糞便，L. reuteri IMAU10240對胃液和膽鹽有較好的耐受力[14]。隨著L. reuteri在食品和微生態(tài)制劑領域研究的逐漸深入，其應用前景光明。本研究主要目的是對L. reuteri IMAU10240培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝進行優(yōu)化，以實現其富集培養(yǎng)，為該菌的后續(xù)工業(yè)化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L. reuteri IMAU10240由內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室乳酸菌菌種庫保藏和提供。

蔗糖 中糧屯河股份有限公司；大豆蛋白胨北京奧博星生物技術有限公司；酵母粉、酵母蛋白胨安琪酵母股份有限公司；Na2HPO4、MnSO4江蘇科倫多食品配料有限公司；檸檬酸 濰坊英軒實業(yè)有限公司；MgSO4萊州市萊玉化工有限公司；吐溫-80廣東潤華化工有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽 寧波海碩生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1112C潔凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；UV-1700型分光光度計 日本島津株式會社分析儀器部；FE20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology公司；GUJS-5L×3/GUJS-50L-50L-200L-200L全自動機械攪拌發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設備技術有限責任公司；Lyo-5（CIP）真空冷凍干燥機東富龍科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

MRS培養(yǎng)基配方：植物蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 g，K2HPO42 g，醋酸鈉5 g，檸檬酸鈉水合物2 g，MgSO4·7H2O 200 mg，MnSO4·5H2O 54 mg，蒸餾水1 000 mL。調節(jié)pH 6.5， 121 ℃滅菌15 min。

將于-80 ℃保存的L. reuteri IMAU10240按照2%（V/V）的比例接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h活化1 代；將第1代活化液按照2%的比例接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.3.2 培養(yǎng)基成分篩選

以L. reuteri IMAU10240為研究對象，在MRS培養(yǎng)基的基礎上，使用多種碳源和氮源替代MRS培養(yǎng)基中原有的碳、氮源，配制新的培養(yǎng)基進行篩選并確定碳氮總量和比例。在上述優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上，分別加入不同含量及種類的常用緩沖鹽體系、微量元素、生長因子物質等，通過測定菌體密度確定不同物質對L. reuteri IMAU10240生長促進作用。培養(yǎng)基成分篩選時，三角瓶裝液量為60%，接種完成后置于厭氧罐中靜止培養(yǎng)，創(chuàng)造厭氧環(huán)境。

1.3.3 培養(yǎng)基成分比例優(yōu)化

確定后的碳源、氮源和緩沖鹽各組成分，通過Design-Expert 7.0軟件，根據Box-Behnken設計原理，設計三因素三水平共計17 個點的響應面分析試驗，其中12 個是析因點，用來估計誤差的零點試驗重復5 次，以菌體密度為響應值，碳源含量（X1）、氮源含量（X2）、緩沖鹽含量（X3）為自變量，試驗因素及水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.3.4 靜態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

研究不同溫度、pH值和接種量對L. reuteri IMAU10240生長情況的影響，通過測定菌體密度和活菌數確定L. reuteri IMAU10240的最佳靜態(tài)培養(yǎng)條件。用優(yōu)化培養(yǎng)基在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)L. reuteri IMAU10240，繪制L. reuteri IMAU10240生長曲線。以L. reuteri IMAU10240在MRS培養(yǎng)基中的生長情況為對照。

1.3.5 高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

確定最優(yōu)靜態(tài)培養(yǎng)條件的基礎上，采用5 L液體發(fā)酵罐對L. reuteri IMAU10240的高密度發(fā)酵工藝條件進行單因素優(yōu)化。其中，選取對高密度發(fā)酵條件影響顯著的因素，如發(fā)酵恒pH值和氣體環(huán)境等進行優(yōu)化，以最終收獲的發(fā)酵液中活菌數作為高密度發(fā)酵工藝的優(yōu)化指標。發(fā)酵罐裝液量為罐容積的60%（3 L培養(yǎng)基/5 L發(fā)酵罐），攪拌速率80 r/min，流加25%的氨水控制恒pH值，罐壓0.03～0.05 MPa。

1.3.6 中試生產

在200 L×2液體發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵，對優(yōu)化后的高密度發(fā)酵工藝進行驗證，同時為其大規(guī)模工業(yè)化生產提供基礎數據。在進行200 L放大中試時，對生產中的發(fā)酵液活菌數、菌泥量、發(fā)酵時間、耗堿量及凍干粉活菌數等生產特性進行對比研究。

1.3.7 菌體生長情況及生產特性檢測

菌體密度的測定：使用分光光度計，以蒸餾水為空白對照組，以接菌后發(fā)酵液為實驗組，測定在600 nm波長處的吸光度并記錄結果。

活菌數的測定：將待測發(fā)酵液和凍干菌粉等樣品用滅菌的磷酸鹽緩沖溶液將樣品按10 倍梯度稀釋至一定倍數，取1 mL稀釋液用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注平板，37 ℃厭氧48 h后計菌落總數，每個梯度4 個平行值，結果以CFU/mL或CFU/g表示。

pH值測定：取3 份平行樣品在室溫條件下，用FE20型精密pH計直接測量。

1.4 數據處理

響應面設計采用Design-Expert軟件進行設計與分析，其他數據采用DPS和Origin進行數據分析和圖表處理。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的篩選

2.1.1 碳源和氮源的篩選

表 2L. reuteri IMAU10240在不同碳氮源培養(yǎng)基中的菌體密度（A600nm）Table 2 Absorbances of L. reuteri IMAU10240 grown with different carbon and nitrogen sources

表 2L. reuteri IMAU10240在不同碳氮源培養(yǎng)基中的菌體密度（A600nm）Table 2 Absorbances of L. reuteri IMAU10240 grown with different carbon and nitrogen sources

注：同列肩標字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

碳源（2.0%）A600nm氮源（2.5%）A600nm果糖2.122±0.009c大豆蛋白胨6.612±0.078a低聚果糖1.650±0.009c示蛋白胨5.447±0.027b海藻糖1.013±0.009d乳清蛋白粉4.789±0.078e棉子糖5.563±0.063b酪蛋白胨3.463±0.128d水蘇糖7.214±0.161a酵母蛋白胨7.094±0.037a葡萄糖5.972±0.052b酵母粉7.099±0.011a菊粉2.065±0.030c牛肉膏1.878±0.290f乳糖5.834±0.084b魚蛋白胨5.461±0.106b麥芽糖7.809±0.077a胰蛋白胨3.849±0.029c蔗糖7.405±0.020a牛肉蛋白胨1.604±0.122g空白對照1.674±0.007d空白對照0.520±0.048h

表2顯示，L. reuteri IMAU10240對麥芽糖、蔗糖和水蘇糖的利用能力最強，這與劉金玲等[15]對羅伊乳桿菌增殖培養(yǎng)基中碳源優(yōu)化的結論相一致；其次為乳糖、葡萄糖和棉籽糖；果糖、菊粉和低聚果糖利用能力較弱；添加麥芽糖、蔗糖和水蘇糖的實驗組吸光度與以葡萄糖為碳源的MRS培養(yǎng)基、空白對照相比有顯著差異（P＜0.05）。故采用單因素試驗篩選出的碳源物質為麥芽糖、水蘇糖和蔗糖，但三者之間無顯著性差異，因考慮到成本因素，故在相同情況下選擇蔗糖為最佳碳源。L. reuteri IMAU10240對10 種不同氮源物質的利用情況表明，L. reuteri IMAU10240對酵母粉、酵母蛋白胨和大豆蛋白胨的利用能力最強；其次為魚蛋白胨、示蛋白胨、乳清蛋白粉、酪蛋白胨和胰蛋白胨；牛肉蛋白胨、牛肉膏和脫鹽乳清粉利用能力較弱。以酵母粉、酵母蛋白胨和大豆蛋白胨為單一氮源的實驗組吸光度與以大豆蛋白胨、酵母粉和牛肉膏為復合氮源的MRS培養(yǎng)基相比無顯著差異（P＞0.05），與空白對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。采用單因素試驗篩選出的氮源物質為酵母粉、酵母蛋白胨和大豆蛋白胨，但三者之間無顯著性差異，故需進行復配實驗，正交試驗設計結果見表3。

表3 氮源L（349）正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal array design L49(3) with experimental values of L. reuteri growth for optimization of combinations of three nitrogen sources

由表3可知，3 種氮源物質對羅伊氏乳桿菌生長影響大小依次為大豆蛋白胨、酵母粉和酵母蛋白胨，根據每因素的k值排序可知該3 種氮源的最優(yōu)復配組合為A3B3D3，即大豆蛋白胨1.5%、酵母粉1.0%、酵母蛋白胨1.5%。

2.1.2 培養(yǎng)基碳氮源總量及比例優(yōu)化

碳源與氮源是微生物所需營養(yǎng)和能量的主要物質來源，兩者的添加總量與比列對微生物的生長有重要影響。前期實驗優(yōu)化的基礎上，對碳氮總量及比例進一步優(yōu)化，選取的碳氮總量范圍為4%～8%，碳氮比例依次為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1，結果如圖1所示。

圖1 不同碳氮總量及比例對L. reuteriIMAU10240菌體密度的影響Fig. 1 Effects of total concentration of nitrogen and carbon and carbon/nitrogen ratio on on the absorbance of L. reuteri IMAU10240

由圖1可知，L. reuteri IMAU10240在隨著碳氮總量逐漸遞增的過程中，菌體密度在相應的增加，且差異顯著（P＜0.05）。L. reuteri IMAU10240在碳氮比為2∶1的培養(yǎng)基中生長較好，這種現象在不同碳氮總量的情況下均出現。故確定最佳碳氮比2∶1、碳氮總量8%。

2.1.3 培養(yǎng)基緩沖鹽優(yōu)化

乳酸菌在培養(yǎng)過程中會產酸導致壞境中pH值下降，進而抑制菌體生長，添加適當的緩沖鹽對生長環(huán)境的pH值能起到一定的調節(jié)作用，同時還可以調節(jié)細胞的滲透壓平衡。

表 4L. reuteri IMAU10240在不同緩沖鹽體系下的菌體密度Table 4 Absorbance of L. reiteri IMAU10240 in different buffered salt

表 4L. reuteri IMAU10240在不同緩沖鹽體系下的菌體密度Table 4 Absorbance of L. reiteri IMAU10240 in different buffered salt

注：肩標字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

16.32±0.43gh16.38±0.33gh17.13±0.26cd16.89±0.84deK2HPO4/KH2PO416.84±0.59de17.31±0.23cd17.11±0.08cd16.73±0.44deNa2HPO4/一水檸檬酸18.45±0.21a17.70±0.33bc16.48±0.42fg18.60±0.38a一水檸檬酸/二水檸檬酸鈉17.27±0.30cd15.94±0.21j16.48±0.38fg16.85±0.22deNa2HPO4/KH2PO416.15±0.60ij15.88±0.20j16.24±0.32hi18.24±0.14ab緩沖鹽體系緩沖鹽濃度/（mol/L）0.000.020.040.060.08 Na2HPO4/NaH2PO416.60±0.36ef

由表4可知，當培養(yǎng)基中添加某些特定種類和濃度的緩沖體系時，對菌體生長才有顯著的促進作用。實驗過程發(fā)現當添加0.02 mol/L與0.08 mol/L的Na2HPO4/一水檸檬酸和0.08 mol/L Na2HPO4/KH2PO4作為緩沖鹽時與空白組相比有顯著差異，但三者之間并無顯著性差異（P＞0.05）。故根據數據大小選取濃度為0.08 mol/L的Na2HPO4/一水檸檬酸為L. reuteri IMAU10240培養(yǎng)基的緩沖鹽體系。

2.1.4 微量元素優(yōu)化

微量元素是一類對微生物生長有促進作用，但需要量極其微小的元素。通常是作為某些活性物質的組成成分或者酶的激活劑發(fā)揮作用。本實驗在培養(yǎng)基中加入了不同質量濃度的MnSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O。其對菌體密度的影響如圖2所示。

圖2 微量元素對L. reuteriIMAU10240菌體密度的影響Fig. 2 Effects of different types and concentrations of trace elements on absorbance of L. reuteri IMAU10240

Ibrahim[16]和Hayek[17]等研究發(fā)現添加Mg2+和Mn2+能夠促進L. reuteri MM2-3的α-葡萄糖苷酶活性分別提高113.6%和100.6%，此外，Mg2+和Mn2+能夠分別增加L. reuteri CF2-7F酸性磷酸酶94.7%和70.1%。由圖2可知，添加MnSO4·5H2O組菌體密度與空白組相比有極顯著差異（P＜0.01），這與陳國等[18]對羅伊氏乳桿菌的研究結果相一致，選擇的最佳質量濃度為0.12 g/L；FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和ZnSO4·7H2O的添加與空白組相比無顯著差異（P＞0.05），故不在培養(yǎng)基中添加；考慮到糖酵解的大部分過程中都必須有Mg2+作為輔助因子，所以選擇添加0.40 g/L的MgSO4·7H2O。因此L. reuteri IMAU10240微量元素優(yōu)化結果為：添加0.12 g/L MnSO4·5H2O和0.40 g/L MgSO4·7H2O。

2.1.5 促生長物質優(yōu)化

為促進微生物的生長，通常在培養(yǎng)基中添加一些微生物自身難以合成卻是調節(jié)自身生長或代謝不可缺少的物質。以不添加任何生長因子的培養(yǎng)基作為空白對照，研究添加不同維生素、氨基酸和甘油對L. reuteri IMAU10240菌體密度的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同生長因子對L. reuteriIMAU10240菌體密度的影響Fig. 3 Effect of different growth factors on the absorbance of L. reuteri IMAU10240

圖3 顯示，當培養(yǎng)基中添加不同種類和含量的維生素時，VB1的促進效果高于其他維生素但與空白組相比無顯著變化（P＞0.05）。Santos等[19]研究發(fā)現L. reuteri CRL1098攜帶的基因簇（cbi、cob和hem）在厭氧環(huán)境下能夠調控VB12的生物合成，表明L. reuteri能夠自身合成維生素，這可能跟實驗中菌株添加維生素后菌體無顯著增值有關。添加精氨酸、β-胡蘿卜素、L-半胱氨酸鹽酸鹽作用效果不顯著，但考慮到L-半胱氨酸鹽酸鹽具有緩解氧脅迫的作用所以在優(yōu)化培養(yǎng)基中添加0.50 g/L的L-半胱氨酸鹽酸鹽。

Talarico等[20]指出L. reuteri在代謝碳水化合物的過程中能夠將甘油作為氫受體促進糖代謝，使菌體生長加快，最終獲得較高的菌體細胞產量。在本實驗中當添加濃度為30 mmol/L的甘油時，吸光度發(fā)生極顯著提升。為驗證結果的準確性，以吸光度與活菌數同時作為指標進行實驗，結果如圖4所示。

圖4 甘油對L. reuteri IMAU10240的影響Fig. 4 Effect of glycerol concentration on the absorbance of L. reuteri IMAU10240

菌體密度與活菌數都在添加30 mmol/L甘油時達到最高，之后隨著甘油濃度的增加菌體密度與活菌數均出現下降趨勢。綜上所知，優(yōu)化的培養(yǎng)中添加的促生長物質為0.50 g/L的L-半胱氨酸鹽酸鹽與30 mmol/L的甘油。

2.2 培養(yǎng)基成分響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果

采用Design-Expert軟件中的Box-Behnken試驗設計對已確定的培養(yǎng)基主要成分的含量進行優(yōu)化，以吸光度為評價指標，設計三因素三水平共17 個點的響應面分析。用來估計誤差的零點試驗重復5 次。具體設計及結果見表5。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Box-Behnken experimental design with experimental results

用Design-Expert軟件對上表中的數據進行處理，得到L. reuteri IMAU10240菌體密度與培養(yǎng)基主要的3種成分之間的方程模型為：Y=10.21+0.10X1+1.62X2-

利用軟件對17 個響應值進行顯著性回歸分析，結果顯示二次項和對L. reuteri IMAU10240菌體密度有顯著影響（P＜0.05），交叉項對L. reuteri IMAU10240菌體密度也有一定影響。整體模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05）。該模型的系數R2為0.929 7，R2Adj為0.839 4，說明此方程與試驗的擬合度良好[21]。

2.2.2 響應面分析

由圖5可知，隨著碳源、緩沖鹽含量的增加，菌體密度隨著增大，但當碳源、緩沖鹽含量增大到一定程度后，菌體密度呈現下降趨勢。最大的菌體密度值出現在曲面上，與沿著緩沖鹽、碳源兩者的坐標軸所出現的各自的最大值并不重合，可知緩沖鹽與碳源之間有顯著的交互作用（P＜0.05）。隨著氮源含量的增加，菌體密度先增大，后保持平衡?；貧w分析與響應面圖都顯示碳源與氮源、緩沖鹽與氮源之間交互作用不顯著（P＞0.05）。

對采用響應面法得到的最終培養(yǎng)基中碳源50.86 g/L、氮源35.34 g/L、緩沖鹽22.43 g/L，菌體密度預測值為10.77，為驗證該法所得結果的可靠性，采用優(yōu)化好的培養(yǎng)基配方按2%的接種量接種活化二代的L. reuteri IMAU10240，37 ℃厭氧培養(yǎng)，測定A600nm為11.25。與理論預測值相比無顯著差異（P＞0.05）。因此響應面優(yōu)化得到的數據準確。最終優(yōu)化好的靜態(tài)培養(yǎng)基配方為：蔗糖50.86 g/L，大豆蛋白胨13.25 g/L，酵母粉8.84 g/L，酵母蛋白胨13.25 g/L，Na2HPO419.85 g/L，檸檬酸2.58 g/L，MgSO4·7H2O 0.40 g/L，MnSO4·5H2O 0.12 g/L，甘油2.76 g/L，吐溫-80 1.00 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.50 g/L。

2.3 靜態(tài)培養(yǎng)條件優(yōu)化

培養(yǎng)基成分優(yōu)化完成的基礎上，采用單因素試驗確定L. reuteri IMAU10240的靜態(tài)培養(yǎng)條件。包括培養(yǎng)溫度、初始pH值和接種量，結果如表6所示。

表6 不同靜態(tài)培養(yǎng)條件對L. reuteri IMAU10240菌體密度的影響Table 6 Effect of different static culture conditions on the absorbance of L. reuteri IMAU10240

從表6可以看出，培養(yǎng)條件不同，L. reuteri IMAU10240的菌體密度之間差異顯著（P＜0.05）。最適合的初始pH值為6.5；在所選的溫度范圍內隨著溫度的升高，菌體密度呈現先升后降的趨勢。最適溫度為37 ℃。在初始pH 6.5、培養(yǎng)溫度37 ℃的基礎上對接種量進行優(yōu)化，結果顯示最佳接種量為2%。綜合可知：L. reuteri IMAU10240的最佳靜態(tài)培養(yǎng)條件為初始pH 6.5，接種量2%，37 ℃培養(yǎng)。

2.4 生長曲線繪制

最佳培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件確定的基礎上進行發(fā)酵，不同時間點取樣測定吸光度，繪制生長曲線，如圖6所示。

圖6 不同培養(yǎng)基中L. reuteri IMAU10240的生長曲線Fig. 6 Growth curve of L. reuteri IMAU10240 in different culture media

從圖6可以看出，L. reuteri IMAU10240在兩種培養(yǎng)基中，都是在接種4 h后開始進入對數生長期；兩者相比，L. reuteri IMAU10240在優(yōu)化培養(yǎng)基里菌體密度更高，對數生長期持續(xù)時間更長。菌株L. reuteri IMAU10240與陳國等[18]優(yōu)化的菌株L. reuteri CG001和李文靜等[22]對3株羅伊氏乳桿菌測定的生長曲線相一致。

2.5 高密度培養(yǎng)工藝優(yōu)化

利用5 L×3聯裝全自動機械攪拌發(fā)酵罐在靜態(tài)優(yōu)化的基礎上對上罐培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行進一步的優(yōu)化。

2.5.1 培養(yǎng)基碳源含量優(yōu)化

L. reuteri IMAU10240為異型乳酸發(fā)酵，除生產乳酸外，還產生乙醇、乙酸和CO2等多種產物，產生的ATP也僅為同型乳酸菌產生ATP的一半。相比較而言，異型發(fā)酵乳酸菌需要更多的營養(yǎng)物質提供能量供給，為了使發(fā)酵液具有較高活菌數，增加碳源物質含量，具體結果見圖7。

圖7 碳源物質增加對發(fā)酵液活菌數的影響Fig. 7 Effect of carbon source on the count of viable cells

從圖7可以看出，當碳源含量從50.86 g/L逐漸增加到100.00 g/L時，發(fā)酵液活菌數不斷升高；之后隨著碳源含量的持續(xù)增加，發(fā)酵液活菌數不再升高。Tango等[23]研究發(fā)現，當L. helveticus恒pH值培養(yǎng)時，對碳源的利用速度和需求量明顯增加。由于培養(yǎng)環(huán)境的變化，菌株的生長狀況也發(fā)生著變化，適當提高碳源含量對于L. reuteri IMAU10240恒pH值培養(yǎng)是重要的，故選擇碳源含量為100.00 g/L。

2.5.2 高密度培養(yǎng)恒pH值優(yōu)化

乳酸菌高密度培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的恒pH值的高低對于最終發(fā)酵液的活菌數、菌泥得率以及發(fā)酵的時間均有顯著影響。因此，利用5 L發(fā)酵罐對發(fā)酵液的恒pH值進行了優(yōu)化，如圖8所示。

IMAU10240活菌數及菌體密度的影響Fig. 8 Effect of culture pH on the count of viable cells and absorbance of L. reuteri IMAU10240圖8 發(fā)酵pH值對L. reuteri

培養(yǎng)基初始pH值為6.5，攪拌速度為100 r/min左右，25%的氨水作為中和劑，發(fā)酵溫度37 ℃，停止加堿后采用傾注法計發(fā)酵液中L. reuteri IMAU10240的活菌數并測定吸光度，結果如圖8所示。同一指標不同恒pH值發(fā)酵時，差異極顯著（P＜0.01），所以最佳發(fā)酵恒pH值應為5.5。這與王志林等[24]對L. reuteri LR2最適培養(yǎng)pH 5.5的結果相吻合。此外，Marcia等[25]研究發(fā)現L. reuteri 100-23能夠將谷氨酸鹽轉化為γ-氨基丁酸，從而提高其酸性環(huán)境下的耐受性及發(fā)酵優(yōu)勢。

2.5.3 氣體環(huán)境優(yōu)化

一般認為，乳酸桿菌是一類兼性厭氧菌。研究發(fā)現，CO2、H2和N2構成的氣體環(huán)境適合L. reuteri菌株的生長[26]，因此，本實驗結合具體的實驗條件，選擇混合氣體（V（N2）∶V（H2）∶V（CO2）=80∶10∶10）、N2及空氣3種氣體環(huán)境以選擇最優(yōu)氣體環(huán)境，其結果如圖9所示。

圖 9L. reuteri IMAU10240在不同氣體環(huán)境下培養(yǎng)時的活菌數Fig. 9 Changes in viable cell counts L. reuteri IMAU10240 cultured under different gas environments

如圖9所示，在發(fā)酵罐中通入混合氣體和氮氣，L. reuteri IMAU10240發(fā)酵液活菌數較空氣顯著增高，差異極顯著（P＜0.01），但氮氣和混合氣體之間差異不顯著。由于混合氣體的成本遠高于氮氣，故本實驗最后選擇的氣體環(huán)境是氮氣。

2.6 小試發(fā)酵結果

利用已優(yōu)化好的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行發(fā)酵實驗，驗證及比較高密度發(fā)酵工藝，結果對比如表7所示。

表 7L. reuteri IMAU10240靜態(tài)培養(yǎng)與發(fā)酵罐試驗結果Table 7 Results obtained in static and small-scale fermentor culture of L. reuteri IMAU1024

表7顯示，接種后2 h內菌體處于停滯期，此后氨水消耗速率加快并開始大量產氣，菌體生長進入對數期。7 h后菌體生長處于穩(wěn)定期。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，在5 L發(fā)酵罐中菌體生長速度快、生長周期明顯縮短（時間縮短41.67%），活菌數為7.25×109CFU/mL，是靜態(tài)培養(yǎng)的2.80 倍。

2.7 中試發(fā)酵結果

為了實現L. reuteri IMAU10240的工業(yè)化生產，經過實驗室規(guī)模的高密度培養(yǎng)研究后，在2 個200 L液體發(fā)酵罐中進行L. reuteri IMAU10240的中試研究，并對工業(yè)生產影響較大的指標進行監(jiān)測，結果見表8。

表8 L. reuteri IMAU10240中試試驗結果Table 8 Results obtained in pilot-scale high cell density fermentation of L. reuteri IMAU10240

表8顯示，中試發(fā)酵主要指標（發(fā)酵液活菌數、時間、耗堿量、菌體濕質量和菌粉活菌數）和小試發(fā)酵無明顯差異，中試發(fā)酵液的菌體濕質量低于小試發(fā)酵，這跟L. reuteri IMAU10240發(fā)酵過程中產生較多的胞外多糖，離心得率低有關。Sims等[27]研究發(fā)現L. reuteri 100-23攜帶的果糖基轉移酶基因（tft）能夠將培養(yǎng)基質中的蔗糖轉化為表多糖（β-2,6-果聚糖）；而Bai等[28]研究發(fā)現蔗糖-6-葡萄糖基轉移酶能夠將蔗糖轉化為表多糖（α-葡聚糖）。此外，相比較于其他的乳酸桿菌，L. reuteri IMAU10240產酸量（耗堿量）較低，且在培養(yǎng)的過程中有大量的CO2產生，原因是羅伊氏乳桿菌屬于專性異型乳酸菌，其代謝產物中乳酸產量要比專性和兼性同型乳酸菌低。

本研究中試發(fā)酵液活菌數為7.57×109CFU/mL，制備的凍干菌粉活菌數為2.59×1011CFU/g。國外學者Doleyres等[29]采用分批培養(yǎng)的方式，羅伊氏菌活菌數為1.70×109CFU/mL，王志林等[24]采用改良MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌，活菌數為3.10×109CFU/mL。朱戰(zhàn)波等[30]利用二次正交旋轉組合法優(yōu)化羅伊乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基主成分為大豆蛋白胨5.0%、葡萄糖1.0%、酵母浸粉1.7%和低聚糖0.3%，該培養(yǎng)基氮源含量為6.7%，而培養(yǎng)基成分中氮源的價格最高，也是影響生產成本的主要因素。秦鵬等[31]優(yōu)化的羅伊氏乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖3.09%、酵母粉4.19%和果蔬汁10.03%。本研究獲得的配方和工藝中氮源含量為3.53%，碳源含量為10.00%且為蔗糖，培養(yǎng)基的成本顯著降低；此外無需分批培養(yǎng)，簡化生產工藝、縮短生產周期。綜合上述結論，L. reuteri IMAU10240的增殖培養(yǎng)基及其高密度發(fā)酵工藝適合工業(yè)化生產，可以進行工業(yè)化生產驗證。

3 結 論

本研究以工業(yè)化生產為出發(fā)點，降低培養(yǎng)基成本和簡化生產工藝為目的，對菌株L. reuteri IMAU10240高密度培養(yǎng)配方和工藝進行了優(yōu)化，并進行了中試研究驗證，為工廠化生產該菌株微生態(tài)制劑提供基礎數據。

通過單因素、正交和響應面優(yōu)化試驗確定L. reuteri IMAU10240最適培養(yǎng)基配方：蔗糖100.00 g/L，大豆蛋白胨13.25 g/L，酵母粉8.84 g/L，酵母蛋白胨13.25 g/L，Na2HPO419.85 g/L，檸檬酸2.58 g/L，MnSO4·5H2O 0.12 g/L，MgSO4·7H2O 0.40 g/L，甘油2.76 g/L，吐溫-80 1.00 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.50 g/L。

最優(yōu)發(fā)酵工藝為：初始pH 6.5，37 ℃恒溫培養(yǎng)，通入氮氣，流加氨水控制恒pH 5.5。利用優(yōu)化好的培養(yǎng)基進行5 L/50 L/200 L發(fā)酵罐的小試及中試試驗，驗證了L. reuteri IMAU10240的發(fā)酵工藝，中試發(fā)酵液活菌數為7.57×109CFU/mL，凍干菌粉活菌數為2.59×1011CFU/g，發(fā)酵過程主要監(jiān)控指標穩(wěn)定，可以進行工業(yè)化生產驗證。

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Optimization of Enrichment Medium and High Cell Density Cultivation of Lactobacillus reuteri IMAU10240

YAO Guoqiang, ZHANG Xuemei, GAO Zhimin, ZHAO Yanxia, SUN Tiansong, ZHANG Heping*
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, Key Laboratory of Dairy Products Processing, Ministry of Agriculture, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Lactobacillus reuteri IMAU10240 is a potential probiotic lactic acid bacterium (LAB). This study aimed to achieve high viable counts of L. reuteri IMAU10240 by optimization of the composition of deMan Rogosa Sharpe (MRS) medium and culture conditions for industrialization application of this strain. The optimization was done using one-factorat-a-time method, orthogonal array design and response surface methodology. The optimal medium composition was determined as follows (g/L): sucrose 100.00, soy peptone 13.25, yeast extract powder 8.84, yeast peptone 13.25, Na2HPO419.85, citric acid 2.58, MgSO4·7H2O 0.40, MnSO4·5H2O 0.12, glycerol 2.76, Tween-80 1.00, and L-cysteine hydrochloride 0.50, and the optimal culture conditions were 7–8 h culture at 37 ℃ and constant pH 5.5 under nitrogen atmosphere. In small-scale and pilot-scale experiments, the optimized conditions yielded a viable cell count of 7.57 × 109CFU/mL, which increased to 2.59 × 1011CFU/g after lyophilization. The enrichment medium and culture conditions can be further verified in industrial production.

Lactobacillus reuteri; enrichment medium; high cell density fermentation

10.7506/spkx1002-6630-201714015

TS252.1

A

1002-6630（2017）14-0097-09

姚國強, 張雪梅, 高志敏, 等. Lactobacillus reuteri IMAU10240增殖培養(yǎng)基及高密度培養(yǎng)工藝優(yōu)化[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 97-105.

10.7506/spkx1002-6630-201714015. http://www.spkx.net.cn

YAO Guoqiang, ZHANG Xuemei, GAO Zhimin, et al. Optimization of enrichment medium and high cell density cultivation of Lactobacillus reuteri IMAU10240[J]. Food Science, 2017, 38(14): 97-105. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714015. http://www.spkx.net.cn

2016-09-28

國家現代農業(yè)（奶牛）產業(yè)技術體系建設專項（CARS-37）

姚國強（1985—），男，博士研究生，研究方向為乳酸菌發(fā)酵技術及其制劑應用。E-mail：yaoguoqiang1985@163.com

*通信作者：張和平（1965—），男，教授，博士，研究方向為乳酸菌及發(fā)酵乳制品。E-mail：hepingdd@vip.sina.com