崔 青，錢(qián)炳俊，姚曉敏，季順利，魯飛鳳，吳 靜，張建華*

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

納豆激酶基因工程菌的構(gòu)建及酶活力分析

崔 青，錢(qián)炳俊，姚曉敏，季順利，魯飛鳳，吳 靜，張建華*

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240）

納豆激酶由納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）的aprN基因編碼，在體內(nèi)外具有很強(qiáng)的溶解纖維蛋白活性。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增B. subtilis natto的aprN基因，并依據(jù)B. subtilis的密碼子偏好性優(yōu)化了起始30 個(gè)氨基酸的密碼子，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pHT01-aprN。經(jīng)限制性酶酶切、PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證了其編碼的正確性。通過(guò)電擊法將含有強(qiáng)啟動(dòng)子的pHT01-aprN導(dǎo)入B. subtilis，利用氯霉素抗性篩選獲得B.s 168/pHT01-aprN工程菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)最高酶活力為（289.00±3.42） U/mL，是野生菌的3.9 倍，酶活力表達(dá)穩(wěn)定性良好。

納豆激酶；aprN基因；枯草芽孢桿菌；基因工程菌；酶活力

納豆是利用納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）發(fā)酵黃豆制成的豆制品，是日本的一種傳統(tǒng)食品，因其含有的納豆激酶（nattokinase，NK）具有抗血栓作用深受人們喜愛(ài)，已發(fā)展為保健食品。NK是由B. subtilis natto產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶[1]，除在體內(nèi)外有強(qiáng)烈的纖維蛋白溶解活性外，還有促進(jìn)血液流動(dòng)、防血小板凝聚和降血壓等功效[2-3]。1980年，須見(jiàn)洋行博士首次發(fā)現(xiàn)NK[4]，其分子質(zhì)量為27 kD，等電點(diǎn)為8.6±0.3。血栓是引起的心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子之一，嚴(yán)重危害人類健康[5-6]。目前，溶栓劑包括注射類降解藥物（尿激酶、鏈激酶和組織型纖維蛋白原激活劑）和口服類的類組織纖維蛋白酶的蛋白（NK和蚓激酶[7]）兩大類。注射類降解藥物高度依賴體內(nèi)組織纖維蛋白酶原的水平，存在一定毒性，半衰期短且成本高；而NK屬于天然發(fā)酵產(chǎn)物，安全性高，具有體內(nèi)效應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格低廉、有預(yù)防作用及易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，其臨床應(yīng)用已得到美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)可。

提高NK工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)治療血栓疾病有重要意義。采用優(yōu)化啟動(dòng)子和信號(hào)肽、選用蛋白酶缺失的菌株以降低NK降解或者直接改造NK基因序列等技術(shù)手段可以達(dá)到提高NK產(chǎn)量的目的[8-15]。例如Wu Shuming等[8]利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為宿主菌構(gòu)建了NK基因工程菌，實(shí)現(xiàn)了其可溶性表達(dá)并通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子使其酶活力增加了136%。其他細(xì)菌，例如大腸桿菌（Escherichia coli）[9-10]、地衣芽孢桿菌[11]、乳酸鏈球菌[12]和酵母菌[13]等也被作為宿主菌通過(guò)基因工程發(fā)酵生產(chǎn)NK[14]。但這些技術(shù)也存在一些需要解決的問(wèn)題，如在E. coli中表達(dá)出沒(méi)有活性的包涵體；在其他工程菌中NK雖然能夠可溶性表達(dá)，但酶產(chǎn)量低[15-17]，純化回收過(guò)程復(fù)雜[18]，因此工程菌的構(gòu)建策略有待進(jìn)一步優(yōu)化，選擇合適宿主菌株和采用恰當(dāng)?shù)幕蚬こ淌侄螛?gòu)建產(chǎn)NK基因工程菌株成為研究了熱點(diǎn)。

Nishito等[19]已經(jīng)證明，B. subtilis natto屬于B. subtilis的一個(gè)亞種。B. subtilis無(wú)致病性、具備包含轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和分泌等機(jī)制，常常作為工程菌株構(gòu)建載體。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B. subtilis 168含有NK基因序列，但不能表達(dá)有活性的NK?；贓. coli-B. subtilis穿梭質(zhì)粒的表達(dá)載體pHT01可以在B. subtilis中高效表達(dá)重組外源蛋白。但每種生物都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛(ài)，如E. coli、酵母和果蠅中編碼豐度高的蛋白質(zhì)的基因明顯避免低利用率的密碼子[20]。因此，重組蛋白的表達(dá)可能受密碼子利用的影響。本研究采用分子生物學(xué)方法，依據(jù)B. subtilis的基因密碼子偏好性，優(yōu)化aprN基因編碼前30 個(gè)氨基酸的序列，以pHT01為表達(dá)載體，成功構(gòu)建B.s 168/pHT01-aprN，經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)最高酶活力可達(dá)（289.00±3.42）U/mL，酶活力表達(dá)穩(wěn)定性良好。NK中加入6 個(gè)組氨酸標(biāo)記，可采用鎳柱親和層析進(jìn)行純化。本實(shí)驗(yàn)為NK基因工程進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與載體

B. subtilis 168菌株為江南大學(xué)陳衛(wèi)教授惠贈(zèng)；B. subtilis natto和E. coli DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保藏；pMD19-T Simple載體 大連TaKaRa公司；pHT01 美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ和SmaⅠ大連TaKaRa公司；氯霉素、氨芐卡那霉素、蛋白胨、酵母提取物、山梨醇、甘露醇、海藻糖 英國(guó)Oxoid公司；D-Val-Leu-Lys-對(duì)硝基苯胺 上海鼓臣生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂糖。

發(fā)酵培養(yǎng)基A：葡萄糖10 g/L、酵母提取物10 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、1%甘油、2,6-吡啶二羧酸1 mmol/L，pH 7.0～8.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基B：葡萄糖20 g/L、酵母提取物20 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、2%甘油、2,6-吡啶二羧酸1 mmol/L，pH 7.0～8.0。

1.1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上收錄NK基因序列（GI：608796180），依據(jù)宿主菌B. subtitle 168密碼子偏好性（http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon. cgi?species=1423），利用生物軟件Oligo設(shè)計(jì)引物（表1），擴(kuò)增aprN基因并優(yōu)化它的前30個(gè)氨基酸密碼子。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for PCR amplification

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、微量臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Eppendrof公司；電轉(zhuǎn)儀英國(guó)Biochrom公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 擴(kuò)增與優(yōu)化aprN基因

將保藏的B. subtilis 168菌株活化后，按照2%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。目的基因的克隆采用重疊PCR的方法[21]，即以菌液為第1次PCR擴(kuò)增模版，將凝膠電泳驗(yàn)證后的膠回收產(chǎn)物作為第2次PCR擴(kuò)增模版，再以此次膠回收產(chǎn)物為模版進(jìn)行第3次PCR擴(kuò)增。引物依次為F1-R1、F2-R1和F3-R2His，擴(kuò)增并優(yōu)化源于B. subtilis natto的aprN基因。

1.3.2 目的基因克隆和測(cè)序

試劑盒回收并純化第3次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物通過(guò)TA克隆連到質(zhì)粒pMD19-T。pMD19-T載體連接體系（10 μL）：DNA 4.5 μL、pMD19-T 0.5 μL、緩沖溶液Ⅰ5 μL，4 ℃過(guò)夜連接。通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入E. coli感受態(tài)中，涂布Amp抗性平板（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）。提取陽(yáng)性克隆菌落質(zhì)粒DNA，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證，將攜帶pMD19-T∶aprN的質(zhì)粒菌株置于甘油管-80 ℃保存。

1.3.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和BamHⅠ酶切pMD19-T∶aprN，切下的aprN基因片段插入pHT01的SmaⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間（多克隆位點(diǎn)位于啟動(dòng)子和終止子之間），其中EcoRⅤ和SmaⅠ均為平末端酶，經(jīng)T4連接酶可以識(shí)別并連接。通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入E. coli感受態(tài)中，涂布Amp抗性平板（終質(zhì)量濃度100 μg/mL）篩選轉(zhuǎn)化子。提取陽(yáng)性克隆菌落質(zhì)粒DNA，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證后，將攜帶pHT01：aprN的質(zhì)粒菌株置于甘油管-80 ℃保存。1.3.4 B.s 168/pHT01-aprN的構(gòu)建及鑒定

B. subtilis 168的感受態(tài)細(xì)胞制備和電擊轉(zhuǎn)化均參考Xue Gangping[22]的方法。隨機(jī)挑取氯霉素抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落，提取質(zhì)粒DNA，PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證，將攜帶pHT01-aprN的質(zhì)粒菌株置于甘油管-80 ℃保存。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)

取甘油管中B.s 168/pHT01-aprN、B. subtilis natto野生菌和B. subtilis168宿主菌分別以2%接種量接種于LB培養(yǎng)基（含5 μg/mL氯霉素）中，200 r/min、37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。以2%接種量將B.s 168/pHT01-aprN種子液接種于25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基A（含5 μg/mL氯霉素）中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，至OD600nm在0.8～1.0之間，降溫至25 ℃，接入終濃度為0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）。對(duì)照組以2%接種量分別將B. subtilis natto野生菌和B. subtilis 168宿主菌種子液接種于25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基A中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。在不同發(fā)酵時(shí)間同時(shí)取3 種菌液測(cè)定OD600nm和NK酶活力。

1.3.6 NK活力測(cè)定

NK活力分析采用四肽底物法[23]。首先制作對(duì)硝基苯胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制對(duì)硝基苯胺樣品溶液，濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.06、0.08 mmol/L，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度硝基苯胺樣品溶液的OD值，以水作為空白對(duì)照。取發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心1 min，將上清液稀釋成不同濃度作為檢測(cè)樣品液。檢測(cè)方法在文獻(xiàn)[24]基礎(chǔ)上加以改進(jìn)：取100 μL發(fā)酵上清液稀釋一定倍數(shù)與50 μL終濃度為0.5 mmol/L的四肽底物（D-Val-Leu-Lys-對(duì)硝基苯胺）混合并在37 ℃水浴下反應(yīng)1 min，加入75 μL 50%冰醋酸溶液終止反應(yīng)，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)液OD值。NK活力單位被定義為每分鐘釋放1 nmol對(duì)硝基苯胺的NK含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次3 個(gè)平行。

1.3.7 酶活力的影響因素分析

探究2,6-吡啶二羧酸、IPTG、誘導(dǎo)溫度、接種量對(duì)酶活力的影響，以培養(yǎng)基A為發(fā)酵培養(yǎng)基，2,6-吡啶二羧酸濃度設(shè)置為0.5、1.0、2.0 mmol/L；IPTG濃度設(shè)置為：0.2、0.5、1.0 mmol/L；誘導(dǎo)溫度設(shè)置為25、30、37 ℃；接種量設(shè)置為1%、2.5%、5%和7.5%。為提高NK酶活力，確定培養(yǎng)基成分后再將碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽濃度提高1 倍。以B. subtilis natto野生菌和宿主菌B. subtilis168作對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用鄧肯氏多重（Duncan’s multiple range test）比較分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 aprN基因的克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

2.1.1 aprN基因的克隆

圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 Identification of PCR products by agarose gel electrophoresis

利用設(shè)計(jì)的引物依次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定第3次PCR產(chǎn)物，在1 100 bp附近有十分明顯的DNA擴(kuò)增帶，與預(yù)期aprN基因長(zhǎng)度1 125 bp吻合（圖1）。PCR產(chǎn)物序列結(jié)果與NCBI上序列對(duì)比，同源性達(dá)99%。

圖 2aprN基因前30 個(gè)氨基酸密碼子優(yōu)化前后的序列比對(duì)Fig. 2 Sequence comparison of the codons encoding the first 30 amino acids of aprN gene before and after optimization

重組蛋白的表達(dá)可能受密碼子利用的影響，為提高B. subtilis 168中NK的翻譯速率，依據(jù)B. subtilis的密碼子偏好性，優(yōu)化了NK前30 個(gè)氨基酸密碼子，密碼子優(yōu)化前后的序列如圖2所示。經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和BamHⅠ雙酶切，鑒定插入片段與預(yù)期一致，如圖3所示，1 100 bp左右的條帶是目的基因aprN，克隆載體構(gòu)建成功。

圖3 pMD19-T:aprN經(jīng)EcoR Ⅴ/BamHⅠ酶切電泳圖Fig. 3 Electrophoretogram of plasmid pMD19-T:aprN digested by EcoR Ⅴ and BamH Ⅰ

2.1.2 pHT01-aprN重組質(zhì)粒構(gòu)建

圖4 pHT01-aprN重組質(zhì)粒圖Fig. 4 Schematic diagram of pHT01-aprN

pHT01可在細(xì)胞質(zhì)中高水平表達(dá)重組蛋白，其攜帶的啟動(dòng)子是基于強(qiáng)σA-依賴性啟動(dòng)子的B. subtilis groE操縱子，通過(guò)添加乳糖操縱子改造而成的一種高效可控的（IPTG誘導(dǎo)的）啟動(dòng)子。該載體還插入了一個(gè)高效SD序列以及一個(gè)多克隆位點(diǎn)（BamHⅠ、XbaⅠ、AatⅡ、SmaⅠ）。aprN基因信號(hào)肽編碼區(qū)域與SD序列融合以此獲得分泌的重組蛋白。本實(shí)驗(yàn)嘗試采用pHT01載體構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，有望提高NK在B. subtilis 168中翻譯速率并實(shí)現(xiàn)胞外表達(dá)。

經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ/BamHⅠ從pMD19-T:aprN切下的aprN基因片段插入pHT01的多克隆酶切位點(diǎn)BamHⅠ和SmaⅠ之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT01-aprN，如圖4所示。

由圖4可知，pHT01-aprN重組質(zhì)粒的啟動(dòng)區(qū)域包含groE啟動(dòng)子（gra）、lacO操縱子和RBS序列，阻遏蛋白LacI與LacO結(jié)合阻遏轉(zhuǎn)錄起始，乳糖的類似物IPTG可以和LacI產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開(kāi)LacO，從而激活轉(zhuǎn)錄。插aprN基因長(zhǎng)1 125 bp，該質(zhì)粒含有氯霉素表達(dá)區(qū)域，可以氯霉素作為重組質(zhì)粒篩選標(biāo)記。BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)用于后續(xù)鑒定。

圖5 pHT01-aprN經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ酶切電泳圖Fig. 5 Electrophoretogram of plasmid pHT01-aprN digested by BamHⅠand HindⅢ

pHT01-aprN經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切后，切得條帶分別為491、1 101、2 027 bp（圖5A）；圖5B顯示pHT01質(zhì)粒經(jīng)相同酶切后，切得條帶分別為473 bp和2 027 bp。切得條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖4），表明圖5A-2泳道的轉(zhuǎn)化子應(yīng)為陽(yáng)性克隆，該菌株中的質(zhì)粒pHT01上已成功插入aprN基因片段，攜帶pHT01-aprN重組質(zhì)粒的基因工程菌B.s 168/pHT01-aprN構(gòu)建成功。

2.1.3 B.s 168/pHT01-aprN工程菌鑒定

在所有革蘭氏陽(yáng)性菌中，B. subtilis載體因下列原因尤為引人矚目[24]：1）一般認(rèn)為是安全的有機(jī)體；2）可胞外分泌蛋白；3）具備包含轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)折疊和分泌機(jī)制，可對(duì)其進(jìn)行遺傳操作和大規(guī)模發(fā)酵；4）細(xì)胞壁的組成簡(jiǎn)單，只含有肽聚糖和磷壁酸，因此在分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會(huì)混雜有胞被內(nèi)毒素。

圖6 瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 6 Identification of PCR products by agarose gel electrophoresis

pHT01-aprN重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入B. subtilis 168，陽(yáng)性菌落PCR擴(kuò)增圖譜如圖6所示，在1 100 bp附近有明顯的特異性擴(kuò)增條帶，與目的基因相符，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確，證明攜帶pHT01-aprN重組質(zhì)粒的工程菌B.s 168/pHT01-aprN構(gòu)建成功。

2.2 NK酶活力影響因素分析

2.2.1 酶活力測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 NK活力檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 7 Standard curve for NK activity measurement

四肽底物法是測(cè)定NK酶活力的常用方法之一，主要是考察NK水解酰胺鍵的能力檢測(cè)酶活力，具有檢測(cè)快速、方便、靈敏度高的特點(diǎn)。NK活力檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，其回歸方程為y=10.002 0x-0.008 9，R2為0.999 1，有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 IPTG對(duì)NK酶活力的影響

圖8 IPTG濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig. 8 Effects of IPTG concentration on cell growth

圖9 IPTG濃度對(duì)酶活力的影響Fig. 9 Effects of IPTG concentration on enzyme activity

Wang等[25]優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)證明：葡萄糖、K2HPO4·3H2O和MgSO4·7H2O對(duì)B. subtilis natto產(chǎn)NK起關(guān)鍵作用；Berenjian等[23]證明甘油促進(jìn)NK表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[22,24-28]，以酵母提取物為氮源進(jìn)行發(fā)酵。

由圖8、9可知，IPTG濃度對(duì)工程菌細(xì)胞生長(zhǎng)影響不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵45、50 h，在0.5 mmol/L和 1 mmol/L濃度下酶活力差異不顯著（P＞0.05），但兩者與0.2 mmol/L相比差異顯著；發(fā)酵54 h，3 個(gè)濃度差異不顯著（P＞0.05），IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)酶活力相對(duì)最高。乳糖的類似物IPTG起誘導(dǎo)表達(dá)作用的同時(shí)還存在一定毒性，需控制在最適范圍內(nèi)既提高表達(dá)量又不影響菌體生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)選用IPTG濃度為0.5 mmol/L。

2.2.3 2,6-吡啶二羧酸對(duì)NK酶活力的影響

圖10 吡啶二羧酸濃度對(duì)酶活力的影響Fig. 10 Effects of pyridine dicarboxylic acid concentration on enzyme activity

2,6-吡啶二羧酸是存在于芽孢桿菌中的抗菌劑，它可提高滲透壓，有利于維持酶的構(gòu)象，濃度適當(dāng)可提高NK活力[26]，本實(shí)驗(yàn)探究2,6-吡啶二羧酸濃度對(duì)酶活力的影響。由圖10可知，不同2,6-吡啶二羧酸濃度在各時(shí)間段對(duì)酶活力影響差異顯著（P＜0.05）。濃度從0.5 mmol/L增大到1.0 mmol/L時(shí)，主要起促進(jìn)酶活力表達(dá)的作用，酶活力升高。濃度再增加到2.0 mmol/L后起抑制作用，酶活力降低。最終確定2,6-吡啶二羧酸最佳濃度為1 mmol/L。

2.2.4 發(fā)酵液濃度對(duì)NK酶活力的影響

圖11 誘導(dǎo)溫度和培養(yǎng)基濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig. 11 Effects of medium concentration and temperature on cell growth

圖12 25 ℃誘導(dǎo)溫度下培養(yǎng)基濃度對(duì)酶活力的影響Fig. 12 Effects of medium concentration on enzyme activity when the induction temperature was 25 ℃

圖13 30 ℃誘導(dǎo)溫度下培養(yǎng)基濃度對(duì)酶活力的影響Fig. 13 Effects of medium concentration on enzyme activity when the induction temperature was 30 ℃

確定IPTG和2,6-吡啶二羧酸添加量后，為提高NK表達(dá)量和提高菌體濃度，將發(fā)酵培養(yǎng)基濃度提高1 倍，結(jié)果如下：由圖11、12所示，在25 ℃條件下，培養(yǎng)基濃度對(duì)菌體量和酶活力的影響極為顯著（P＜0.01），培養(yǎng)基濃度增加可促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)和酶活力提高。其中發(fā)酵20 h時(shí)，B的菌體濃度和NK酶活力分別是A的3.3 倍和3.6 倍；25 h時(shí)，B的菌體濃度和NK酶活力分別是A的4.8 倍和5.4 倍；而在30 h時(shí)，比值分別為4.4 倍和6.6 倍。30 h時(shí)，酶活力最高為（156.00±2.04）U/mL。

由圖11和13所示，在30 ℃誘導(dǎo)溫度下，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的工程菌OD600nm和酶活力存在顯著差異（P＜0.05），其中發(fā)酵20 h時(shí)，以B為發(fā)酵培養(yǎng)基的菌體濃度和NK酶活力分別是A的3.3倍和5.9倍；25 h時(shí)，比值分別為的2.8、8.5 倍；而在30 h時(shí)，比值分別為1.4 、11.5 倍。30 h時(shí)，酶活力最高為（224.00±3.08）U/mL。

在相同發(fā)酵培養(yǎng)基、兩個(gè)不同溫度下，菌體量和酶活力差異不顯著，但30 ℃菌體量和酶活力表達(dá)均較高，培養(yǎng)基濃度增加（發(fā)酵培養(yǎng)基B）提高菌體濃度，是酶活力增加的重要原因。同時(shí)，在相同菌體濃度下，酶的表達(dá)量有所提高。在發(fā)酵培養(yǎng)基B中培養(yǎng)時(shí)，菌體濃度的增加主要發(fā)生在25 h以前，而酶活力在此后還會(huì)增加，說(shuō)明生長(zhǎng)和產(chǎn)酶并不同步。

2.2.5 接種量對(duì)NK酶活力的影響

圖14 接種量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig. 14 Effects of inoculum concentration on cell growth

圖15 接種量對(duì)酶活力的影響Fig. 15 Effects of inoculum concentration on enzyme activity

由圖14可知，發(fā)酵21.5和45 h，不同接種量引起的菌體量差異不顯著，其中在20 h左右接種量為5% 時(shí)菌體量較低，接種量為2.5%和7.5%菌體量較大。由圖15可知，發(fā)酵21.5 h，不同接種量引起的酶活力差異顯著（P＜0.05），隨著發(fā)酵45 h，酶活力差異不顯著，但接種量越大，酶活力越高。其中當(dāng)接種量為7.5%時(shí)酶活力平均最高值為（289.26±3.42）U/mL。

采用相同的培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵，未檢測(cè)出宿主菌B. subtilis 168中的酶活力，B. subtilis natto酶活力為（74.32±0.69）U/mL，工程菌B.s 168/pHT01-aprN酶活力是野生菌B. subtilis natto的3.9 倍，可見(jiàn)B.s 168/pHT01-aprN在很大程度上提高了酶活力。Wei Xuetuan等[27]構(gòu)建的工程菌NK酶活力（工業(yè)法33.86 FU/mL）是原宿主菌WX-02的2.3 倍，在相同的酶活力測(cè)定方法（四肽底物法）下，B.s 168/pHT01-aprN搖瓶培養(yǎng)酶活力是Berenjian等[23]報(bào)道的野生菌NK酶活力（23.48 U/mL）的12.2 倍，是Kim等[28]報(bào)道的（13.5 U/mL）21.5 倍，大大提高NK胞外表達(dá)水平。Berenjian等[23]報(bào)道優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵酶活力為587 U/mL，比搖瓶培養(yǎng)的野生菌酶活力（23.48 U/mL）提高25 倍；Cho等[29]高密度發(fā)酵的NK酶活力是搖瓶培養(yǎng)的5.4 倍，補(bǔ)料發(fā)酵再提高2.1 倍；Kwon等[30]高密度發(fā)酵的NK酶活力是搖瓶培養(yǎng)的5.0 倍，補(bǔ)料發(fā)酵再提高4.3 倍。以上文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果對(duì)下一步進(jìn)行高密度發(fā)酵提供有力支持。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用pHT01載體，依據(jù)B. subtilis 密碼子的偏愛(ài)性，優(yōu)化編碼NK前30 個(gè)氨基酸的密碼子，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化的aprN基因在B. subtilis 168中表達(dá)。通過(guò)酶活力比較，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基條件為：培養(yǎng)基成分（葡萄糖20 g/L、酵母提取物20 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、甘油2%，pH 8.0）、2,6-吡啶二羧酸1 mmol/L、IPTG 終濃度0.5 mmol/L、接種量7.5%、發(fā)酵誘導(dǎo)溫度30 ℃，該條件下NK最高酶活力為（289.26±3.42） U/mL，胞外NK酶活力為相同培養(yǎng)基培養(yǎng)下的野生菌的3.9 倍，酶活力表達(dá)穩(wěn)定性良好。NK中加入了6 個(gè)組氨酸片段，有助于后續(xù)利用鎳柱親和層析進(jìn)行純化。后續(xù)研究高密度發(fā)酵后對(duì)酶活力表達(dá)的影響。

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Construction of Genetically Engineered Strain for Nattokinase Production and Enzyme Activity Analysis

CUI Qing, QIAN Bingjun, YAO Xiaomin, JI Shunli, LU Feifeng, WU Jing, ZHANG Jianhua*
(Bor S. Luh Food Safety Research Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Nattokinase (NK), encoded by the aprN gene of Bacillus subtilis natto, has strong fibrinolytic activity both in vitro and in vivo. In this research, the aprN gene from B. subtilis was cloned and the codons which encode the first 30 amino acids were optimized on the basis of the codon preference of B. subtilis. Recombinant vector pHT01-aprN was constructed. Through restriction enzyme digestion analysis, PCR amplification and sequencing, the subcloned gene was confirmed to be aprN. The pHT01-aprN was transformed into B. subtilis 168 by electroporation, and the engineered bacterium (B.s 168/pHT01-aprN) was isolated on LB plates containing chloramphenicol. NK expression was induced by IPTG, and the highest enzyme activity in shaking flask culture was up to (289.00 ± 3.42) U/mL with good stability, which was 3.9 times as high as that of wild-type B. subtilis natto.

nattokinase; aprN gene; Bacillus subtilis; enzyme activity; engineered bacteria

10.7506/spkx1002-6630-201714001

Q786

A

1002-6630（2017）14-0001-08

崔青, 錢(qián)炳俊, 姚曉敏, 等. 納豆激酶基因工程菌的構(gòu)建及酶活力分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 1-8. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201714001. http://www.spkx.net.cn

CUI Qing, QIAN Bingjun, YAO Xiaomin, et al. Construction of genetically engineered strain for nattokinase production and enzyme activity analysis[J]. Food Science, 2017, 38(14): 1-8. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714001. http://www.spkx.net.cn

2016-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171737）

崔青（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：cuiqing1992@sina.com

*通信作者：張建華（1968—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：zhangjh@sjtu.edu.cn