張 燁，王 珂，劉石生,*

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 海口 570228；2.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

外源β-葡萄糖苷酶處理結(jié)合異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定橡膠籽中氰化物含量

張 燁1，王 珂2，劉石生1,*

（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué) 熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

研究經(jīng)不同方法脫毒處理后的橡膠籽分別采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法和加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑啉酮分光光度法檢測其氰化物含量。結(jié)果表明：采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法檢測出的氰化物含量較低或不存在，而加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑啉酮分光光度法檢測出的氰化物含量明顯高于單獨(dú)采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法的檢出值。再對加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑啉酮分光光度法的應(yīng)用條件進(jìn)行優(yōu)化后得到最優(yōu)條件為浸泡時間3.35 h、浸泡溫度45.06 ℃、加酶量24.11 U/100 mL、浸泡pH 5.56。以上條件下，預(yù)測的氰化物含量為28.79 μg/g，加標(biāo)回收率為85.02%～92.04%，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

異煙酸-吡唑啉酮分光光度法；β-葡萄糖苷酶；橡膠籽；氰苷；熱處理

氰化物是含有氰基（—CN）的一類化合物的總稱，屬于劇毒物[1]，這類化合物廣泛存在于自然環(huán)境中[2]，分析化學(xué)對其關(guān)注已有100多年的歷史，至今仍然受到高度關(guān)注[3]，其毒性大、反應(yīng)快[4]，人們過多攝入此類物質(zhì)會導(dǎo)致神經(jīng)疾病或中毒[5]。由于氰化物的毒性極大，因此要求在較低質(zhì)量濃度（ng/mL）條件下被檢出[6]。目前國內(nèi)較先進(jìn)的測定氰化物含量的方法多為液相色譜法、氣相色譜法[7-8]及離子色譜法[9-10]，氣相色譜主要用于測定簡單氰化物及部分絡(luò)合物[11]，并不能精確測定總氰化物的含量。高效液相色譜雖然能測定絡(luò)合氰化物，但金屬氰化絡(luò)合物易分解，只有在特定的環(huán)境條件下才能較穩(wěn)定存在[12]，離子色譜法受技術(shù)條件限制，氰化物的離子色譜分析還尚未完全成熟[13]，因此該方法應(yīng)用條件較為苛刻。而國標(biāo)中氰化物的主要檢測方法GB/T 13084—2006《飼料中氰化物的測定》[14]和GB/T 5009.36—2003《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[15]中均采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法[16-17]，該種測定方法是在植物本身含有β-葡萄糖苷酶的情況下由β-葡萄糖苷酶水解氰苷生成氫氰酸[18-20]，才能測出氰化物含量。目前雖然有對木薯、竹筍等食用植物食品中氰苷含量測定的相關(guān)研究[21-22]，但在實(shí)際測定食品中氰化物含量前食品原材料一般都會進(jìn)行高溫處理。雖然高溫對脫除植物中所含的部分氰化物有所幫助[23-24]，但高溫條件同時能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活，使食物本身含有的β-葡萄糖苷酶遭到不同程度地破壞，氰苷不能完全被分解，因此會存在使用國標(biāo)方法檢測出的食品中氰化物含量偏低或不存在，但這并不能說明食物中所含有的氰苷在高溫中被完全除去[25-26]。目前還沒有將食物熱加工后經(jīng)外源β-葡萄糖苷酶處理后檢測其氰化物含量的研究。本實(shí)驗(yàn)以橡膠籽為原材料，先通過對橡膠籽進(jìn)行不同高溫脫毒方法處理，再經(jīng)外源的β-葡萄糖苷酶處理，然后采用異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定其氰化物含量，探究氰苷是否在高溫中被完全除去，并跟蹤外源β-葡萄糖苷酶的加入對經(jīng)高溫處理后的橡膠籽中氰化物含量測定的影響情況。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橡膠籽 海南八一農(nóng)場；β-葡萄糖苷酶由實(shí)驗(yàn)室從橡膠籽中提取。

丙酮、乙酸鋅、酒石酸、酚酞、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉溶液、磷酸鹽緩沖液、乙醇、氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液、氯胺T、異煙酸、吡唑啉酮，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S26S電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠；電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BS124S電子天平德國Sartorius公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計 上海偉業(yè)儀器廠；TG16G離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；7230G可見分光光度計 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。1.3 方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶的制備

將橡膠籽外殼敲除，種仁磨碎成粉，用適量丙酮沖洗、抽濾、揮干后制成干粉。稱取一定質(zhì)量的干粉加蒸餾水均質(zhì)，均質(zhì)后6 000 r/min離心20 min，取上清液加入適量丙酮產(chǎn)生沉淀，復(fù)溶，得到初步純化的酶，4 ℃保存?zhèn)溆肹27-28]。

1.3.2 酶活力的測定

向10 mL比色管中加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，同時加入0.3 mL pH 6.0的磷酸鹽緩沖溶液和0.1 mL 10 mmol/L 4-硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷，42 ℃水浴保溫30 min，取出后立即加1 mol/L Na2CO3溶液終止其反應(yīng)，加蒸餾水至5 mL，于400 nm波長處測定吸光度。空白對照采用0.1 mL蒸餾水代替酶液進(jìn)行操作，計算酶活力[29-30]。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 未加入β-葡萄糖苷酶

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質(zhì)量加入帶塞三角瓶中，加入100 mL蒸餾水使試樣全部浸沒，加塞浸泡3～4 h。

1.3.3.2 加入β-葡萄糖苷酶

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質(zhì)量加入帶塞三角瓶中，加入100 mL蒸餾水使試樣全部浸沒后加入一定量β-葡萄糖苷酶酶液并調(diào)節(jié)其pH值在一定范圍，加塞后再水浴浸泡一定時間。

1.3.4 氰化物含量的測定

1.3.4.1 測定方法

參考GB/T 5009.36—2003《糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[10]1.3.4節(jié)不同熱處理方法對橡膠籽中氰化物含量測定的影響。

1.3.4.2 空白實(shí)驗(yàn)

取一定量的β-葡萄糖苷酶酶液直接加入到裝有100 mL水的三角瓶中并調(diào)節(jié)其pH值在一定范圍，加塞后再水浴浸泡一定時間后測定氰化物含量。

1.3.4.3 煮橡膠籽（煮樣）時間對氰化物含量測定的影響

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質(zhì)量橡膠籽并加入一定質(zhì)量的水（V（橡膠籽）∶V（水）= 1∶20），分別煮10、20、30、40、60 min后采用1.3.3節(jié)中的方法分別做加酶和不加酶的處理，再測定其氰化物。

1.3.4.4 蒸橡膠籽（蒸樣）時間對氰化物含量測定的影響

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質(zhì)量橡膠籽，分別蒸20、40、60、80、100、120、140 min后采用1.3.3節(jié)的方法分別做加酶和不加酶的處理，再測定其氰化物。

1.3.4.5 烘烤橡膠籽（烘樣）時間對氰化物含量測定的影響

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，取一定質(zhì)量橡膠籽加水浸泡12 h后曬干。取一定量曬干后的橡膠籽，分別在130 ℃烘烤5、10、15、20、25、30、35 min后采用1.3.3節(jié)的方法分別做加酶和不加酶的處理，再測定其氰化物。

1.3.5 外源β-葡萄糖苷酶活性對橡膠籽中氰化物含量測定的影響

將橡膠籽外殼敲除，種仁切成小塊，高溫脫毒處理后，加入100 mL蒸餾水使試樣全部浸沒后調(diào)節(jié)浸泡時間、溫度、加酶量和pH值得到最優(yōu)單因素條件再進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到最優(yōu)結(jié)果后再驗(yàn)證。

1.3.5.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計

以氰化物含量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計為：加酶量（5、10、15、20、25、30 U/100 mL）、酶解溫度（常溫、35、40、45、50、55、60 ℃）、酶解時間（1、2、2.5、3、3.5、4 h）、pH（4、4.5、5、5.5、6.0、6.5、7.0）。

1.3.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化測定條件對測定結(jié)果的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the optimization parameters used in Box-Benhnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果

直接在100mL水中分別加入0.1 mL的0、10、20、 30 U/100mL β-葡萄糖苷酶液后水浴浸泡一段時間測得氰化物含量分別為0、0.437、0.679、0.749 μg/mL。由空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，加入外源β-葡萄糖苷酶對氰化物含量的測定值的影響只有零點(diǎn)幾，數(shù)據(jù)較小，因此可排除外源β-葡萄糖苷酶對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2 煮樣時間對氰化物含量測定的影響

圖1 煮樣時間對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 1 Effect of boiling time on the cyanide content in rubber seed

如圖1所示，在相同的前處理條件下，經(jīng)水煮后的橡膠籽在檢測氰化物過程中加入外源β-葡萄糖苷酶和不加外源β-葡萄糖苷酶兩種情況下檢出的氰化物含量有明顯差別，加入β-葡萄糖苷酶的一組測出來的氰化物殘留量更多，說明加入外源β-葡萄糖苷酶對測定結(jié)果有一定的影響。水煮40 min后，在不加酶的情況下檢測不出氰化物，說明此時橡膠籽內(nèi)源β-葡萄糖苷酶已經(jīng)完全失活，但是重新加入外源β-葡萄糖苷酶后，依然能檢測出氰化物，說明橡膠籽中的氰苷并沒有被充分降解，在外源酶的作用下仍能生成氫氰酸。說明再檢測過程中加入外源β-葡萄糖苷酶可使氰化物測定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2.3 蒸樣時間對其氰化物含量測定的影響

圖2 蒸樣時間對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 2 Effect of steaming time on the cyanide content in rubber seed

如圖2所示，比較圖1和圖2可知經(jīng)隔水蒸后的橡膠籽氰化物的檢測結(jié)果的大體趨勢和2.1節(jié)水煮橡膠籽的檢測結(jié)果相同，同樣在加入外源β-葡萄糖苷酶和不加外源β-葡萄糖苷酶兩種情況下檢出的氰化物含量有明顯差別，加入β-葡萄糖苷酶的一組測出來的氰化物殘留量更多，而水煮橡膠籽氰化物去除所用時間更短效率更高。

2.4 烘樣時間對其氰化物含量測定的影響

圖3 烘樣時間對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 3 Effect of baking time on the cyanide content in rubber seed

由圖3可知，烘烤樣品主要模擬堅果制作工藝進(jìn)行，在國標(biāo)法測出氰化物含量在可食用范圍內(nèi)時再在檢測過程中加入外源β-葡萄糖苷酶后檢測出的氰化物含量會增高，可見加入外源β-葡萄糖苷酶的檢測方法在加熱條件下更加準(zhǔn)確。

由此，不同的熱處理方式加工過的原料經(jīng)外源β-葡萄糖苷酶處理后所測定的氰化物含量均有所增高，證明加入外源β-葡萄糖苷酶對氰化物的測定有積極的影響，可對該方法進(jìn)行深入探究。

2.5 氰化物標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

精確取一定量的氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，溶解定容稀釋成一系列不同已知質(zhì)量濃度的溶液，測定其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到方程y=3.205 1x+0.000 2（y為吸光度，x為氰離子質(zhì)量濃度/（μg/mL）），R2=0.999 6，說明方程具有良好線性相關(guān)性。

2.6 加入外源β-葡萄糖苷酶單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 浸泡時間對測定結(jié)果的影響

圖4 浸泡時間對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 4 Effect of soaking times on the cyanide content in rubber seed

按1.3.5節(jié)方法檢測外源β-葡萄糖苷酶中的氰化物含量，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)檢測不出氰化物后，將脫殼后的橡膠籽制成小塊后煮沸40 min，得到的樣品采用加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定其氰化物含量。檢測過程中加酶量10 U/100 mL、溫度45 ℃、pH 6.5，選擇不同的處理時間（1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個處理做2 個重復(fù)。由圖4可以看出，酶解時間3 h后氰化物含量變化不大，因此浸泡時間選3 h。

2.6.2 加酶量對測定結(jié)果的影響

圖5 加酶量對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 5 Effect of β-glucosidase concentration on the cyanide content in rubber seed

按1.3.5節(jié)方法檢測外源β-葡萄糖苷酶中的氰化物含量，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)檢測不出氰化物后，將脫殼后的橡膠籽制成小塊后煮沸40 min，得到的樣品采用加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑酮分光光度法測定其氰化物含量。檢測過程中浸泡時間3 h、溫度45 ℃、pH 6.5，選擇不同的加酶量（5、10、15、20、25、30 U/100 mL）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個處理做2 個重復(fù)。由圖5可以看出，加酶量達(dá)到20 U/100 mL后氰化物含量變化不大，因此浸泡加酶量選20 U/100 mL。

2.6.3 pH值對測定結(jié)果的影響

圖6 pH值對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 6 Effect of soaking pH on the cyanide content in rubber seed

按1.3.5節(jié)方法檢測外源β-葡萄糖苷酶中的氰化物含量，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)檢測不出氰化物后，將脫殼后的橡膠籽制成小塊后煮沸40 min，得到的樣品采用加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑酮分光光度法測定其氰化物含量。檢測過程中浸泡時間3 h、溫度45 ℃、加酶量20 U/100 mL，選擇不同的pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個處理做2 個重復(fù)。由圖6可以看出，pH值在5.5時氰化物含量達(dá)到最大值，因此浸泡pH值選5.5。

2.6.4 浸泡溫度對測定結(jié)果的影響

圖7 浸泡溫度對橡膠籽中氰化物含量測定的影響Fig. 7 Effect of soaking temperature on the cyanide content in rubber seed

按1.3.5節(jié)方法檢測外源β-葡萄糖苷酶中的氰化物含量，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)檢測不出氰化物后，將脫殼后的橡膠籽制成小塊后煮沸40 min，得到的樣品采用加入外源β-葡萄糖苷酶的異煙酸-吡唑酮分光光度法測定其氰化物含量。檢測過程中浸泡時間3 h、pH 5.5、加酶量20 U/100 mL，選擇不同溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個處理做2 個重復(fù)。由圖7可以看出，浸泡溫度在50 ℃時氰化物含量達(dá)到最大值，因此浸泡溫度選50 ℃。

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析及顯著性比較見表3。利用Design-Expert 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，對各因素進(jìn)行回歸擬合，氰化物含量（Y）的回歸方程Y=24.34-1.04A+0.15B+0.94C+0.79D-0.5AB-1.35AC-0.84AD-0.69BC-0.72BD+0.59CD+0.29A2+ 1.15B2+0.69C2+0.76D2。同時，優(yōu)化4 個影響因素的最佳組合為浸泡時間3.35 h、浸泡溫度45.06 ℃、加酶量24.11 U/100 mL、浸泡pH 5.56。以上條件下，預(yù)測的氰化物含量為28.79 μg/g。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果（n=5）Table 2 Box-Benhnken design with experimental data (n= 5)

由表3可以看出，所得Y的回歸方程極顯著，且失擬項不顯著，說明此模型很理想，用方程Y擬合4 個因素與氰化物含量是可行的。相關(guān)系數(shù)R2為0.977 4，表明回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)間具有較好的擬合性；為0.954 7，說明可信度較高。從因素A、B、C、D對氰化物含量的影響來看，因素A、C、D為極顯著（P＜0.01），B不顯著；交互項的影響均為極顯著（P＜0.01）；二次項中除A2為顯著外（P＜0.05），其余均為極顯著（P＜0.01）。通過比較方程一次項系數(shù)絕對值的大小，可以判斷因素影響的主次，本實(shí)驗(yàn)中因素影響順序依次為A＞C＞D＞B，且各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響呈二次關(guān)系。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

分別將模型中A、B、C及D其中2 個因素固定在0水平，得到另外2 個因素間交互作用對氰化物含量Y的子模型，4 個因素間部分兩兩交互作用對檢測氰化物含量的影響的響應(yīng)面分析結(jié)果，如圖8所示。

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳條件浸泡時間3.35 h、浸泡溫度45.06 ℃、加酶量24.11 U/100 mL，浸泡pH 5.56條件下，測得氰化物含量為28.55 μg/g，與預(yù)測值基本接近，表明預(yù)測值和真實(shí)值間有較好的擬合性，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

圖8 兩因素交互作用對氰化物含量的影響Fig. 8 Response surface plots showing the effects of various pretreatment factors on the cyanide content in rubber seed

2.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

表4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recovery of cyanide in spiked samples

為了檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，在樣品中加入氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)使用液，按實(shí)驗(yàn)方法對其進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率結(jié)果見表4。本實(shí)驗(yàn)樣品中氰化物的加標(biāo)回收率為85.02%～92.04%，方法準(zhǔn)確度較高，可信度好。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不同的熱處理條件下橡膠籽內(nèi)的氰均能去除一半以上，在檢測其氰化物含量過程中單純采用異煙酸-吡唑酮分光光度法所測定出來的氰化物含量較低或不存在，說明一定程度的熱處理使橡膠籽本身含有的β-葡萄糖苷酶遭到不同程度地破壞，氰苷不能完全被分解導(dǎo)致測定值較低。在采用加入外源β-葡萄糖苷酶后的異煙酸-吡唑酮分光光度法測定的氰化物含量要更高，說明外源β-葡萄糖苷酶對經(jīng)熱處理未完全釋放的氰苷繼續(xù)作用使其分解得到的測定值更高，可見在內(nèi)源酶完全失活而沒有加入外源酶的情況下測出的總氰結(jié)果并不可靠，由此本實(shí)驗(yàn)中加入外源β-葡萄糖苷酶后的異煙酸-吡唑酮分光光度法的準(zhǔn)確度更高。

[1] 王明國, 李社紅, 肖唐付, 等. 氰化物測定研究進(jìn)展[J]. 地球與環(huán)境, 2010, 38(4): 519-526.

[2] 左晨艷, 楊波波, 吳婷, 等. 氰化物中毒及解毒的研究進(jìn)展[J]. 毒理學(xué)雜志, 2016(4): 311-316.

[3] 邸玉敏, 朱軍, 常靖, 等. 氰化物測定研究進(jìn)展[J]. 理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊, 2011, 47(12): 1491-1494.

[4] 姜珊, 王婷, 王晨. 氰化物測定研究進(jìn)展[J]. 資源節(jié)約與環(huán)保, 2015(11): 65.

[5] NGUDI D D, KUO Y H, LAMBEIN F. Cassava cyanogens and free amino acids in raw and cooked leaves[J]. Food and Chemistry Toxicology, 2003, 41: 1193-1197. DOI:10.1016/S0278-6915(03)00111-X.

[6] 葉梅, 吳文林, 郭靚, 等. 離子色譜-脈沖安培檢測法快速測定配制酒中的氰化物[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(8): 192-195. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201608034.

[7] 鄒良平, 起登鳳, 李玖慧, 等. 高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測法測定木薯生氰糖苷的含量[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2014, 30(24): 47-51. DOI:10.11924/j.issn.1000-6850.2014-0070.

[8] 孟梁, 中貴雋, 張強(qiáng). 金屬配位劑衍生-高效液相色譜法測定糧食及白酒中的游離氰化物[J]. 分析科學(xué)學(xué)報, 2009, 25(5): 587-589.

[9] CHRISTISON T T, ROHRER J S. Direct determination of free cyanide in drinking water by ion chromatography with pulsed amperometric detection[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1155(1): 31-39. DOI:10.1016/j.chroma.2007.02.083.

[10] 戴安(中國)有限公司. 紫外-離子色譜法直接檢測金屬氰化物[J].環(huán)境化學(xué), 2008, 27(3): 405-407.

[11] SETO Y, TSUNODA N, OHTA H, et al. Determination of blood cyanide by headspace gas chromatography with nitrogenphosphorus detection and using a megabore capillary column[J]. Analytica Chimica Acta, 1993, 276(2): 247-259. DOI:10.1016/0003-2670(93)80391-W.

[12] JERMAK S, PRANAITyTE B, PADARAUSKAS A. Ligand displacement, headspace single-drop microextraction, and capillary electrophoresis for the determination of weak acid dissociable cyanide[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1148(1): 123-127. DOI:10.1016/j.chroma.2007.03.022.

[13] 龍素群, 鐘志京, 劉秀華, 等. 離子色譜法測定氰化物方法研究[J].四川大學(xué)學(xué)報, 2006, 43(6): 1352-1356.

[14] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 飼料中氰化物的測定: GB/T 13084—2006[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.

[15] 中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所. 糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法: GB/T 5009.36—2003[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[16] 王曉芳, 陳美, 楊春亮. 木薯中氰化物含量的異煙酸-吡唑林酮分光光度法測定[J]. 分析儀器, 2009(1): 32-34. DOI:10.3969/j.issn.1001-232X.2009.01.010.

[17] ABBASI S, VALINEZHAD R, KHANI H. A novel kinetic spectrophotometric method for the determination of ultra trace amount of cyanide[J]. 2010, 77(1): 112-116. DOI:10.1016/j.saa.2010.04.035.

[18] CHEN L, LI N, ZONG M H. A glucose-tolerant β-glucosidase from Prunus domestica seeds: purification and characterization[J]. Process Biochemistry, 2011, 47: 127-132. DOI:10.1016/j.procbio.2011.10.023.

[19] MORANT A V, JORGENSEN K, CHARLOTTE J. β-Glucosidase as detonators of plant chemical defense[J]. Phytochemistry 2008, 69: 1795-1813. DOI:10.1016/j.phytochem.2008.03.006.

[20] HOSEL W, TOBER I, EKLUND S H, et al. Characterization of β-glucosidase with high specificity for the cyanogenic glucoside dhurrin in Sorghum bicolor (L) moench seedings[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1987, 252(1): 152-162. DOI:10.1016/0003-9861(87)90019-1.

[21] SORNYOTHA S, KYU K L. Puriification and detection of linamarin from cassava root cortex by high performance liquid chromatography[J]. Food Chemistry, 2007, 104: 1750-1754. DOI:10.1016/j.foodchem. 2006.10.071.

[22] 學(xué)京, 陳志霞. 新鮮竹筍中氰化物含量測定及家庭加工方法對其含量的影響[J]. 職業(yè)與健康, 2010, 26(5): 514-515.

[23] 陳建新, 劉家運(yùn), 劉翠珍. 不同處理方法對木薯氫氰酸含量的影響[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技, 1992(4): 13-14.

[24] MLINGI N L V, BAINBRIDGE Z A, POULTER N H, et al. Critical stages in cyanogen removal during cassava processing in southern Tanzania[J]. Food Chemistry, 1995, 53: 29-33. DOI:10.1016/0308-8146(95)95782-2.

[25] 劉暢, 陳宇, 劉石生. 不同處理方法對木薯中氰化物殘留的影響[J].食品科技, 2014, 39(12): 190-193.

[26] NARAHARI D, KOTHANDARAMAN P. The influence of processing and storage on hydrogen cyanide and tannin contents of para-rubber seed and its products[J]. Animal Feed Science and Technology, 1983, 9(4): 319-323. DOI:10.1016/0377-8401(83)90025-1.

[27] 王佩環(huán), 楊杰, 劉石生. 橡膠籽β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮的研究[J].食品科技, 2013, 38(3): 201-205.

[28] 葛云榮. 迷迭香育苗及田間管理[J]. 云南農(nóng)業(yè), 2001(8): 12.

[29] 李斐然, 劉石生, 王海燕. 橡膠籽中β-葡萄糖苷酶活力測定條件研究[J].食品科技, 2011, 36(5): 264-267.

[30] 李華, 高麗. β-葡萄糖苷酶活力測定方法的研究進(jìn)展[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2007, 26(2): 107-114.

Spectrophotometric Determination of Cyanide Content in Rubber Seeds Using Isonicotinic Acid-Pyrazolone after Exogenous β-Glucosidase Pretreatment

ZHANG Ye1, WANG Ke2, LIU Shisheng1,*
(1. College of Food Science, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Key Laboratory of Tropical Biological Resources, Ministry of Education, Hainan University, Haikou 570228, China)

This study investigated the determination of the residual cyanide content of rubber seeds detoxified by different methods by a spectrophotometric method using isonicotinic acid-pyrazolone with and without exogenous β-glucosidase pretreatment. The results showed that cyanide was undetectable or detectable at a level lower than the actual one by the spectrophotometric method without exogenous β-glucosidase pretreatment, while it was detected at a significantly higher level with the sample pretreatment. The optimized pretreatment conditions were 3.35 h soaking at 45.06 ℃ and pH 5.56 with 24.11 U/100 mL of β-glucosidase added, under which, the predicted cyanide content of rubber seeds was 28.79 μg/g. The recovery of spiked samples ranged from 85.02% to 92.04%. The proposed method was accurate and reliable．

isonicotinic acid-pyrazolone spectrophotometry; β-glucosidase; rubber seed; cyanide; heat treatment

10.7506/spkx1002-6630-201714045

O623.76

A

1002-6630（2017）14-0290-07

張燁, 王珂, 劉石生. 外源β-葡萄糖苷酶處理結(jié)合異煙酸-吡唑啉酮分光光度法測定橡膠籽中氰化物含量[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 290-296.

10.7506/spkx1002-6630-201714045. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Ye, WANG Ke, LIU Shisheng. Spectrophotometric determination of cyanide content in rubber seeds using isonicotinic acid-pyrazolone after exogenous β-glucosidase pretreatment[J]. Food Science, 2017, 38(14): 290-296. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714045. http://www.spkx.net.cn

2016-08-03

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31460407）

張燁（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称饭こ獭-mail：1551540220@qq.com

*通信作者：劉石生（1977—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊恢参镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：stoneliu77@126.com