孫超楠，李廷荃，王雁彬

芪芍復(fù)脈湯對(duì)大鼠缺血下肢骨骼肌毛細(xì)血管密度的影響

孫超楠1，李廷荃2，王雁彬2

目的 觀察芪芍復(fù)脈湯對(duì)大鼠缺血下肢毛細(xì)血管密度(MVD)的影響。方法 健康SD大鼠行左下肢股動(dòng)脈結(jié)扎、分支剔除術(shù)，制作下肢缺血模型。隨機(jī)分為模型組，芪芍復(fù)脈湯高、中、低劑量組和G-CSF組，并設(shè)立假手術(shù)組，假手術(shù)組僅暴露股動(dòng)脈。術(shù)后第2天開始給藥，分別于3 d、7 d、14 d，檢測(cè)外周血酶學(xué)變化；取患側(cè)內(nèi)收肌檢測(cè)毛細(xì)血管密度，比較各組差異。結(jié)果 術(shù)后7 d、14 d，芪芍復(fù)脈湯高、中劑量組MVD值顯著高于模型組和芪芍復(fù)脈湯低劑量組(P<0.01)，術(shù)后14 d，芪芍復(fù)脈湯高劑量組高于芪芍復(fù)脈湯中劑量組(P<0.05)。結(jié)論 芪芍復(fù)脈湯可增加缺血下肢骨骼肌毛細(xì)血管密度，改善缺血狀態(tài)，促進(jìn)血管新生。

芪芍復(fù)脈湯；下肢缺血； 血管新生；毛細(xì)血管密度

下肢缺血性疾病是由于下肢動(dòng)脈的耗氧量與供氧量之間的不平衡所導(dǎo)致的下肢疾病，以動(dòng)脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎最為常見，嚴(yán)重影響著病人的生活質(zhì)量，甚至危及生命，人們對(duì)其一直束手無(wú)策。近年來(lái)血管新生技術(shù)的出現(xiàn)和中醫(yī)藥治療為下肢缺血性疾病治療帶來(lái)了新曙光[1-3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎股動(dòng)脈制造大鼠下肢缺血模型，觀察芪芍復(fù)脈湯對(duì)缺血大鼠骨骼肌毛細(xì)血管密度的影響，初步探討芪芍復(fù)脈湯對(duì)缺血下肢血管新生的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠下肢缺血模型的建立 SD大鼠108只，雄性，6月齡，體質(zhì)量250 g～300 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(軍)2014-0004。常規(guī)飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組。3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)行大鼠腹腔

注射麻醉，選左側(cè)腹股溝中點(diǎn)向膝部作一長(zhǎng)度約2 cm的縱行切口，緊貼腹股溝下方分離股動(dòng)脈主干，行股動(dòng)脈結(jié)扎、離斷及分支剔除術(shù)，制造下肢缺血模型。假手術(shù)組僅暴露股三角，不結(jié)扎動(dòng)脈及其分支，術(shù)后連續(xù)3 d對(duì)大鼠下肢肌肉注射抗生素(青霉素8 U)，預(yù)防感染。

1.2 動(dòng)物分組 將造模成功的大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，模型組、芪芍復(fù)脈湯高劑量組、中劑量組、低劑量組、粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)組，每組18只。

1.3 給藥方法 芪芍復(fù)脈湯，組方：黃芪30 g，當(dāng)歸15 g，桂枝15 g，麥冬10 g，赤芍15 g，川芎10 g，三七3 g，丹參30 g，土元6 g，全蝎6 g，川牛膝30 g，甘草6 g。廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)顆粒劑，1 g顆粒折合生藥量4.5 g ，根據(jù)藥物的溶解性確定最大給藥濃度，以此作為高劑量給藥濃度，一半為中劑量給藥濃度，四分之一為低劑量給藥濃度。給藥劑量高劑量組7.6g/(kg·d) ，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的12倍、中劑量組3.8 g/(kg·d) ，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的6倍、低劑量組1.9 g/(kg·d) ，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的3倍，加溫開水至10 mL，1 mL/100 g ，模型組和假手術(shù)組灌服蒸餾水，1 mL/100 g，每天1次，連續(xù)14 d。陽(yáng)性對(duì)照藥：rhG-CSF：200 μg/1.2 mL， 購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司，批號(hào)S19990049。用生理鹽水稀釋至12 mL 備用，予rhG-CSF組大鼠患肢皮下注射[4]，注射量：0.21 mL/100 g (相當(dāng)于60 kg體重成人用量的7倍)， 日一次 ，連續(xù)5 d。

1.4 主要試劑與儀器 肌酸激酶(CK)測(cè)定試劑盒(貝克曼庫(kù)爾特；批號(hào)LOT8537)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定試劑盒(貝克曼庫(kù)爾特，批號(hào)：AUZ3555)；CD34抗體，購(gòu)自英國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab8158；二抗(HRP山羊抗兔鼠通用)購(gòu)自丹麥DAKO公司，貨號(hào)：K5007；組化試劑盒DAB顯色劑購(gòu)自丹麥DAKO公司，貨號(hào)：K5007。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 酶學(xué)檢測(cè) 術(shù)后3 d、7 d、14 d，大鼠下腔靜脈抽取血液3 mL，測(cè)外周血肌酸激酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶。

1.5.2 免疫組化測(cè)定缺血組織中毛細(xì)血管密度 術(shù)后3 d、7 d、14 d，取大鼠患側(cè)缺血內(nèi)收肌，石蠟切片脫蠟至水，EDTA抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后，用3%過(guò)氧化氫溶液溫室避光孵育25 min，用3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，滴加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜， PBS 緩沖液洗滌 5 min×3次，滴加第二抗體，室溫37 ℃孵育20 min，PBS 緩沖液洗滌 5 min×3次，DAB顯色，復(fù)染后脫水，中性樹膠封片。進(jìn)行400倍的顯微照相。應(yīng)用IPP6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，CD34抗體著色顯示組織的微血管密度，采集5個(gè)視野下的陽(yáng)性血管數(shù)量，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠下肢缺血模型建立情況 結(jié)扎、離斷大鼠下肢股動(dòng)脈及其分支的造模效果顯著，除假手術(shù)組外，其余各組均有不同程度的活動(dòng)障礙，6組大鼠下肢未見壞死。

2.2 外周血酶檢測(cè)結(jié)果 假手術(shù)組3 d和7 d無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)模型組酶學(xué)指標(biāo)水平均較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)，術(shù)后3 d，各組AST水平均較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)；模型組、低劑量組較高劑量組和rhG-CSF組顯著升高(P<0.01)，較中劑量組顯著升高(P<0.05)；rhG-CSF組的CK值低于模型組(P<0.05)。術(shù)后7 d各組AST、CK值均下降，且高、中劑量組、rhG-CSF組較模型組和低劑量組術(shù)后14 d，AST、CK值與7 d時(shí)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與3 d比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且高、中劑量組和rhG-CSF組的CK值與模型組比較下降顯著(P<0.05)。詳見表1、表2。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血AST比較(±s) U/L

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)外周血CK比較(±s) U/L

2.3 毛細(xì)血管密度(MVD)測(cè)定結(jié)果 術(shù)后3 d，各組間MVD值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后7 d，各組間總體不全相同，rhG-CSF組、芪芍復(fù)脈湯高、劑量組較模型組和低劑量組顯著上升(P<0.01)，中劑量組較模型組上升(P<0.01)，rhG-CSF組與高劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后14 d，各組間總體不全相同，rhG-CSF組、芪芍復(fù)脈湯高劑量組較模型組和低劑量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中劑量組較模型組顯著升高(P<0.05)，高劑量組高于中劑量組(P<0.05)，高劑量組與G-CSF組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表3。

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MVD值比較(±s) 個(gè)/視野

3 討 論

3.1 MVD與血管新生 血管新生是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，它是在原有血管基礎(chǔ)上，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)發(fā)芽或嵌入的方式，形成新的血管網(wǎng)的過(guò)程[5]。而這一過(guò)程是在機(jī)體缺血缺氧或炎癥等應(yīng)激狀態(tài)下才會(huì)被啟動(dòng)。其過(guò)程主要可以概括為：血管基膜及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白融解、內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)游走、增埴和分化，黏附并形成新的基膜，管腔形成并重塑成新的血管網(wǎng)[6]。血管新生可以建立有效的側(cè)支循環(huán)、改善微循環(huán)，維持缺血組織的血流供應(yīng)，恢復(fù)組織器官的功能，為缺血性疾病的治療帶來(lái)突破性的進(jìn)展。目前實(shí)驗(yàn)普遍采用MVD作為檢測(cè)血管新生水平的主要指標(biāo)，被公認(rèn)為評(píng)價(jià)血管新生強(qiáng)度的標(biāo)志。MVD檢測(cè)結(jié)果越高，說(shuō)明血管新生越活躍[7]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示：術(shù)后7 d和 14 d，芪芍復(fù)脈湯高、中劑量組MVD值較模型組顯著升高，并且術(shù)后14 d，高劑量組與西藥對(duì)照組MVD值無(wú)明顯差異，說(shuō)明芪芍復(fù)脈湯能夠增加大鼠下肢缺血模型骨骼肌毛細(xì)血管密度，促進(jìn)血管新生。

3.2 酶學(xué)與組織缺血的關(guān)系 酶學(xué)的變化在一定程度上反映了組織缺血的嚴(yán)重程度[8]。正常情況下，AST、CK等酶絕大多數(shù)存在于骨骼肌等肌肉組織中，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于外周血中的含量，血液中的AST、CK升高一般提示已有肌肉損害或正發(fā)生肌肉損害。實(shí)驗(yàn)中，結(jié)扎股動(dòng)脈及其分支造成下肢缺血模型，使局部組織缺血缺氧，使細(xì)胞膜通透性增高，加速細(xì)胞內(nèi)酶進(jìn)入外周血中，引起血清中酶的異常升高，但在后期外周血中的酶呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明下肢缺血狀態(tài)正在得到改善。說(shuō)明芪芍復(fù)脈湯能夠改善肢體的缺血狀態(tài)。

3.3 芪芍復(fù)脈湯與血管新生 祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，下肢缺血性疾病屬中醫(yī)“血”“脈”的范疇，“脈”與近代所述的“血管”無(wú)論在形態(tài)還是功能上都存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此認(rèn)為，血管新生的過(guò)程實(shí)際上就是“復(fù)脈”的過(guò)程。本病病機(jī)以氣血虧虛為本，瘀血阻塞為標(biāo)，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)阻塞不通。芪芍復(fù)脈湯是治療下肢缺血性疾病的效驗(yàn)方，是李廷荃教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，方中、黃芪，補(bǔ)氣，固本，使氣旺則血行；三七、川芎、赤芍、丹參，活血祛瘀、行氣止痛；土元、全蝎借其行散走竄之力，搜風(fēng)通絡(luò)，解痙止痛；川牛膝為血肉友情之品，既可助活血化瘀，強(qiáng)筋骨，壯腰膝，又可借其沉降之性引藥下行直達(dá)病所；配伍麥冬、當(dāng)歸養(yǎng)陰增液補(bǔ)血，使陰血充，脈絡(luò)盈；桂枝助陽(yáng)化氣，溫通經(jīng)脈，發(fā)越陽(yáng)氣，溫養(yǎng)肌膚[9-10]。通過(guò)補(bǔ)血養(yǎng)血而充脈絡(luò)，益氣以生血、行血，養(yǎng)陰血以增津液，活血化瘀以通脈絡(luò)，使正氣壯，瘀血除，新血生，血供改善，從而減輕肢體不適癥狀。

芪芍復(fù)脈湯能夠增加缺血骨骼肌的毛細(xì)血管密度，為臨床治療提供了可靠。術(shù)后14 d，芪芍復(fù)脈湯高劑量組和中劑量組MVD值明顯高于低劑量組，且高劑量組顯著高于中劑量組，說(shuō)明芪芍復(fù)脈湯不僅能夠促進(jìn)下肢缺血模型的血管新生，而且其療效存在劑量依賴性，為臨床治療下肢缺血性疾病最佳藥物劑量療效的確立提供實(shí)驗(yàn)支持。

芪芍復(fù)脈湯具有促進(jìn)下肢缺血模型血管新生的作用，其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

[1] 劉小雨，王行寬.促血管新生的中醫(yī)藥治療現(xiàn)狀[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11 (10)：1918-1922.

[2] 藍(lán)海峰，李尚珠．干細(xì)胞移植治療肢體缺血的進(jìn)展[J]．醫(yī)學(xué)綜述，2006，1(21)：1289-1290．

[3] 徐旭英.陳淑長(zhǎng)教授診治動(dòng)脈硬化閉塞癥經(jīng)驗(yàn)[J]．云南中醫(yī)藥雜志，2010，31(3)：3-5.

[4] 趙慶斌，周娟，吳岳，等 .粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)兔慢性心肌缺血的保護(hù)作用.[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(6)：735-738.

[5] Carmeliet P．Mechanisms of angiogenesis and artriogenesis[J]．Nat Med，2000，6(4)：389-395．

[6] 葉蕾，宮健偉，王東，等.地黃飲子對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠血管新生的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25(7)：1611-1614.

[7] 王雁彬，李廷荃，化金鳳，等.三七對(duì)大鼠下肢缺血模型MVD及VEGF蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(4)：371-372.

[8] 謝鳴，袁學(xué)勤，張家俊，等． 地黃飲子對(duì)老齡大鼠的血、腦組織過(guò)氧化脂質(zhì)及相關(guān)酶的影響[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2001，7(6)：21．

[9] 陳裴裴，周昕，謝瑞芳，等.基于心肌缺血的中藥促血管新生機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2014，21(5)：133-136.

[10] 陳榮榮，郭浩，徐硯通，等.中藥復(fù)方和有效成分對(duì)血管新生促進(jìn)或抑制作用的研究進(jìn)展[J].中草藥，2013，44(23)：3413-3420.

(本文編輯王雅潔)

1.山西省中醫(yī)藥研究院研究生在讀(太原 030012)；2.山西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

李廷荃， E-mail： 342800672@qq.com

信息：孫超楠，李廷荃，王雁彬.芪芍復(fù)脈湯對(duì)大鼠缺血下肢骨骼肌毛細(xì)血管密度的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(12)：1450-1453.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.12.008

1672-1349(2017)12-1450-04

2016-10-09)