林 旭,周 強(qiáng)

(南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210008)

臨床細(xì)胞病理工作中，常規(guī)的胸水涂片因制作簡單、可快速進(jìn)行診斷在臨床應(yīng)用普及。但是日常工作中，胸水涂片經(jīng)常因細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不典型、細(xì)胞蛻變、或與增生間皮細(xì)胞不易區(qū)分等因素，細(xì)胞病理學(xué)并不能有明確的診斷結(jié)果[1]。通過制作細(xì)胞蠟塊，進(jìn)行免疫組織化學(xué)方法鑒別，才能使細(xì)胞病理診斷精準(zhǔn)化。然而，細(xì)胞蠟塊的制作要求嚴(yán)格，特別是血性胸水，如果標(biāo)本前期血細(xì)胞處理不好，含血量多，就會影響細(xì)胞蠟塊制作、導(dǎo)致常規(guī)石蠟切片嚴(yán)重掉片，從而無法進(jìn)行更深層次檢測診斷。本實驗欲研究一種方便快捷的方法，提高血性胸水細(xì)胞蠟塊的制作質(zhì)量，從而方便免疫組織化學(xué)、分子等檢測，使細(xì)胞病理診斷趨于精準(zhǔn)化。

1 資料與方法

1.1 一般資料

南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院病理科2013—2015年臨床2 h內(nèi)送檢新鮮血性胸水20例，容量大于200 mL。

1.2 試劑

95%乙醇、PreservCyt細(xì)胞清洗液(Hologic ,Inc.)、冰醋酸、試管、全自動脫水機(jī)(SAKURA)、包埋機(jī)(SAKURA)、全自動染色機(jī)(Dako CoverStainer)、切片機(jī)(Leica)、離心機(jī)、振蕩器。

1.3 方法

2 h內(nèi)送檢新鮮血性胸水樣本，混合均勻后倒入2支試管并配平,2000 r/min離心5 min，棄上清后再倒入混勻樣本2 000r/min離心5min，反復(fù)多次至標(biāo)本全部離心完；棄上清、吸取中間層細(xì)胞入干凈試管，加入20 mL混合液(PreservCyt細(xì)胞清洗液與冰醋酸9∶1配比)振蕩10 min，2000 r/min離心5 min后棄上清(如果標(biāo)本含血細(xì)胞多，可重復(fù)此步驟一次)，將沉淀物平均分成3份，加入20 mL 95%乙醇2 000 r/min離心5 min，分別靜置2 h、4 h、過夜等不同時間固定細(xì)胞；固定完成后棄上清(95%乙醇)，用擦鏡紙將沉淀物包好后放入包埋盒，經(jīng)全自動脫水機(jī)脫水、包埋、常規(guī)切片(2 μm)、全自動染色封片機(jī)HE 染色封片，鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

計算95%乙醇固定的三種時間做出的細(xì)胞蠟塊個數(shù)率，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間比較行χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

95%乙醇固定的三種時間做出的細(xì)胞蠟塊個數(shù)率，經(jīng)SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，組間比較行χ2檢驗(P>0.05)，三種不同時間做出的細(xì)胞蠟塊個數(shù)之間并無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 95%乙醇固定的三種時間做出的細(xì)胞蠟塊個數(shù)率比較 例

95%乙醇固定的三種時間做出的細(xì)胞蠟塊及HE切片外觀，可見2 h組獲取的細(xì)胞量少、細(xì)胞沉淀不成形，易松散；4 h組與過夜組的細(xì)胞量多，細(xì)胞沉淀緊湊成團(tuán)。見圖1、圖2。

注：從左到右為2 h組、4 h組、過夜組。圖1 95%乙醇固定三種時間的血性胸水細(xì)胞蠟塊外觀

注：從左到右為2 h組、4 h組、過夜組。圖2 95%乙醇固定三種時間的血性胸水細(xì)胞蠟塊HE切片外觀

95%乙醇固定三種時間的血性胸水細(xì)胞蠟塊切片鏡下結(jié)果顯示，背景干凈，并無血細(xì)胞等影響因素，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，染色分明，三組間并無明顯差別。見圖3。

圖3 95%乙醇固定三種時間的血性胸水細(xì)胞蠟塊切片(HE ×200)

3 討論

細(xì)胞蠟塊可以永久保存，重復(fù)多次制片，多項實驗表明細(xì)胞蠟塊可以進(jìn)行免疫組織化學(xué)、分子檢測、原位雜交、提取DNA、RNA對疾病進(jìn)行深入研究等等[2-3]，在臨床應(yīng)用越來越廣。但細(xì)胞蠟塊制作的效果是成敗的關(guān)鍵因素，尤其是血性標(biāo)本，前期紅細(xì)胞處理不好，切片時掉片，無法常規(guī)切片HE染色鏡下診斷，更別提做免疫組化等進(jìn)一步鑒別檢測了。目前，研究主要是采用明膠海綿法、瓊脂法、蛋清法、血漿凝固法等[4-7]制作細(xì)胞蠟塊，這些方法制作有試劑種類多、花費大、步驟繁瑣、用時長等不足之處；本實驗結(jié)合科室的實際情況，尋找一種簡捷、高效、價廉的方法，研究結(jié)果表明選取4h固定的細(xì)胞方法制作的血性胸水細(xì)胞蠟塊效果好，細(xì)胞量多、制片完整，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、背景干凈，能滿足于免疫組織化學(xué)、分子等各項檢測條件。

首先，95%乙醇固定的三種時間做出的細(xì)胞蠟塊個數(shù)率比較，雖然差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，但從實驗過程中得出，95%乙醇固定2 h組的，沉淀物并不完全成形、松散、易碎，黏附于試管壁，并不能最大程度獲得樣本量；4 h組與過夜組的沉淀物成形，可以完整取出，獲得最多樣本量；圖1、圖2切片外觀結(jié)果顯示的就是2 h組的沉淀物松散不成團(tuán)，而4 h和過夜組的緊湊成團(tuán)；鏡下結(jié)果三組間并無明顯差別，背景干凈，并無血細(xì)胞等影響因素，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，染色分明。因此綜合時間及制作效果考慮，固定4 h為最佳狀態(tài)，過夜則耗時太長。

我們在處理血性胸水時，標(biāo)本全部離心，盡可能多的獲取診斷細(xì)胞，滿足各種檢測所需的細(xì)胞量。其次，關(guān)鍵步驟就是對紅細(xì)胞進(jìn)行處理。血性胸水含大量紅細(xì)胞，切片時標(biāo)本會掉片；且診斷意義的細(xì)胞被大量紅細(xì)胞包裹覆蓋，結(jié)構(gòu)模糊、不易識別診斷、影響免疫組織化學(xué)結(jié)果等等；已有研究表明冰醋酸可高效清洗紅細(xì)胞及細(xì)胞碎片[8]，結(jié)合本科室膜式液基薄層細(xì)胞技術(shù)制片時清洗紅細(xì)胞的方法，用冰醋酸與PreservCyt細(xì)胞清洗液的混合液(1∶9)與沉淀細(xì)胞混合、充分震蕩接觸處理溶解紅細(xì)胞，離心后棄上清(可重復(fù)一次)。此步驟去除紅細(xì)胞等干擾因素后，鏡下結(jié)果顯示診斷意義細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、背景干凈、無紅細(xì)胞包裹、覆蓋等干擾背景，最大程度的獲取更多診斷意義的細(xì)胞，這樣有利于更進(jìn)一步的免疫分子檢測。

再次，95%乙醇是專門固定細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的固定劑，有固定兼脫水作用；而甲醛滲透力很強(qiáng)、通過蛋白分子交聯(lián)、硬化等而固定組織。本實驗在處理完紅細(xì)胞步驟后，在沉淀物中加入20 mL的95%乙醇進(jìn)行預(yù)固定4 h，使蛋白變性、組織硬化等作用凝聚固定細(xì)胞，然后再進(jìn)入全自動脫水機(jī)里進(jìn)行1.5h的10%甲醛固定，使蛋白交聯(lián)更進(jìn)一步起固定作用。本研究采用95%乙醇與10%甲醛兩者相結(jié)合的固定方式，使細(xì)胞在固定液濃度、性質(zhì)上有梯度變化，兩者結(jié)合更好的固定細(xì)胞。在固定時間上，研究表明2 h為細(xì)胞最佳固定效果[9]，本實驗結(jié)果與前人研究有出入，本實驗得出4 h后細(xì)胞成團(tuán)緊湊，整個沉淀物可完整挑出且獲得最多細(xì)胞量；用擦鏡紙包好后放入包埋盒中，經(jīng)全自動脫水機(jī)脫水、透明、浸蠟等步驟，再包埋、切片、全自動染色機(jī)HE染色完成細(xì)胞蠟塊制作。鏡下結(jié)果也顯示細(xì)胞形態(tài)正常、背景干凈、無紅細(xì)胞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，很容易進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷。

綜上所述，本實驗對95%乙醇固定時間、紅細(xì)胞處理、細(xì)胞固定液步驟選擇上進(jìn)行了摸索，實驗結(jié)果也證實95%乙醇預(yù)固定4h后的切片完整不掉片、背景干凈、細(xì)胞形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)清晰、獲取細(xì)胞量多。本研究方法試劑需求少、步驟簡單、花費低，因此可用于血性胸水細(xì)胞蠟塊的制作，協(xié)助細(xì)胞學(xué)診斷精準(zhǔn)化。

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