據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》標(biāo)準(zhǔn)所示，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）主要有乳桿菌、鏈球菌以及雙歧桿菌三種菌屬，并在食品、藥品中廣泛存在。為響應(yīng)國家對食品安全的監(jiān)管，本文特從不同角度鑒定食品中的乳酸菌菌種水平，詳細(xì)研究過程如下：

資料與方法

一般資料。本次研究所有菌種均采自某市微生物菌種保藏中心，共計15株。其中乳酸桿菌6株，雙歧桿菌7株，鏈球菌2株。

鑒定儀器：（1）API鑒定系統(tǒng)、API 50 CHL板條、API 20A 板條（生產(chǎn)廠家：法國生物梅里埃公司）；（2）RP耗材樣品制備包（生產(chǎn)廠家：美國杜邦公司）；（3）生化管（生產(chǎn)廠家：杭州濱和微生物）；（4）Riboprinter全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（生產(chǎn)廠家：美國Dupont公司）；（5）Quantity One紫外成像儀、電泳儀（生產(chǎn)廠家：美國BioRad公司）；（6）Veritii PCR擴(kuò)增儀（生產(chǎn)廠家：美國ABI公司），體積為50μL[2]。

鑒定試劑：（1）細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（生產(chǎn)廠家：北京天根生物）；（2）DNA Marker、PCR緩沖體系（緩沖液5μL，含MgCl2）以及rTaqDNA聚合酶（生產(chǎn)廠家：大連寶生物工程有限公司）0.25μL；（3）正向引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）、反向引物1492R（5-TACGGCTACCTGTTACTT-3）各200pmol/L。

鑒定方法。染色鏡檢：根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》中乳酸菌的生化反應(yīng)指標(biāo)，篩選單菌落革蘭染色鏡檢。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗雙歧桿菌的鑒定》檢驗雙歧桿菌。

API鑒定：乳酸桿菌由API 50 CHL板條進(jìn)行鑒定，雙歧桿菌由API 20A 板條進(jìn)行鑒定。

分析法鑒定：（1）16S rRNA基因序列分析法鑒定：由DNA提取試劑盒提取單菌落細(xì)菌基因組DNA，100℃熱蓋，95℃持續(xù)變性1min，56℃退火30s，72℃延伸90s，PCR循環(huán)共30個；72℃延伸10min；采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，利用紫外凝膠成像分析儀觀察電泳結(jié)果，然后通過Clustalw軟件對測序結(jié)果加以分析，并通過GenBank數(shù)據(jù)庫行BLAST對比。（2）RiboPrinter指紋圖譜分析法鑒定：將單菌落懸浮于緩沖液內(nèi)，并作95℃處理，隨即加入裂解液A、B 5μL，然后采用Riboprinter全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

結(jié)果

染色鏡檢。鑒定結(jié)果顯示，1株乳酸桿菌和1株鏈球菌的生化反應(yīng)不符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》標(biāo)準(zhǔn)，但5株乳酸桿菌和1株鏈球菌的生化反應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)。6株雙歧桿菌的生化反應(yīng)不符合標(biāo)準(zhǔn)，僅1例完全符合。如圖所示，所有菌株均為革蘭陽性菌，無芽孢。

API鑒定。4株乳桿菌鑒定結(jié)果顯示“類干酪乳桿菌干酪亞種”，未達(dá)到“種”水平。2株雙歧桿菌鑒定結(jié)果顯示“內(nèi)放線菌”，未達(dá)到“屬”水平；4株雙歧桿菌鑒定結(jié)果顯示“雙歧桿菌1”，未達(dá)到“種”水平。2株乳桿菌、2株鏈球菌以及1株雙歧桿菌鑒定結(jié)果均達(dá)到“種”水平。

分析法鑒定。16S rRNA基因序列分析法鑒定：15株中12株鑒定結(jié)果達(dá)到“種”或“亞種”水平，但3例未達(dá)到。RiboPrinter指紋圖譜分析法鑒定：15株中11株鑒定結(jié)果達(dá)到“種”或“亞種”水平，3例未達(dá)到，1例未能鑒定。

討論

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》指出，菌株不同，其生理生化特征存在明顯差異，因此本文結(jié)果顯示6株雙歧桿菌的生化反應(yīng)不符合標(biāo)準(zhǔn)，且API鑒定結(jié)果顯示15株中10株僅達(dá)到“屬”水平。

而分析法鑒定結(jié)果相對理想，比如16S rRNA基因序列分析法和RiboPrinter指紋圖譜分析法通過PCR對DNA片段加以選擇，不受培養(yǎng)條件限制，其鑒定結(jié)果如本文所示：15株中11株鑒定結(jié)果達(dá)到“種”或“亞種”水平。綜合以上三種鑒定方法可知，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》與《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗雙歧桿菌的鑒定》的染色鏡檢雖具有一定乳桿菌、鏈球菌的鑒定能力，但雙歧桿菌的鑒定水平不足；而API對三種菌屬的鑒定能力基本一致，但整體水平相對較弱，無法達(dá)到“種”水平；相較以上兩種方法，分析法鑒定既符合國家標(biāo)準(zhǔn)，同時又對API鑒定進(jìn)行了有效補(bǔ)充。

綜上所述，在食品檢驗中，分析法鑒定水平最高，為食品安全提供有力保障，值得大力推廣。