燕曉翠　楊春蕾　姚大為　馬毅　胡香玉　白忠良　鄭成江　范寰

摘 要：抗菌肽為大多數(shù)生物對(duì)入侵病原體的自然防御系統(tǒng)的重要組成部分，因其抗菌作用機(jī)制特異，能夠迅速殺菌且不易導(dǎo)致耐藥性，可單獨(dú)使用或與抗生素聯(lián)合作用，成為一類具有極大發(fā)展?jié)摿Φ奶烊凰幬?。綜述了抗菌肽的來(lái)源和生物學(xué)活性，重點(diǎn)闡述了近年來(lái)抗菌肽研發(fā)與應(yīng)用的國(guó)內(nèi)外進(jìn)展及其發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：抗菌肽；來(lái)源；生物學(xué)活性；研發(fā)；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S853.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.008

Abstract： Antimicrobial peptides are important components of the natural defenses of most living organisms against invading pathogens. The unique antibacterial mechanism， direct bactericidal effect， relatively slow of resistance acquirement， and can use alone or combine with antibiotics， make antimicrobial peptides be attractive potential antibacterial drugs. This paper reviewed the source of antibacterial peptides and biological activity， and emphatically introduced domestic and abroad research progresses and prospects of antimicrobial peptides.

Key words：antibacterial peptides； source； biological activity； research and development；application

自青霉素發(fā)現(xiàn)以來(lái)，抗生素開始在全球廣泛應(yīng)用，人類逐漸進(jìn)入控制和治療微生物感染性疾病的時(shí)代，抗生素在人類疾病的預(yù)防與治療、養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)品數(shù)量與質(zhì)量提高方面發(fā)揮了重要的作用。然而，各類抗生素的濫用卻導(dǎo)致了致病菌的進(jìn)化加速，造成耐藥菌及多重耐藥菌大量出現(xiàn)的現(xiàn)狀。但是抗生素的研發(fā)并沒有跟上抗藥性細(xì)菌進(jìn)化的速度，而且西方很多抗生素生產(chǎn)公司由于產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益不大，且報(bào)批困難等原因，陸續(xù)退出了抗生素藥物的研發(fā)，從而導(dǎo)致近年來(lái)新批準(zhǔn)的抗生素類藥物在不斷地減少，甚至出現(xiàn)新抗生素的研發(fā)空白。耐藥細(xì)菌及多重耐藥細(xì)菌的不斷出現(xiàn)及進(jìn)化與抗生素的研發(fā)空白，使得新型抗菌藥物的開發(fā)迫在眉睫[1]。近些年，研究工作者對(duì)寡聚糖、益生菌、植物提取物、抗菌肽等添加劑進(jìn)行了大量的研究，力圖尋找其替代抗生素的可行性，尤其是普遍存在于生物體內(nèi)、具有多種生物學(xué)功能的抗菌肽[2]，被發(fā)現(xiàn)具有抗菌譜廣、抗菌活性高、不易產(chǎn)生抗藥性、作用機(jī)理獨(dú)特[3]，熱穩(wěn)定性和水溶性好，對(duì)高等動(dòng)物的正常細(xì)胞幾乎無(wú)毒害作用，在蛋白質(zhì)分子四級(jí)結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)方面顯示出的多樣性等多重優(yōu)勢(shì)。因此，抗菌肽成為國(guó)內(nèi)外動(dòng)物和人類醫(yī)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、飼料（食品）學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域研究和開發(fā)的熱點(diǎn)，生物抗菌肽的開發(fā)利用有望成為解決耐藥菌問(wèn)題的理想途徑，有著廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[4]。

1 抗菌肽的來(lái)源

到目前為止，已發(fā)現(xiàn)了2 600多種抗菌肽[5]，它們分布廣泛，病毒、細(xì)菌、真菌、魚類、鳥類、昆蟲、兩棲動(dòng)物、軟體動(dòng)物和哺乳動(dòng)物等生物中均有分布。

1.1 微生物抗菌肽

微生物抗菌肽有細(xì)菌抗菌肽和病毒抗菌肽2類。其中，來(lái)自細(xì)菌的抗菌肽也被稱為細(xì)菌素，細(xì)菌素是在代謝過(guò)程中某些細(xì)菌通過(guò)蛋白分子產(chǎn)生途徑生成的一類帶有殺菌生物活性的多肽分子或前體多肽分子，通常這些多肽分子都是一些陽(yáng)離子氨基酸鏈，具有疏水性或兩親性。根據(jù)生物化學(xué)性質(zhì)，細(xì)菌素可分為3 類：Ⅰ類細(xì)菌素、Ⅱ類細(xì)菌素和Ⅲ類細(xì)菌素。其中，Ⅰ類細(xì)菌素又被稱為硫醚抗生素，分子質(zhì)量小于5 ku，氨基酸數(shù)量大概在19～38個(gè)，具有黏膜活性，耐熱性也較好，其結(jié)構(gòu)中含有少見的硫醚氨基酸，如羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨（β-methyllanthione），分為A型lantibiotics 和B型lantibiotics共2類。Ⅱ類細(xì)菌素是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類被稱為乳酸細(xì)菌素的細(xì)菌抗菌肽，基于它們的生物學(xué)性質(zhì)和理化特性，可作為食品保藏劑。與Ⅰ類細(xì)菌素相比，Ⅱ類細(xì)菌素的分子質(zhì)量稍?。?～6 ku），具有熱穩(wěn)定性，又可以分為4 小類。Ⅲ類細(xì)菌素是由細(xì)菌的前蛋白轉(zhuǎn)位酶分泌的，分子質(zhì)量大于30 ku，耐熱性好[6]。另一類是病毒抗菌肽，這一類抗菌肽目前發(fā)現(xiàn)種類比較少。其中，LLPs是由人類缺陷病毒1型（HIV-1）跨膜蛋白的C 末端序列編碼的慢病毒細(xì)胞溶解肽，對(duì)微生物和細(xì)胞毒性作用很強(qiáng)；LLPs 精氨酸含量高且不含賴氨酸[7]。大多數(shù)情況下，微生物抗菌肽是以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在的。

1.2 植物抗菌肽

植物抗菌肽對(duì)植物病原體以及感染人的細(xì)菌病原體都有活性作用，是植物防御系統(tǒng)的屏障，被認(rèn)為是具有重要應(yīng)用前景的抗生素類多肽。常見的植物抗菌肽有硫素、防御素、環(huán)肽類蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、細(xì)胞穿透肽、蛻皮素等，它們具有相似的特征，如帶有正電荷、具有二硫鍵（穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)）作用的靶位點(diǎn)都位于細(xì)胞外膜等[8]。

1.3 昆蟲抗菌肽

昆蟲是生物界中種類最豐富的生物，大約有100多萬(wàn)種，同時(shí)具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力和發(fā)達(dá)的防御機(jī)制?？咕氖抢ハx在受到外界環(huán)境刺激時(shí)，由血淋巴或機(jī)體相關(guān)部位產(chǎn)生的一類多肽，其是昆蟲體液免疫系統(tǒng)的有機(jī)組成部分，在整個(gè)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，其脂肪體（功能類似于哺乳動(dòng)物的肝臟）分泌的抗菌肽對(duì)各系統(tǒng)的病原體起抑制作用。迄今為止，在昆蟲體內(nèi)分離到的抗菌肽大約有200多種，這些多肽根據(jù)其抗菌機(jī)制及氨基酸的序列組成被分為5 種：cecropins、溶菌酶、防御素、富含甘氨酸的多肽及富含脯氨酸的多肽[9]。

1.4 兩棲動(dòng)物抗菌肽

兩棲類動(dòng)物的皮膚外露、濕度較高，并具有一定的呼吸功能，這種形態(tài)及生理的特異性要求其僅能在潮濕的環(huán)境中生存，這同是一些病原微生物生存的極佳環(huán)境。為了開拓和適應(yīng)廣闊的棲息地及多樣的生態(tài)環(huán)境，通過(guò)不斷地選擇進(jìn)化，兩棲類動(dòng)物最終形成了可抵御病原微生物的防御系統(tǒng)。皮膚腺體釋放的先天性免疫的重要效應(yīng)分子——抗菌肽，在兩棲類動(dòng)物受到腎上腺素、應(yīng)激、外傷等因素刺激時(shí)，在兩棲類動(dòng)物的免疫防御機(jī)制中有重要效應(yīng)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期進(jìn)化，抗菌肽基因出現(xiàn)了多重復(fù)制和突變，產(chǎn)生出大量結(jié)構(gòu)和種類繁多的抗菌肽。目前，已有1 400種抗菌肽從兩棲類動(dòng)物皮膚分泌物中分離出來(lái)，不同來(lái)源的分泌物中含有不同的抗菌生物活性分子。兩棲動(dòng)物抗菌肽根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為2類：含有分子內(nèi)二硫鍵的環(huán)狀抗菌肽和具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性抗菌肽[10]。

1.5 哺乳動(dòng)物抗菌肽

哺乳動(dòng)物體內(nèi)抗菌肽只對(duì)外源性病原菌具有殺傷作用，而對(duì)動(dòng)物體自身正常細(xì)胞無(wú)害。哺乳動(dòng)物抗菌肽主要存在于黏膜的上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及皮膚，如呼吸道中的表面活性物質(zhì)陰離子抗菌肽，上皮組織中的防御素，這些抗菌肽與吞噬細(xì)胞共同建立了機(jī)體的第一道防線[11]。哺乳動(dòng)物抗菌肽主要分為2類，即防御素（defensins）和cathelicidins。研究最多的防御素類抗菌肽，是抗菌肽家族最大的一類。哺乳動(dòng)物防御素分為α-defensins和β- defensins兩大類[12]。

1.6 海洋生物抗菌肽

海洋是生命的起源地，也是生物的巨大生存地，推算得知，全球約1/2的生物生活在海洋中。這一巨大生物庫(kù)中蘊(yùn)藏著豐富的抗菌活性物質(zhì)，此前已證明，種類繁多的海洋生物能產(chǎn)生多種多樣的抗菌肽，其中關(guān)于海洋動(dòng)物抗菌肽的研究占大多數(shù)。海洋脊椎動(dòng)物中以魚類分泌抗菌肽報(bào)道最多，因其身體結(jié)構(gòu)的特異性，抗菌肽主要分泌到海洋魚類的黏液層，其作為非特異性免疫系統(tǒng)的第一道屏障，將致病細(xì)菌在進(jìn)入生物機(jī)體前殺滅。海洋生物抗菌肽具有合成分泌迅速，擴(kuò)散速度快和靈活等特點(diǎn)，是其他免疫系統(tǒng)成分作用功能所不及的。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物如軟體動(dòng)物、被囊動(dòng)物、甲殼動(dòng)物等主要依靠體液免疫和細(xì)胞反應(yīng)的先天免疫機(jī)制作為防御系統(tǒng)。而其中抗菌肽作為先天免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成成分，能快速和即時(shí)地對(duì)入侵的病原微生物做出反應(yīng)[13]。

2 抗菌肽的生物活性

2.1 廣譜抗細(xì)菌活性

經(jīng)試驗(yàn)證明，抗菌肽具有廣譜抗細(xì)菌活性。乳酸鏈球菌素和天蠶素有抗銅綠假單胞菌的活性，而且與Ranalexin和BuforinⅠ聯(lián)合應(yīng)用對(duì)氨芐西林抗性的表皮葡萄球菌有明顯的滅菌效果?？咕膶?duì)囊括了革蘭氏陽(yáng)性、革蘭氏陰性以及革蘭氏兼性的細(xì)菌都具有殺傷作用。絕大多數(shù)抗菌肽能夠抵抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，但在抗菌活性方面不同種抗菌肽間存在較大差異，且抗菌譜也有差異[4]。研究顯示，2種或多種抗菌肽間甚至抗菌肽與傳統(tǒng)的抗生素之間在作用于同一細(xì)菌時(shí)有輔助和協(xié)同作用，將抗菌肽和抗生素同時(shí)使用能夠增強(qiáng)治療效果，或者拓寬二者的抗菌譜[9]。

2.2 抗真菌活性

抗菌肽具有抗真菌作用，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗真菌肽有果蠅抗菌肽、貽貝素、線肽素、蝎血素、cecropins以及通過(guò)人工改造形成的抗菌肽等[14]。研究表明，抗菌肽抗真菌活性的強(qiáng)弱與真菌的屬、種和孢子的狀態(tài)有關(guān)[15]。例如，天蠶素對(duì)鐮刀菌屬的病原菌和曲霉菌屬有抑菌作用。來(lái)自人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物分泌的唾液組蛋白也有抗真菌的活性，它是通過(guò)與真菌細(xì)胞的胞膜受體結(jié)合，然后進(jìn)入細(xì)胞并定位于線粒體，滅菌機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)胞體三磷酸腺苷丟失引起細(xì)胞凋亡[2]。

2.3 抗病毒活性

研究表明，多種抗菌肽如人鱟源抗菌肽美洲鱟素（polyphemusin）、牛中性粒細(xì)胞indolicidin、α-防御素（humanα-defensin，HNP）等都具有抗病毒活性?？咕目赡芾枚喾N抗病毒機(jī)制發(fā)揮活性，被作用的病毒具有相似的結(jié)構(gòu)特征：具有膜結(jié)構(gòu)，如皰疹病毒型口炎病毒、皰疹病毒和艾滋病病毒[16]。部分抗菌肽通過(guò)與病毒膜結(jié)構(gòu)的直接結(jié)合發(fā)揮抗病毒活性，如美洲鱟素對(duì)HIV病毒的作用和α-防御素對(duì)皰疹病毒的作用等。部分抗菌肽可以阻止病毒的繁殖，如蜂毒素（melittin）、天蠶素A（cecropinA）在亞毒性濃度下通過(guò)抑制基因表達(dá)來(lái)阻止HIV-1 病毒的增殖[9]；還有部分抗菌肽，如蜂毒素是通過(guò)擾亂病毒的組裝程序而對(duì)病毒產(chǎn)生抑制效應(yīng)[4]。

2.4 抗寄生蟲活性

抗菌肽還可用于治療宿主感染、控制傳染疾病傳播，或預(yù)防和阻止攜帶寄生蟲的昆蟲宿主造成的疾病傳播。某些抗菌肽能夠高效地將寄生于動(dòng)物或人類體內(nèi)的寄生蟲殺死[9]?？咕淖饔糜谠x的胞膜，能夠間接引起細(xì)胞的細(xì)胞器和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變，擾亂細(xì)胞的正常代謝，從而殺滅寄生蟲[17]。

2.5 抗癌細(xì)胞活性

抗菌肽能對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有特異性的抑制作用，而對(duì)機(jī)體正常體細(xì)胞沒有負(fù)面影響。已有文獻(xiàn)報(bào)道，抗菌肽對(duì)肝癌細(xì)胞[18]、膀胱癌細(xì)胞[19]和宮頸癌細(xì)胞[20]的殺傷作用以及劑量的相關(guān)研究，如SUTTMANN等[19]通過(guò)試驗(yàn)證明，一定劑量的天蠶素A和天蠶素B可以有效抑制膀胱癌細(xì)胞的生存和繁殖（天蠶素A和天蠶素B針對(duì)所有膀胱癌細(xì)胞的MIC50為73.29～220.05 g·mL-1），相比之下對(duì)正常成纖維細(xì)胞幾乎沒有影響。

3 抗菌肽開發(fā)應(yīng)用

3.1 抗菌肽研發(fā)

抗菌肽因其獨(dú)有的廣譜抗菌、調(diào)節(jié)先天免疫和不易產(chǎn)生耐藥性等諸多特性而備受關(guān)注。目前，已有抗菌肽產(chǎn)品得到開發(fā)應(yīng)用，并且反應(yīng)效果良好。但是純天然的抗菌肽大量開發(fā)應(yīng)用依然不足，如天然產(chǎn)量少、毒副作用大、生產(chǎn)成本高和生產(chǎn)條件復(fù)雜等。因此，基于其物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)對(duì)抗菌肽進(jìn)行分子設(shè)計(jì)、優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)改造和修飾是研發(fā)階段的首要問(wèn)題，也是控制整體大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素[21]。

3.1.1 抗菌肽分子改造 現(xiàn)階段，抗菌肽改造主要追求實(shí)現(xiàn)降低毒性和提高其抗菌活性兩大目標(biāo)。改造手段主要包括殘基取代和截?cái)?、?gòu)建雜合肽等。許多人工改造分子設(shè)計(jì)都是針對(duì)其各種氨基酸組成比例與序列進(jìn)行改編。這類改造方法分2種，一是只改變氨基酸的順序而不改變其種類；二是通過(guò)氨基酸的種類增減，從而使其因結(jié)構(gòu)的變化而產(chǎn)生新性能。突變可引起氨基酸殘基的替換、插入、移碼或者刪減等，是研究抗菌肽結(jié)構(gòu)功能時(shí)的常用方法。通過(guò)對(duì)抗菌肽分子改造修飾，能使其功能產(chǎn)生顯著優(yōu)勢(shì)變化，如抗菌活性提升、抗癌能力加強(qiáng)、高表達(dá)量和溶血性減弱等。明飛平等[22]通過(guò)PCR 敲除抗菌肽PR39 的5' 24個(gè)核苷酸，再人工構(gòu)建已刪除8個(gè)核苷酸的新型表達(dá)載體pPIC9K-PR39-D-E，改造后的抗菌肽對(duì)E. coli DH5α有明顯的抑菌活性。天然抗菌肽中部分結(jié)構(gòu)對(duì)其活性沒有影響，甚至較大的肽鏈會(huì)對(duì)抗菌肽的穩(wěn)定性、免疫原性等產(chǎn)生影響。研究證明[23]，僅含有8個(gè)氨基酸的Temporin-SHf抗菌肽具有抗菌譜較廣的特性。因此，截?cái)嗳コ涠嘤嘟Y(jié)構(gòu)、保持活性部分是重要改良措施之一。如對(duì)含有半胱氨酸殘基的植物AMPs 的thionin 通過(guò)多點(diǎn)截?cái)嗪蟮玫揭粭l與親本AMPs 活性相同的小分子AMPs，其同親本一樣對(duì)多種病原菌均表現(xiàn)出明顯的抗性[24]。目前，雜合肽是抗菌肽分子改造中應(yīng)用最廣泛的方法之一，研究者們借鑒蛋白質(zhì)工程和酶工程生產(chǎn)雜合蛋白和雜合酶，通過(guò)分析不同抗菌肽的理化性質(zhì)和活性，通過(guò)重組的方法將2 種不同抗菌肽的選定部分重新組合，形成一個(gè)新的雜合抗菌肽，從而獲得毒副作用更小和活性更高的雜合肽。XU等[25]通過(guò)選擇Cecropin A 中的1～8個(gè)氨基酸序列與Magainin 2序列中1～12個(gè)氨基酸序列進(jìn)行拼接，構(gòu)建雜合肽，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源高效表達(dá)且穩(wěn)定性有所增加。在對(duì)于低毒性抗菌肽序列設(shè)計(jì)和構(gòu)效關(guān)系研究中，TIAN 等[26]依據(jù)天蠶素Cecropin A，幽門螺桿菌肽HP（2～20）和乳鐵蛋白肽Lfcin （W4，10）等親本肽特性，設(shè)計(jì)組建新雜合抗菌肽LH28，對(duì)G+菌如枯草芽孢桿菌、G-菌如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有廣譜抗菌特性（MIC50：1.56～3.13 mol·L-1）。XI等[27]后來(lái)又嘗試引入柔性接頭（GGGGS）3 和高抗G+菌的抗菌肽Plectasin部分序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建新雜合肽LHP7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC為0.091 μmol·L-1，而雜合母體肽LH28濃度要求為 LHP7 的35.39倍，且該新雜合肽溶血特性極差，即使在1 000 mg·L-1高濃度條件下溶血率也低于5%，而相同濃度雜合母體肽LH28的溶血率是LHP7 的7倍（35%）。

3.1.2 選擇和優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng) 抗菌肽的表達(dá)系統(tǒng)分為3類：桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。這3 種表達(dá)系統(tǒng)各有突出特點(diǎn)，因此不同抗菌肽在表達(dá)時(shí)可根據(jù)其自身性質(zhì)與特點(diǎn)選擇對(duì)應(yīng)表達(dá)系統(tǒng)，并通過(guò)對(duì)其改造修飾進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。原核表達(dá)系統(tǒng)一般是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，其具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、繁殖速度快等特點(diǎn)，易進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。但因其是原核生物，不具備真核生物精確的蛋白加工系統(tǒng)，且表達(dá)量很少。酵母菌表達(dá)宿主是一種最常用的可以表達(dá)并精確修飾蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，特點(diǎn)主要體現(xiàn)在表達(dá)后對(duì)蛋白的修飾加工作用，比如糖基化的修飾[28]。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)適用范圍廣且表達(dá)效率高，與前面2個(gè)表達(dá)系統(tǒng)相比，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)操作相對(duì)簡(jiǎn)便，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)捷，且經(jīng)濟(jì)成本低，外源基因表達(dá)量高和具有翻譯后蛋白修飾加工功能[21]。

有時(shí)人們使用的載體不一定完全適合表達(dá)系統(tǒng)，因此，不少研究是針對(duì)表達(dá)系統(tǒng)的不斷優(yōu)化。將抗菌肽（已改）與表達(dá)系統(tǒng)功能蛋白氨基酸雜交是一種很好優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)的方法，LI等[29]將人類β-防御素分別與溶菌酶、凝集素和甘露糖進(jìn)行雜合；體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果證明，雜合肽對(duì)抗青霉素的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 表現(xiàn)出的抑菌效果較明顯，且雜合肽的抗菌活性比其親本更強(qiáng)。在提高抗菌肽表達(dá)產(chǎn)量及穩(wěn)定性方面，密碼子優(yōu)化是最為有效的方法。構(gòu)建抗菌肽表達(dá)載體時(shí)加入宿主系統(tǒng)菌偏好型密碼子，便可使載體高效表達(dá)出抗菌肽。這類抗菌肽密碼子不但能夠有效地表達(dá)抗菌肽，而且還減少了抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用[30-31]。REN等[32]根據(jù)抗菌肽基因SMAP-29的氨基酸序列及其表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母偏好性密碼子，設(shè)計(jì)并合成SMAP-29的成熟基因片段的表達(dá)載體，且在誘導(dǎo)表達(dá)的第2天檢測(cè)到了預(yù)期抗菌肽，并通過(guò)試驗(yàn)證明，其對(duì)白色念球菌和金黃色葡萄球菌都有顯著的抑菌作用。此外，組建不需要酶切的表達(dá)載體和5' 非翻譯區(qū)序列改建等也是常用的優(yōu)化表達(dá)載體的方法。

3.2 抗菌肽的應(yīng)用

3.2.1 抗菌肽在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 抗菌肽因具有顯著、廣譜抗菌、抗腫瘤活性，以及能夠加快傷口愈合和增強(qiáng)機(jī)體免疫等特性，使其作為天然藥物最終能夠完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素和抗腫瘤藥物成為可能。研究表明，抗菌肽能特異地抑制某些目的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)人體正常細(xì)胞無(wú)害，這給其替代傳統(tǒng)抗癌藥物的開發(fā)帶來(lái)更大希望。KIM等根據(jù)已知序列的天然AMP氨基酸，通過(guò)增減或替換的方法構(gòu)建出抗菌肽GGN6，其可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，并對(duì)具有耐藥性的乳腺癌細(xì)胞系有明顯的殺傷作用。由于抗生素的不科學(xué)使用，使“超級(jí)細(xì)菌”不斷增多，抗菌肽的出現(xiàn)能有效地解決細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題，抗菌肽的殺菌作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同，突出的特性使其代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素成為趨勢(shì)[33]。抗菌肽可在不影響人體健康細(xì)胞活性的前提下對(duì)人直腸癌HR 8340、艾氏腹水瘤EAC、髓樣白血病細(xì)胞k552 株、人宮頸癌細(xì)胞及肝癌細(xì)胞BEL27402 等起到抑制作用[34]。抗菌肽對(duì)HIV、皰疹病毒等一系列具有膜結(jié)構(gòu)病毒都有一定的殺傷作用：cecropins 和meliiins在亞毒性濃度下可以通過(guò)影響其基因表達(dá)的作用機(jī)理來(lái)抑制艾滋病病毒的增殖[35]。除此之外，抗菌肽還能加速傷口處細(xì)胞的分裂增殖，如LL-37通過(guò)加速呼吸道上皮細(xì)胞增殖與移動(dòng)，加速傷口的愈合[36]。目前，已經(jīng)有許多抗菌肽藥物逐步邁入醫(yī)藥領(lǐng)域。例如，應(yīng)用兩棲類抗菌肽magainin 開發(fā)的抗菌肽藥品MAI278已經(jīng)快要完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞和病毒都顯示具有明顯的殺傷作用。中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所鑒定了超過(guò)500種的抗菌肽分子，占全部已知抗菌肽的30%，建立了中國(guó)抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)篩選得到了10個(gè)以上的具有抗感染藥物開發(fā)潛力的抗菌肽候選藥物，并已經(jīng)完成除安全評(píng)價(jià)以外的大部分臨床前研究數(shù)據(jù)[37]。

3.2.2 抗菌肽在農(nóng)牧業(yè)上的應(yīng)用 由食品和飼料安全問(wèn)題而展開的飼料用抗生素替代品的研究是畜牧業(yè)研究與生產(chǎn)的熱點(diǎn)問(wèn)題，抗菌肽由于自身的天然特性顯示了其在農(nóng)牧業(yè)上廣泛的應(yīng)用前景。抗生素容易導(dǎo)致動(dòng)物胃腸道中菌群平衡遭到破壞，很多還會(huì)長(zhǎng)期殘留在動(dòng)物體內(nèi)，嚴(yán)重降低農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量和影響人類飲食健康。此外，抗生素的長(zhǎng)期濫用會(huì)導(dǎo)致耐藥性菌株產(chǎn)生，從而引起大面積的動(dòng)物疫情[38]。而有研究表明，添加有抗菌肽的反芻動(dòng)物飼料，可以有效提高瘤胃pH值，進(jìn)而增加動(dòng)物食欲和動(dòng)物體重。另一方面，動(dòng)物機(jī)體自身產(chǎn)生的抗菌肽，在預(yù)防或治療反芻動(dòng)物疾病方面有較好的應(yīng)用前景?？咕脑谥委熥訉m內(nèi)膜炎、奶牛乳房炎、犢牛細(xì)菌性腹瀉等病癥方面有較明顯的效果，并且沒有在血液和牛奶中檢測(cè)到殘留?；谶@些研究結(jié)果，為抗菌肽作為添加劑在反芻動(dòng)物飼料中的應(yīng)用增添了更多的說(shuō)服力[39]。仔豬在斷奶期間，容易引起身體應(yīng)激，導(dǎo)致仔豬腹瀉。有研究表明[40]，抗菌肽的殺菌作用能夠防止仔豬細(xì)菌性腹瀉，改善斷奶仔豬應(yīng)急綜合征，加速仔豬適應(yīng)能力。復(fù)合抗菌肽能夠有效提高斷奶仔豬血清抗氧化功能，增強(qiáng)仔豬抗斷奶應(yīng)激能力[41]。有研究表明，在仔豬日糧中添加300 mg·kg-1的抗菌肽，可以提高仔豬的抗氧化和免疫功能及減少仔豬盲腸中大腸桿菌的數(shù)量，對(duì)于盲腸的有益菌群沒有不良影響，同時(shí)不影響墊料蛋白酶、脲酶活性和墊料銨態(tài)氮含量。彭翔等[42]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對(duì)肉仔雞有促進(jìn)生長(zhǎng)和提高免疫力作用，聯(lián)合姜黃素使用效果更佳。

3.2.3 抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用 水產(chǎn)養(yǎng)殖一直受細(xì)菌病的困擾，抗生素又會(huì)在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期殘留，破壞腸道正常的菌群平衡，也會(huì)影響生態(tài)平衡。而研究表明，在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖飼料添加抗菌肽，能夠直接調(diào)節(jié)水產(chǎn)動(dòng)物的生理功能，顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物的成活率和消化率，有效提高機(jī)體抗氧化能力和免疫力。宋理平等[43]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦體質(zhì)量增加具有促進(jìn)作用。姜珊等[44]研究發(fā)現(xiàn)，在羅非魚飼料中添加抗菌肽，可以顯著加速羅非魚的質(zhì)量增加。柴仙琦等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對(duì)蝦飼料中分別添加300，400 mg·kg-1抗菌肽，可顯著提高血清堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶及溶菌酶活性。

4 展 望

隨著對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控和作用機(jī)制研究的不斷深入，有目的地對(duì)抗菌肽進(jìn)行人工設(shè)計(jì)和改造，甚至于人工合成抗菌肽，更好地解決抗菌肽的抗菌活性、溶血活性和表達(dá)量等問(wèn)題，為研究?jī)?yōu)化新的表達(dá)系統(tǒng)和發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)，為探究大規(guī)模表達(dá)抗菌肽的途徑提供思路?？咕牡姆N類繁多，不同的抗菌肽在大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)上依然存在種種問(wèn)題，隨著基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步和改良，這些困難有望逐一得到解決。希望通過(guò)利用異源表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)出用途更廣、種類更多和效果顯著的抗菌肽產(chǎn)品，使抗菌肽更好地服務(wù)于人類生活。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉世財(cái)， 范琳琳， 鄭珩， 等. 抗菌肽作用機(jī)制及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志， 2016， 36 （4） ： 20-23.

[2]單安山， 馬得瑩， 馮興軍， 等. 抗菌肽的功能、研發(fā)與應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（11）： 2249-2259.

[3]衛(wèi)旭彪， 武如娟， 鄭召君， 等. 抗菌肽的免疫調(diào)節(jié)功能及其作用機(jī)制[J]. 飼料工業(yè)， 2015， 36（22） ： 55-58.

[4]黎觀紅， 洪智敏， 賈永杰， 等. 抗菌肽的抗菌作用及其機(jī)制[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2011， 23（4） ： 546-555.

[5]劉明輝， 張尚志， 馬艷， 等. 抗菌肽及其分子改造研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 44（16） ： 147-150.

[6]DRIDER D， FIMLAND G， HECHARD Y， et al.The continuing story of class Ⅱa bacteriocins [J].Microbiology and Molecular biology reviews， 2006， 70（2） ： 564-582.

[7]PHADKE S M， LAZAREVIC V， BAHR C C， et al.Lentivirus lytic peptide 1 perturbs both outer and inner membranes of Serratia marcescens[J].Antimicrobial agents and chemotherapy， 2002， 46 （6） ： 2041-2045.

[8]王美玲. 植物抗菌肽及其在生物技術(shù)方面的應(yīng)用[J]. 山東食品發(fā)酵， 2015（3）： 46-49.

[9]李冠楠， 夏雪娟， 隆耀航， 等. 抗菌肽的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2014， 26（1）： 17-25.

[10]陳雯， 葉書培， 李秋燕， 等. 兩棲類動(dòng)物抗菌肽對(duì)病原微生物作用研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012（16）： 175-178.

[11]石莉蓉. 分析哺乳動(dòng)物抗菌肽及其在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)信息， 2014（15）： 72.

[12]蘇華鋒， 雷戰(zhàn)， 郭中坤， 等. 哺乳動(dòng)物抗菌肽的研究進(jìn)展[J]. 山東畜牧獸醫(yī)， 2016， 37（2）： 56-58.

[13]陳剛， 肖蕾， 劉晨光， 等. 海洋生物抗菌肽在美容業(yè)的應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J]. 廣州化工， 2015， 43（20）： 24-27.

[14]楊陽(yáng)， 孫紅瑜， 金光耀， 等. 抗菌肽的作用機(jī)理及應(yīng)用前景[J]. 中國(guó)林副特產(chǎn)， 2010（1）： 103-104.

[15]馬衛(wèi)明.豬小腸抗菌肽分離鑒定及其生物活性研究[D]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2004.

[16]趙潔， 孫燕， 李晶， 等. 動(dòng)物抗菌肽的抗病毒活性[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志， 2008， 5（5）： 466-469.

[17]BOMANH G， WADE D， BOMANI A. Antibacterial and antimalaria properties peptides that are cecropin-melittinhybrids[J]. FEBS letters， 1989， 259（1）：103-106.

[18]LU J， CHEN Z W. Isolation， characterization and anti-cancer activity of SK84， a novel glycine-rich antimicrobial peptide from Drosophila virilis[J]. Peptides， 2010， 31（1）： 44-50.

[19]SUTTMANN H， RETZ M， PAULSEN F， et al. Antimicrobial peptides of the cecropin-family show potent antitumor activity against bladder cancer cells[J]. BMC urology， 2008， 8： 5-11.

[20]MINESHIBA J， MYOKAI F， MINESHIBA F， et al. Transcriptional regulation of β-defensin-2 by lipopolysaccharide in cultured human cervical carcinoma （Hela） cells[J]. FEMS immunology and medical microbiology， 2005， 45（1）： 37-44.

[21]楊平， 袁奕豪， 楊曉莉， 等. 抗菌肽高效表達(dá)及生產(chǎn)優(yōu)化研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2016， 32（3）： 24-30.

[22]明飛平， 楊軍， 朱進(jìn)美， 等. 5'非翻譯區(qū)序列改建提高抗菌肽PR39表達(dá)[J]. 中國(guó)生物工程雜志， 2013， 33（12）： 86-91.

[23]ABBASSI F，LEQUIN O，PIESSE C，et al.Temporin-SHf，a new type ofphe-rich and hydrophobic ultrashort antimicrobial peptide[J].J BiolChem，2010，285（22） ： 16880-16892.

[24]VILA-PERELLO M，SANCHEA-Vallet A，GARCIA-OLMEDO F，et al.Structural dissection of a highly knotted peptide reveals minimal motifwith antimicrobial activity[J]. J biol chem，2005，280（2）： 1661-1668.

[25]XU X，JIN F，YU X，et al.High-Level expression of therrecombinant hybrid peptide cecropina（1-8）-magainin2（1-12）with an ubiquitin fusion partner in Escherichia coli[J]. Protein expression and purification， 2007， 55（1）： 175-182.

[26]TIAN Z， DONG T， TENG D， et al. Design and characterization of novel hybrid peptides from LFB15（W4，10）， HP（2-20）， and cecropin A based on structure parameters by computer-aided method[J]. Applied microbiology and biotechnology， 2009， 82（6）： 1097-1103.

[27]XI D， TENG D， WANG X， et al. Design， expression and characterization of the hybrid antimicrobial peptide LHP7， connected by a flexible linker， against Staphylococcus and Streptococcus[J]. Process biochemistry， 2013， 48（3）： 453-461.

[28]CREGG J M， TOLSTORUKOV I， KUSARI A，et al. Expression of Recombinant Genes in the Yeast Pichia pastoris[J]. Current protocols essential laboratory techniques， 2009， 463： 169-189.

[29]LI Q， ZHOU Y， DONG K， et al. Potential therapeutic efficacy of a bactericidal- immunomodulatory fusion peptide against methicillin-resistant Staphylococcus aureus skin infection[J]. Appl microbiol biotechnol， 2010， 86（1）： 305-309.

[30]RICHARD C， DRIDER D， ELMORJANI K， et al. Heterologous expression and purification of active divercin V41， a class iia bacteriocin encoded by a gynthetic gene in Escherichia coli[J]. Journal of bacteriology， 2004，186（13）： 4276-4284.

[31]PAZGIER M， LUBKOWSKI J. Expression and Purification of Recombinant Human Α-Defensins in Escherichia coli[J]. Protein expression and purification， 2006， 49（1）： 1-8.

[32]REN Y J， HE E P， WANG X H， et al. Codon optimization of SMAP-29 gene and its expression in Pichia pastoris[J]. Agricultural biotechnology， 2012， 1（4）： 49-53.

[33]YONG D，TOLEMAN M A，GISKE C G，et al.Characterization of a new metallo-β-lactam ase gene. blandm-1， and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India[J]. Antimicrobial agents and chemotherapy， 2009， 53 （12）： 5046-5054.

[34]韓玉萍， 翟朝陽(yáng). 抗茵肽的抗腫瘤作用[J]. 生命的化學(xué)， 2006（2）： 181-183.

[35]WACHINGE M， KLEINSCHMIDT A， WINDER D，et al.Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus 1 by suppressing viral gene expression[J]. Journal of general virology， 1998， 79（4）： 731-740.

[36]SHAYKHIEVR， BEISSWENGER C， KINDLER K， et al. Human endogenous antibiotic LL-37 stimulates airway epithelial cell proliferation and wound closure[J]. American journal of physiology： lung cellular and molecular physiology， 2005， 33 （5）： 1842-1848.

[37]梁英. 抗菌肽的來(lái)源及應(yīng)用[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2014， 26（1）： 7-16.

[38]陳星星， 江康峰. 抗菌肽的研究進(jìn)展及畜牧業(yè)的應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2016（1）： 58-61.

[39]嚴(yán)沁， 張傳強(qiáng)， 智達(dá)夫， 等. 抗菌肽在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用[J]. 畜牧與飼料科學(xué)， 2015（12）：11-14.

[40]傅志遠(yuǎn)， 吳昌標(biāo). 抗菌肽在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用現(xiàn)狀及進(jìn)展[J]. 經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)， 2016，20（3）： 179-183.

[41]但啟雄， 袁威， 李剛， 等. 復(fù)合抗菌肽對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化功能的影響[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2015 （5）： 804-808.

[42]彭翔， 孫全友， 李杰， 等. 抗菌肽和姜黃素對(duì)1-21日齡肉仔雞生長(zhǎng)性能和免疫功能的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2014， 26（2）： 1-7.

[43]宋理平， 胡斌， 王愛英， 等. 抗菌肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和機(jī)體免疫的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 30（3）： 28-32.

[44]姜珊， 王寶杰， 劉梅， 等. 飼料中添加重組抗菌肽對(duì)吉富羅非魚生長(zhǎng)性能及免疫力的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)， 2011， 18 （6）： 1308-1314.

[45]柴仙琦， 冷向軍， 李小勤， 等. 抗菌肽對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和血清非特異性免疫指標(biāo)的影響[J]. 淡水漁業(yè)， 2012， 42（4） ： 59-62.