程序進(jìn)樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的?；撬岷?/h1>
2017-05-15 01:00:47孟冰冰楊桂玲徐惠于林馬馳騁陳莎莎孫娜楊劭辰
中國調(diào)味品 2017年5期
孟冰冰，楊桂玲,2，徐惠，于林，馬馳騁，陳莎莎，孫娜，楊劭辰
(1.黑龍江省華測檢測技術(shù)有限公司，哈爾濱 150025；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.SUY有限責(zé)任公司，德國 海得堡 69117)
程序進(jìn)樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的?；撬岷?/p>
孟冰冰1，楊桂玲1,2，徐惠1，于林1，馬馳騁1，陳莎莎1，孫娜1，楊劭辰3
(1.黑龍江省華測檢測技術(shù)有限公司，哈爾濱 150025；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.SUY有限責(zé)任公司，德國 海得堡 69117)
采用程序進(jìn)樣-柱前衍生-超高效液相色譜法，在波長為330 nm下測定魚露醬油中的牛磺酸含量，得到結(jié)果：最小檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg，線性方程為Y=6.28X-1.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，回收率在95%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。該方法準(zhǔn)確，有很好的靈敏度和回收率，可以用于魚露醬油中牛磺酸的測定。
程序進(jìn)樣；柱前衍生；超高效液相色譜法；牛磺酸
1 概述
?；撬?taurine)又稱β-氨基乙磺酸，為白色的、無臭的斜狀晶體。牛磺酸的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，是一種含硫的非蛋白的氨基酸[1,2]。?；撬岱植加趧?dòng)物組織細(xì)胞內(nèi)，主要功能為促進(jìn)嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育，提高神經(jīng)傳導(dǎo)和視覺機(jī)能，防止心血管疾病的產(chǎn)生以及影響糖的代謝和改善記憶。因此，?；撬釣槿梭w不可缺少的營養(yǎng)元素之一，并且作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑被廣泛地添加到各類食品和嬰幼兒奶粉中[3-5]。
目前牛磺酸的測定方法主要有中和滴定法、液相色譜儀-柱前衍生法和柱后衍生法、氣相色譜法等[6-13]。本研究采用程序進(jìn)樣、柱前衍生的方式對牛磺酸進(jìn)行測定，使用較小的衍生化試劑，在進(jìn)樣器內(nèi)完成整個(gè)衍生實(shí)驗(yàn)，操作簡單，降低了實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的操作誤差，為牛磺酸的測定提供了可靠的依據(jù)。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 儀器與試劑
2.1.1 儀器和試劑
Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，同時(shí)配有DAD檢測器；LC OpenLab CDS Chem Station，版本為C.01.07；KQ-300GVDV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS3 漩渦混勻儀(IKA公司)；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，德國默克公司；超純水(屈臣氏)；針式濾器(0.22 μm×25 mm)PTFE(上海安譜)；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品純度99%(阿拉丁)；硼酸(科密歐)、氫氧化鉀(科密歐)、鄰苯二甲醛(英國ALFA)、乙硫醇(上海安譜)、Brij-35(上海安譜)。
2.1.2 衍生化試劑的配制
硼酸鉀溶液：30.9 g硼酸+26.3 g氫氧化鉀用水定容至1000 mL；0.6 g鄰苯二甲醛(OPA)+10 mL甲醇+0.5 mL乙硫醇+0.35 g Brij-35 用硼酸鉀水溶液定容至1000 mL。
2.2 樣品前處理
取1 mL的魚露醬油，加水稀釋至10 mL，通過針式濾器將已凈化的樣品裝入樣品瓶中。將已配制好的衍生化試劑通過針式濾器裝入樣品瓶中。
2.3 儀器條件
2.3.1 色譜條件
色譜柱為:Agilent ZORBAX EXTEND-C18(2.1 mm×50 mm×1.8 μm，美國Agilent公司)；柱溫為30 ℃； 檢測波長為330 nm；流動(dòng)相為甲醇和水；流速為0.3 mL/min。
2.3.2 進(jìn)樣器條件
抽取(在默認(rèn)位置P1-D5上抽取5 μL)；洗針(P1-D6)；抽取(在默認(rèn)位置P1-D5上抽取5 μL)；洗針(P1-D8)；混合(在針座中，共3次)；等待(0.1 min)；排出(排出5 μL至 P1-D1上)；進(jìn)樣；洗針(在P1-D8上共洗2次)。
3 結(jié)果與分析
3.1 衍生化條件的選擇
柱后衍生法：主要使用OPA為衍生化試劑，使用熒光檢測器來測定?；撬帷Ｔ摲椒ê唵?、快捷，但是使用較大量的衍生化試劑，有一定的毒性，防護(hù)不好易對實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境產(chǎn)生危害；柱前衍生法：主要使用氮磺酰氯為衍生化試劑，使用二極管陣列檢測器來測定?；撬帷Ｔ摲椒ㄊ褂醚苌噭┑膭┝枯^小，但是穩(wěn)定性較差，樣品在冷藏條件下僅能保存2天，對實(shí)驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)技能要求較高。而使用程序進(jìn)樣-柱前衍生法解決了衍生物不穩(wěn)定的難題，衍生后無需人員操作即可自動(dòng)進(jìn)入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分析，提高了工作效率，減少了人員操作而產(chǎn)生的誤差。使用Agilent ZORBAX EXTEND-C18色譜柱對?；撬徇M(jìn)行分離，得到的色譜圖見圖1～圖4。
圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(濃度為5 mg/L)
圖2 空白試劑的色譜圖
圖3 樣品中牛磺酸的色譜圖
圖4 樣品中添加?；撬岬纳V圖(添加?；撬岷繛? mg/L)
在實(shí)驗(yàn)過程中，需要做試劑空白(試劑空白：使用水直接進(jìn)行衍生)。在實(shí)際計(jì)算樣品含量時(shí)，樣品中的?；撬岷繎?yīng)當(dāng)扣除試劑空白值。試劑空白值理論上不應(yīng)高于預(yù)測值的10%，如超過10%則應(yīng)考慮更換試劑品牌和器皿。
3.2 衍生化試劑的選擇
分別使用鄰苯二甲醛衍生化試劑和丹磺酰氯衍生化試劑對?；撬徇M(jìn)行柱前衍生，結(jié)果為使用丹磺酰氯衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生靈敏度沒有使用鄰苯二甲醛衍生化試劑低，色譜峰有較明顯的拖尾現(xiàn)象，穩(wěn)定性要低于使用鄰苯二甲醛衍生化試劑對?；撬徇M(jìn)行柱前衍生，綜合考慮，使用鄰苯二甲醛衍生化試劑為本研究最終使用的衍生化試劑。
3.3 回收率、精密度、線性范圍和檢出限
使用水對?；撬針?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，使其濃度為0，10，20，30，40，100 mg/L。將此6點(diǎn)6個(gè)濃度的水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn), 每個(gè)水平做6個(gè)平行，計(jì)算平均值。使用外標(biāo)法進(jìn)行定量，得到結(jié)果為在0～100 mg/L線性范圍內(nèi)回收率良好，且最小檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg，線性方程為Y=6.28X-1.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，回收率在95%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。
表1 ?；撬岬幕厥章始癛SDs(n=6)
4 結(jié)論
使用程序進(jìn)樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的牛磺酸含量，方法簡單快速，準(zhǔn)確度和靈敏度高， 實(shí)驗(yàn)成本低、毒性小，適合飲料中?；撬岷康臏y定。
[1]張彤,山廣志,余立.柱后衍生HPLC法測定?；撬犷w粒的含量[J].中國新藥雜志，2010(4):83-85.
[2]劉輝,徐應(yīng)軍,周瑞華,等.熒光法測定啤酒中?；撬岷縖J].釀酒科技，2005(5):87-88,91.
[3]張燕婉.氨基酸分析儀法測定肉食品中?；撬岷縖J].肉類研究，1996(1):37-39,47.
[4]李秀花,邱服斌,肖榮,等.紫外分光光度法測定動(dòng)物腦組織中?；撬岷縖J].山西醫(yī)藥雜志，2001(3):25-26.
[5]葉思平,陳悅嬌,陳海光,等.高效液相色譜測定益智仁中的?；撬岷縖J].食品科學(xué)，2013(10):212-214.
[6]高加龍,章超樺,劉書成,等.鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法測定馬氏珠母貝中?；撬岷縖J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007(1):59-62.
[7]李詠梅,李人宇.高靈敏分光光度法測定貝類中?；撬岷縖J].現(xiàn)代化工，2013(10):140-143.
[8]徐鳳云,楊玉霞.HPLC法柱后衍生測定乳粉中?；撬岷坎淮_定度評定[J].生命科學(xué)儀器，2009(6):48-50.
[9]A M Petrosian,J E Haroutounian. Taurine as a universal carrier of lipid soluble vitamins: a hypothesis[J].Amino Acids,2000(2):409-421.
[10]孫變娜,沈和定,吳洪喜,等.高效液相色譜法測定4種石磺中?；撬岬暮縖J].海洋漁業(yè)，2015(1):95-100.
[11]劉亞風(fēng),祝偉霞,袁萍,等.超高效親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測?；撬犷w粒和?；撬岬窝垡褐信；撬岬暮縖J].分析試驗(yàn)室，2011(3):107-109.
[12]方燦.柱前衍生-高效液相色譜法測定七維?；撬峥诜芤褐信；撬岬暮縖J].藥物分析雜志，2007(7):172-174.
[13]Angelo Zinellu,Salvatore Sotgia,Scanu Bastianina,et al. Taurine determination by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection: from clinical field to quality food applications[J].Amino Acids，2009(1):155-159.
Determination of Taurine in Fish Sauce by Program Sampling-Precolumn Derivatization-Ultra Performance Liquid Chromatography
MENG Bing-bing1, YANG Gui-ling1, XU Hui1,YU Lin1, MA Chi-cheng1,CHEN Sha-sha1, SUN Na1, YANG Shao-chen3
(1.Centre Testing International Corporation,Harbin 150025,China; 2.Harbin Food Industry Institute,Harbin 150025,China; 3.SUY GmbH,Heidelberg 69117,Germany)
The taurine in fish sauce is detected by program sampling-precolumn derivatization-ultra performance liquid chromatography at a wavelength of 330 nm, the results are as follows: the minimum detection limit is 5 mg/kg, and the quantitation limit is 15 mg/kg, the linear equation is Y=6.28X-1.01, the correlation coefficient is 0.9998. The recovery rate is in the range of 95%～105%, and the relative standard deviation is less than 10%. The method is accurate, with good sensitivity and recovery, and it can be used for the determination of taurine in fish sauce.
program sampling；precolumn derivatization；ultra performance liquid chromatography；taurine
2016-12-09
孟冰冰(1981-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士，研究方向：植物保護(hù)。
TS264.21
A
10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.032
1000-9973(2017)05-0138-03
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孟冰冰，楊桂玲,2，徐惠，于林，馬馳騁，陳莎莎，孫娜，楊劭辰
(1.黑龍江省華測檢測技術(shù)有限公司，哈爾濱 150025；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.SUY有限責(zé)任公司，德國 海得堡 69117)
程序進(jìn)樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的?；撬岷?/p>
孟冰冰1，楊桂玲1,2，徐惠1，于林1，馬馳騁1，陳莎莎1，孫娜1，楊劭辰3
(1.黑龍江省華測檢測技術(shù)有限公司，哈爾濱 150025；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.SUY有限責(zé)任公司，德國 海得堡 69117)
采用程序進(jìn)樣-柱前衍生-超高效液相色譜法，在波長為330 nm下測定魚露醬油中的牛磺酸含量，得到結(jié)果：最小檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg，線性方程為Y=6.28X-1.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，回收率在95%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。該方法準(zhǔn)確，有很好的靈敏度和回收率，可以用于魚露醬油中牛磺酸的測定。
程序進(jìn)樣；柱前衍生；超高效液相色譜法；牛磺酸
1 概述
?；撬?taurine)又稱β-氨基乙磺酸，為白色的、無臭的斜狀晶體。牛磺酸的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于乙醚等有機(jī)溶劑，是一種含硫的非蛋白的氨基酸[1,2]。?；撬岱植加趧?dòng)物組織細(xì)胞內(nèi)，主要功能為促進(jìn)嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育，提高神經(jīng)傳導(dǎo)和視覺機(jī)能，防止心血管疾病的產(chǎn)生以及影響糖的代謝和改善記憶。因此，?；撬釣槿梭w不可缺少的營養(yǎng)元素之一，并且作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑被廣泛地添加到各類食品和嬰幼兒奶粉中[3-5]。
目前牛磺酸的測定方法主要有中和滴定法、液相色譜儀-柱前衍生法和柱后衍生法、氣相色譜法等[6-13]。本研究采用程序進(jìn)樣、柱前衍生的方式對牛磺酸進(jìn)行測定，使用較小的衍生化試劑，在進(jìn)樣器內(nèi)完成整個(gè)衍生實(shí)驗(yàn)，操作簡單，降低了實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的操作誤差，為牛磺酸的測定提供了可靠的依據(jù)。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 儀器與試劑
2.1.1 儀器和試劑
Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，同時(shí)配有DAD檢測器；LC OpenLab CDS Chem Station，版本為C.01.07；KQ-300GVDV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS3 漩渦混勻儀(IKA公司)；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，德國默克公司；超純水(屈臣氏)；針式濾器(0.22 μm×25 mm)PTFE(上海安譜)；?；撬針?biāo)準(zhǔn)品純度99%(阿拉丁)；硼酸(科密歐)、氫氧化鉀(科密歐)、鄰苯二甲醛(英國ALFA)、乙硫醇(上海安譜)、Brij-35(上海安譜)。
2.1.2 衍生化試劑的配制
硼酸鉀溶液：30.9 g硼酸+26.3 g氫氧化鉀用水定容至1000 mL；0.6 g鄰苯二甲醛(OPA)+10 mL甲醇+0.5 mL乙硫醇+0.35 g Brij-35 用硼酸鉀水溶液定容至1000 mL。
2.2 樣品前處理
取1 mL的魚露醬油，加水稀釋至10 mL，通過針式濾器將已凈化的樣品裝入樣品瓶中。將已配制好的衍生化試劑通過針式濾器裝入樣品瓶中。
2.3 儀器條件
2.3.1 色譜條件
色譜柱為:Agilent ZORBAX EXTEND-C18(2.1 mm×50 mm×1.8 μm，美國Agilent公司)；柱溫為30 ℃； 檢測波長為330 nm；流動(dòng)相為甲醇和水；流速為0.3 mL/min。
2.3.2 進(jìn)樣器條件
抽取(在默認(rèn)位置P1-D5上抽取5 μL)；洗針(P1-D6)；抽取(在默認(rèn)位置P1-D5上抽取5 μL)；洗針(P1-D8)；混合(在針座中，共3次)；等待(0.1 min)；排出(排出5 μL至 P1-D1上)；進(jìn)樣；洗針(在P1-D8上共洗2次)。
3 結(jié)果與分析
3.1 衍生化條件的選擇
柱后衍生法：主要使用OPA為衍生化試劑，使用熒光檢測器來測定?；撬帷Ｔ摲椒ê唵?、快捷，但是使用較大量的衍生化試劑，有一定的毒性，防護(hù)不好易對實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境產(chǎn)生危害；柱前衍生法：主要使用氮磺酰氯為衍生化試劑，使用二極管陣列檢測器來測定?；撬帷Ｔ摲椒ㄊ褂醚苌噭┑膭┝枯^小，但是穩(wěn)定性較差，樣品在冷藏條件下僅能保存2天，對實(shí)驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)技能要求較高。而使用程序進(jìn)樣-柱前衍生法解決了衍生物不穩(wěn)定的難題，衍生后無需人員操作即可自動(dòng)進(jìn)入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分析，提高了工作效率，減少了人員操作而產(chǎn)生的誤差。使用Agilent ZORBAX EXTEND-C18色譜柱對?；撬徇M(jìn)行分離，得到的色譜圖見圖1～圖4。
圖1 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品的色譜圖(濃度為5 mg/L)
圖2 空白試劑的色譜圖
圖3 樣品中牛磺酸的色譜圖
圖4 樣品中添加?；撬岬纳V圖(添加?；撬岷繛? mg/L)
在實(shí)驗(yàn)過程中，需要做試劑空白(試劑空白：使用水直接進(jìn)行衍生)。在實(shí)際計(jì)算樣品含量時(shí)，樣品中的?；撬岷繎?yīng)當(dāng)扣除試劑空白值。試劑空白值理論上不應(yīng)高于預(yù)測值的10%，如超過10%則應(yīng)考慮更換試劑品牌和器皿。
3.2 衍生化試劑的選擇
分別使用鄰苯二甲醛衍生化試劑和丹磺酰氯衍生化試劑對?；撬徇M(jìn)行柱前衍生，結(jié)果為使用丹磺酰氯衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生靈敏度沒有使用鄰苯二甲醛衍生化試劑低，色譜峰有較明顯的拖尾現(xiàn)象，穩(wěn)定性要低于使用鄰苯二甲醛衍生化試劑對?；撬徇M(jìn)行柱前衍生，綜合考慮，使用鄰苯二甲醛衍生化試劑為本研究最終使用的衍生化試劑。
3.3 回收率、精密度、線性范圍和檢出限
使用水對?；撬針?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，使其濃度為0，10，20，30，40，100 mg/L。將此6點(diǎn)6個(gè)濃度的水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn), 每個(gè)水平做6個(gè)平行，計(jì)算平均值。使用外標(biāo)法進(jìn)行定量，得到結(jié)果為在0～100 mg/L線性范圍內(nèi)回收率良好，且最小檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg，線性方程為Y=6.28X-1.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，回收率在95%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。
表1 ?；撬岬幕厥章始癛SDs(n=6)
4 結(jié)論
使用程序進(jìn)樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的牛磺酸含量，方法簡單快速，準(zhǔn)確度和靈敏度高， 實(shí)驗(yàn)成本低、毒性小，適合飲料中?；撬岷康臏y定。
[1]張彤,山廣志,余立.柱后衍生HPLC法測定?；撬犷w粒的含量[J].中國新藥雜志，2010(4):83-85.
[2]劉輝,徐應(yīng)軍,周瑞華,等.熒光法測定啤酒中?；撬岷縖J].釀酒科技，2005(5):87-88,91.
[3]張燕婉.氨基酸分析儀法測定肉食品中?；撬岷縖J].肉類研究，1996(1):37-39,47.
[4]李秀花,邱服斌,肖榮,等.紫外分光光度法測定動(dòng)物腦組織中?；撬岷縖J].山西醫(yī)藥雜志，2001(3):25-26.
[5]葉思平,陳悅嬌,陳海光,等.高效液相色譜測定益智仁中的?；撬岷縖J].食品科學(xué)，2013(10):212-214.
[6]高加龍,章超樺,劉書成,等.鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法測定馬氏珠母貝中?；撬岷縖J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007(1):59-62.
[7]李詠梅,李人宇.高靈敏分光光度法測定貝類中?；撬岷縖J].現(xiàn)代化工，2013(10):140-143.
[8]徐鳳云,楊玉霞.HPLC法柱后衍生測定乳粉中?；撬岷坎淮_定度評定[J].生命科學(xué)儀器，2009(6):48-50.
[9]A M Petrosian,J E Haroutounian. Taurine as a universal carrier of lipid soluble vitamins: a hypothesis[J].Amino Acids,2000(2):409-421.
[10]孫變娜,沈和定,吳洪喜,等.高效液相色譜法測定4種石磺中?；撬岬暮縖J].海洋漁業(yè)，2015(1):95-100.
[11]劉亞風(fēng),祝偉霞,袁萍,等.超高效親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測?；撬犷w粒和?；撬岬窝垡褐信；撬岬暮縖J].分析試驗(yàn)室，2011(3):107-109.
[12]方燦.柱前衍生-高效液相色譜法測定七維?；撬峥诜芤褐信；撬岬暮縖J].藥物分析雜志，2007(7):172-174.
[13]Angelo Zinellu,Salvatore Sotgia,Scanu Bastianina,et al. Taurine determination by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection: from clinical field to quality food applications[J].Amino Acids，2009(1):155-159.
Determination of Taurine in Fish Sauce by Program Sampling-Precolumn Derivatization-Ultra Performance Liquid Chromatography
MENG Bing-bing1, YANG Gui-ling1, XU Hui1,YU Lin1, MA Chi-cheng1,CHEN Sha-sha1, SUN Na1, YANG Shao-chen3
(1.Centre Testing International Corporation,Harbin 150025,China; 2.Harbin Food Industry Institute,Harbin 150025,China; 3.SUY GmbH,Heidelberg 69117,Germany)
The taurine in fish sauce is detected by program sampling-precolumn derivatization-ultra performance liquid chromatography at a wavelength of 330 nm, the results are as follows: the minimum detection limit is 5 mg/kg, and the quantitation limit is 15 mg/kg, the linear equation is Y=6.28X-1.01, the correlation coefficient is 0.9998. The recovery rate is in the range of 95%～105%, and the relative standard deviation is less than 10%. The method is accurate, with good sensitivity and recovery, and it can be used for the determination of taurine in fish sauce.
program sampling；precolumn derivatization；ultra performance liquid chromatography；taurine
2016-12-09
孟冰冰(1981-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士，研究方向：植物保護(hù)。
TS264.21
A
10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.032
1000-9973(2017)05-0138-03
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