程序進樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的?；撬岷?/h1>
2017-05-15 01:00:47孟冰冰楊桂玲徐惠于林馬馳騁陳莎莎孫娜楊劭辰
中國調(diào)味品 2017年5期
孟冰冰，楊桂玲,2，徐惠，于林，馬馳騁，陳莎莎，孫娜，楊劭辰
(1.黑龍江省華測檢測技術(shù)有限公司，哈爾濱 150025；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.SUY有限責任公司，德國 海得堡 69117)
程序進樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的?；撬岷?/p>
孟冰冰1，楊桂玲1,2，徐惠1，于林1，馬馳騁1，陳莎莎1，孫娜1，楊劭辰3
(1.黑龍江省華測檢測技術(shù)有限公司，哈爾濱 150025；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.SUY有限責任公司，德國 海得堡 69117)
采用程序進樣-柱前衍生-超高效液相色譜法，在波長為330 nm下測定魚露醬油中的牛磺酸含量，得到結(jié)果：最小檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg，線性方程為Y=6.28X-1.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，回收率在95%～105%，相對標準偏差低于10%。該方法準確，有很好的靈敏度和回收率，可以用于魚露醬油中牛磺酸的測定。
程序進樣；柱前衍生；超高效液相色譜法；?；撬?/p>
1 概述
?；撬?taurine)又稱β-氨基乙磺酸，為白色的、無臭的斜狀晶體。牛磺酸的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于乙醚等有機溶劑，是一種含硫的非蛋白的氨基酸[1,2]。?；撬岱植加趧游锝M織細胞內(nèi)，主要功能為促進嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育，提高神經(jīng)傳導(dǎo)和視覺機能，防止心血管疾病的產(chǎn)生以及影響糖的代謝和改善記憶。因此，?；撬釣槿梭w不可缺少的營養(yǎng)元素之一，并且作為營養(yǎng)強化劑被廣泛地添加到各類食品和嬰幼兒奶粉中[3-5]。
目前?；撬岬臏y定方法主要有中和滴定法、液相色譜儀-柱前衍生法和柱后衍生法、氣相色譜法等[6-13]。本研究采用程序進樣、柱前衍生的方式對?；撬徇M行測定，使用較小的衍生化試劑，在進樣器內(nèi)完成整個衍生實驗，操作簡單，降低了實驗過程中產(chǎn)生的操作誤差，為?；撬岬臏y定提供了可靠的依據(jù)。
2 實驗方法
2.1 儀器與試劑
2.1.1 儀器和試劑
Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，同時配有DAD檢測器；LC OpenLab CDS Chem Station，版本為C.01.07；KQ-300GVDV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS3 漩渦混勻儀(IKA公司)；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，德國默克公司；超純水(屈臣氏)；針式濾器(0.22 μm×25 mm)PTFE(上海安譜)；?；撬針藴势芳兌?9%(阿拉丁)；硼酸(科密歐)、氫氧化鉀(科密歐)、鄰苯二甲醛(英國ALFA)、乙硫醇(上海安譜)、Brij-35(上海安譜)。
2.1.2 衍生化試劑的配制
硼酸鉀溶液：30.9 g硼酸+26.3 g氫氧化鉀用水定容至1000 mL；0.6 g鄰苯二甲醛(OPA)+10 mL甲醇+0.5 mL乙硫醇+0.35 g Brij-35 用硼酸鉀水溶液定容至1000 mL。
2.2 樣品前處理
取1 mL的魚露醬油，加水稀釋至10 mL，通過針式濾器將已凈化的樣品裝入樣品瓶中。將已配制好的衍生化試劑通過針式濾器裝入樣品瓶中。
2.3 儀器條件
2.3.1 色譜條件
色譜柱為:Agilent ZORBAX EXTEND-C18(2.1 mm×50 mm×1.8 μm，美國Agilent公司)；柱溫為30 ℃； 檢測波長為330 nm；流動相為甲醇和水；流速為0.3 mL/min。
2.3.2 進樣器條件
抽取(在默認位置P1-D5上抽取5 μL)；洗針(P1-D6)；抽取(在默認位置P1-D5上抽取5 μL)；洗針(P1-D8)；混合(在針座中，共3次)；等待(0.1 min)；排出(排出5 μL至 P1-D1上)；進樣；洗針(在P1-D8上共洗2次)。
3 結(jié)果與分析
3.1 衍生化條件的選擇
柱后衍生法：主要使用OPA為衍生化試劑，使用熒光檢測器來測定?；撬?。該方法簡單、快捷，但是使用較大量的衍生化試劑，有一定的毒性，防護不好易對實驗人員及環(huán)境產(chǎn)生危害；柱前衍生法：主要使用氮磺酰氯為衍生化試劑，使用二極管陣列檢測器來測定?；撬?。該方法使用衍生化試劑的劑量較小，但是穩(wěn)定性較差，樣品在冷藏條件下僅能保存2天，對實驗人員的實驗技能要求較高。而使用程序進樣-柱前衍生法解決了衍生物不穩(wěn)定的難題，衍生后無需人員操作即可自動進入色譜柱內(nèi)進行分析，提高了工作效率，減少了人員操作而產(chǎn)生的誤差。使用Agilent ZORBAX EXTEND-C18色譜柱對?；撬徇M行分離，得到的色譜圖見圖1～圖4。
圖1 ?；撬針藴势返纳V圖(濃度為5 mg/L)
圖2 空白試劑的色譜圖
圖3 樣品中牛磺酸的色譜圖
圖4 樣品中添加?；撬岬纳V圖(添加?；撬岷繛? mg/L)
在實驗過程中，需要做試劑空白(試劑空白：使用水直接進行衍生)。在實際計算樣品含量時，樣品中的?；撬岷繎?yīng)當扣除試劑空白值。試劑空白值理論上不應(yīng)高于預(yù)測值的10%，如超過10%則應(yīng)考慮更換試劑品牌和器皿。
3.2 衍生化試劑的選擇
分別使用鄰苯二甲醛衍生化試劑和丹磺酰氯衍生化試劑對?；撬徇M行柱前衍生，結(jié)果為使用丹磺酰氯衍生化試劑進行柱前衍生靈敏度沒有使用鄰苯二甲醛衍生化試劑低，色譜峰有較明顯的拖尾現(xiàn)象，穩(wěn)定性要低于使用鄰苯二甲醛衍生化試劑對?；撬徇M行柱前衍生，綜合考慮，使用鄰苯二甲醛衍生化試劑為本研究最終使用的衍生化試劑。
3.3 回收率、精密度、線性范圍和檢出限
使用水對?；撬針藴势愤M行稀釋，使其濃度為0，10，20，30，40，100 mg/L。將此6點6個濃度的水平進行添加回收試驗, 每個水平做6個平行，計算平均值。使用外標法進行定量，得到結(jié)果為在0～100 mg/L線性范圍內(nèi)回收率良好，且最小檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg，線性方程為Y=6.28X-1.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，回收率在95%～105%，相對標準偏差低于10%。
表1 ?；撬岬幕厥章始癛SDs(n=6)
4 結(jié)論
使用程序進樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的牛磺酸含量，方法簡單快速，準確度和靈敏度高， 實驗成本低、毒性小，適合飲料中牛磺酸含量的測定。
[1]張彤,山廣志,余立.柱后衍生HPLC法測定?；撬犷w粒的含量[J].中國新藥雜志，2010(4):83-85.
[2]劉輝,徐應(yīng)軍,周瑞華,等.熒光法測定啤酒中?；撬岷縖J].釀酒科技，2005(5):87-88,91.
[3]張燕婉.氨基酸分析儀法測定肉食品中?；撬岷縖J].肉類研究，1996(1):37-39,47.
[4]李秀花,邱服斌,肖榮,等.紫外分光光度法測定動物腦組織中牛磺酸含量[J].山西醫(yī)藥雜志，2001(3):25-26.
[5]葉思平,陳悅嬌,陳海光,等.高效液相色譜測定益智仁中的牛磺酸含量[J].食品科學(xué)，2013(10):212-214.
[6]高加龍,章超樺,劉書成,等.鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法測定馬氏珠母貝中?；撬岷縖J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2007(1):59-62.
[7]李詠梅,李人宇.高靈敏分光光度法測定貝類中?；撬岷縖J].現(xiàn)代化工，2013(10):140-143.
[8]徐鳳云,楊玉霞.HPLC法柱后衍生測定乳粉中?；撬岷坎淮_定度評定[J].生命科學(xué)儀器，2009(6):48-50.
[9]A M Petrosian,J E Haroutounian. Taurine as a universal carrier of lipid soluble vitamins: a hypothesis[J].Amino Acids,2000(2):409-421.
[10]孫變娜,沈和定,吳洪喜,等.高效液相色譜法測定4種石磺中?；撬岬暮縖J].海洋漁業(yè)，2015(1):95-100.
[11]劉亞風(fēng),祝偉霞,袁萍,等.超高效親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測牛磺酸顆粒和?；撬岬窝垡褐信；撬岬暮縖J].分析試驗室，2011(3):107-109.
[12]方燦.柱前衍生-高效液相色譜法測定七維?；撬峥诜芤褐信；撬岬暮縖J].藥物分析雜志，2007(7):172-174.
[13]Angelo Zinellu,Salvatore Sotgia,Scanu Bastianina,et al. Taurine determination by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection: from clinical field to quality food applications[J].Amino Acids，2009(1):155-159.
Determination of Taurine in Fish Sauce by Program Sampling-Precolumn Derivatization-Ultra Performance Liquid Chromatography
MENG Bing-bing1, YANG Gui-ling1, XU Hui1,YU Lin1, MA Chi-cheng1,CHEN Sha-sha1, SUN Na1, YANG Shao-chen3
(1.Centre Testing International Corporation,Harbin 150025,China; 2.Harbin Food Industry Institute,Harbin 150025,China; 3.SUY GmbH,Heidelberg 69117,Germany)
The taurine in fish sauce is detected by program sampling-precolumn derivatization-ultra performance liquid chromatography at a wavelength of 330 nm, the results are as follows: the minimum detection limit is 5 mg/kg, and the quantitation limit is 15 mg/kg, the linear equation is Y=6.28X-1.01, the correlation coefficient is 0.9998. The recovery rate is in the range of 95%～105%, and the relative standard deviation is less than 10%. The method is accurate, with good sensitivity and recovery, and it can be used for the determination of taurine in fish sauce.
program sampling；precolumn derivatization；ultra performance liquid chromatography；taurine
2016-12-09
孟冰冰(1981-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士，研究方向：植物保護。
TS264.21
A
10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.032
1000-9973(2017)05-0138-03
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程序進樣-柱前衍生-超高效液相色譜法測定魚露醬油中的?；撬岷?/p>
孟冰冰1，楊桂玲1,2，徐惠1，于林1，馬馳騁1，陳莎莎1，孫娜1，楊劭辰3
(1.黑龍江省華測檢測技術(shù)有限公司，哈爾濱 150025；2.哈爾濱市食品工業(yè)研究所，哈爾濱 150025；3.SUY有限責任公司，德國 海得堡 69117)
采用程序進樣-柱前衍生-超高效液相色譜法，在波長為330 nm下測定魚露醬油中的牛磺酸含量，得到結(jié)果：最小檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg，線性方程為Y=6.28X-1.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，回收率在95%～105%，相對標準偏差低于10%。該方法準確，有很好的靈敏度和回收率，可以用于魚露醬油中牛磺酸的測定。
程序進樣；柱前衍生；超高效液相色譜法；?；撬?/p>
1 概述
?；撬?taurine)又稱β-氨基乙磺酸，為白色的、無臭的斜狀晶體。牛磺酸的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于乙醚等有機溶劑，是一種含硫的非蛋白的氨基酸[1,2]。?；撬岱植加趧游锝M織細胞內(nèi)，主要功能為促進嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育，提高神經(jīng)傳導(dǎo)和視覺機能，防止心血管疾病的產(chǎn)生以及影響糖的代謝和改善記憶。因此，?；撬釣槿梭w不可缺少的營養(yǎng)元素之一，并且作為營養(yǎng)強化劑被廣泛地添加到各類食品和嬰幼兒奶粉中[3-5]。
目前?；撬岬臏y定方法主要有中和滴定法、液相色譜儀-柱前衍生法和柱后衍生法、氣相色譜法等[6-13]。本研究采用程序進樣、柱前衍生的方式對?；撬徇M行測定，使用較小的衍生化試劑，在進樣器內(nèi)完成整個衍生實驗，操作簡單，降低了實驗過程中產(chǎn)生的操作誤差，為?；撬岬臏y定提供了可靠的依據(jù)。
2 實驗方法
2.1 儀器與試劑
2.1.1 儀器和試劑
Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，同時配有DAD檢測器；LC OpenLab CDS Chem Station，版本為C.01.07；KQ-300GVDV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS3 漩渦混勻儀(IKA公司)；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，德國默克公司；超純水(屈臣氏)；針式濾器(0.22 μm×25 mm)PTFE(上海安譜)；?；撬針藴势芳兌?9%(阿拉丁)；硼酸(科密歐)、氫氧化鉀(科密歐)、鄰苯二甲醛(英國ALFA)、乙硫醇(上海安譜)、Brij-35(上海安譜)。
2.1.2 衍生化試劑的配制
硼酸鉀溶液：30.9 g硼酸+26.3 g氫氧化鉀用水定容至1000 mL；0.6 g鄰苯二甲醛(OPA)+10 mL甲醇+0.5 mL乙硫醇+0.35 g Brij-35 用硼酸鉀水溶液定容至1000 mL。
2.2 樣品前處理
取1 mL的魚露醬油，加水稀釋至10 mL，通過針式濾器將已凈化的樣品裝入樣品瓶中。將已配制好的衍生化試劑通過針式濾器裝入樣品瓶中。
2.3 儀器條件
2.3.1 色譜條件
色譜柱為:Agilent ZORBAX EXTEND-C18(2.1 mm×50 mm×1.8 μm，美國Agilent公司)；柱溫為30 ℃； 檢測波長為330 nm；流動相為甲醇和水；流速為0.3 mL/min。
2.3.2 進樣器條件
抽取(在默認位置P1-D5上抽取5 μL)；洗針(P1-D6)；抽取(在默認位置P1-D5上抽取5 μL)；洗針(P1-D8)；混合(在針座中，共3次)；等待(0.1 min)；排出(排出5 μL至 P1-D1上)；進樣；洗針(在P1-D8上共洗2次)。
3 結(jié)果與分析
3.1 衍生化條件的選擇
柱后衍生法：主要使用OPA為衍生化試劑，使用熒光檢測器來測定?；撬?。該方法簡單、快捷，但是使用較大量的衍生化試劑，有一定的毒性，防護不好易對實驗人員及環(huán)境產(chǎn)生危害；柱前衍生法：主要使用氮磺酰氯為衍生化試劑，使用二極管陣列檢測器來測定?；撬?。該方法使用衍生化試劑的劑量較小，但是穩(wěn)定性較差，樣品在冷藏條件下僅能保存2天，對實驗人員的實驗技能要求較高。而使用程序進樣-柱前衍生法解決了衍生物不穩(wěn)定的難題，衍生后無需人員操作即可自動進入色譜柱內(nèi)進行分析，提高了工作效率，減少了人員操作而產(chǎn)生的誤差。使用Agilent ZORBAX EXTEND-C18色譜柱對?；撬徇M行分離，得到的色譜圖見圖1～圖4。
圖1 ?；撬針藴势返纳V圖(濃度為5 mg/L)
圖2 空白試劑的色譜圖
圖3 樣品中牛磺酸的色譜圖
圖4 樣品中添加?；撬岬纳V圖(添加?；撬岷繛? mg/L)
在實驗過程中，需要做試劑空白(試劑空白：使用水直接進行衍生)。在實際計算樣品含量時，樣品中的?；撬岷繎?yīng)當扣除試劑空白值。試劑空白值理論上不應(yīng)高于預(yù)測值的10%，如超過10%則應(yīng)考慮更換試劑品牌和器皿。
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分別使用鄰苯二甲醛衍生化試劑和丹磺酰氯衍生化試劑對?；撬徇M行柱前衍生，結(jié)果為使用丹磺酰氯衍生化試劑進行柱前衍生靈敏度沒有使用鄰苯二甲醛衍生化試劑低，色譜峰有較明顯的拖尾現(xiàn)象，穩(wěn)定性要低于使用鄰苯二甲醛衍生化試劑對?；撬徇M行柱前衍生，綜合考慮，使用鄰苯二甲醛衍生化試劑為本研究最終使用的衍生化試劑。
3.3 回收率、精密度、線性范圍和檢出限
使用水對?；撬針藴势愤M行稀釋，使其濃度為0，10，20，30，40，100 mg/L。將此6點6個濃度的水平進行添加回收試驗, 每個水平做6個平行，計算平均值。使用外標法進行定量，得到結(jié)果為在0～100 mg/L線性范圍內(nèi)回收率良好，且最小檢出限為5 mg/kg，定量限為15 mg/kg，線性方程為Y=6.28X-1.01，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998，回收率在95%～105%，相對標準偏差低于10%。
表1 ?；撬岬幕厥章始癛SDs(n=6)
4 結(jié)論
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[1]張彤,山廣志,余立.柱后衍生HPLC法測定?；撬犷w粒的含量[J].中國新藥雜志，2010(4):83-85.
[2]劉輝,徐應(yīng)軍,周瑞華,等.熒光法測定啤酒中?；撬岷縖J].釀酒科技，2005(5):87-88,91.
[3]張燕婉.氨基酸分析儀法測定肉食品中?；撬岷縖J].肉類研究，1996(1):37-39,47.
[4]李秀花,邱服斌,肖榮,等.紫外分光光度法測定動物腦組織中牛磺酸含量[J].山西醫(yī)藥雜志，2001(3):25-26.
[5]葉思平,陳悅嬌,陳海光,等.高效液相色譜測定益智仁中的牛磺酸含量[J].食品科學(xué)，2013(10):212-214.
[6]高加龍,章超樺,劉書成,等.鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法測定馬氏珠母貝中?；撬岷縖J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2007(1):59-62.
[7]李詠梅,李人宇.高靈敏分光光度法測定貝類中?；撬岷縖J].現(xiàn)代化工，2013(10):140-143.
[8]徐鳳云,楊玉霞.HPLC法柱后衍生測定乳粉中?；撬岷坎淮_定度評定[J].生命科學(xué)儀器，2009(6):48-50.
[9]A M Petrosian,J E Haroutounian. Taurine as a universal carrier of lipid soluble vitamins: a hypothesis[J].Amino Acids,2000(2):409-421.
[10]孫變娜,沈和定,吳洪喜,等.高效液相色譜法測定4種石磺中?；撬岬暮縖J].海洋漁業(yè)，2015(1):95-100.
[11]劉亞風(fēng),祝偉霞,袁萍,等.超高效親水作用色譜-蒸發(fā)光散射檢測牛磺酸顆粒和?；撬岬窝垡褐信；撬岬暮縖J].分析試驗室，2011(3):107-109.
[12]方燦.柱前衍生-高效液相色譜法測定七維?；撬峥诜芤褐信；撬岬暮縖J].藥物分析雜志，2007(7):172-174.
[13]Angelo Zinellu,Salvatore Sotgia,Scanu Bastianina,et al. Taurine determination by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection: from clinical field to quality food applications[J].Amino Acids，2009(1):155-159.
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(1.Centre Testing International Corporation,Harbin 150025,China; 2.Harbin Food Industry Institute,Harbin 150025,China; 3.SUY GmbH,Heidelberg 69117,Germany)
The taurine in fish sauce is detected by program sampling-precolumn derivatization-ultra performance liquid chromatography at a wavelength of 330 nm, the results are as follows: the minimum detection limit is 5 mg/kg, and the quantitation limit is 15 mg/kg, the linear equation is Y=6.28X-1.01, the correlation coefficient is 0.9998. The recovery rate is in the range of 95%～105%, and the relative standard deviation is less than 10%. The method is accurate, with good sensitivity and recovery, and it can be used for the determination of taurine in fish sauce.
program sampling；precolumn derivatization；ultra performance liquid chromatography；taurine
2016-12-09
孟冰冰(1981-)，女，黑龍江哈爾濱人，碩士，研究方向：植物保護。
TS264.21
A
10.3969/j.issn.1000-9973.2017.05.032
1000-9973(2017)05-0138-03
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