唐瑩+朱軍+鄧瑩+代禮+李明蓉+宋慶高+熊貴發(fā)

[摘要] 目的 探討TGFβ3和ARNT2基因與非綜合征性唇腭裂發(fā)生的關系。 方法 收集了2006～2010年的119個中國南方非綜合征性唇腭裂核心家系作為研究對象，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測TGFβ3基因的多態(tài)位點rs2300607和rs2268625，以及ARNT2基因的多態(tài)位點rs2228099和rs3768017，并進行傳遞不平衡檢驗（TDT）和基于核心家系的關聯(lián)分析（FBAT）。 結(jié)果 TDT分析結(jié)果顯示：TGFβ3基因中的rs2268625位點在唇裂合并腭裂核心家系中，存在傳遞不平衡（P = 0.02）。FBAT分析結(jié)果顯示：ARNT2基因中rs2228099/rs3768017構(gòu)成的CT和GG基因型與子代唇腭裂發(fā)生危險性增加有顯著關聯(lián)（P = 0.008、0.012）。 結(jié)論 在我國南方人群中，TGFβ3基因和ARNT2基因多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂存在關聯(lián)。

[關鍵詞] 唇裂；腭裂；TGFβ3；ARNT2；多態(tài)性；單核苷酸

[中圖分類號] R788 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（c）-0115-05

Study on association between genetic polymorphism of TGFβ3， ARNT2 and nonsyndromic cleft lip with or without palate in south Chinese population

TANG Ying1 ZHU Jun2 DENG Ying2 DAI Li2 LI Mingrong2 SONG Qinggao3 XIONG Guifa4

1.Department of Pediatrics， Chengdu Angel Maternity Hospital， Sichuan Province， Chengdu 610042， China； 2.Center for Birth Defects Monitoring of China， Sichuan Province， Chengdu 610043， China； 3.Department of Oral Surgery， Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical College， Guizhou Province， Zunyi 563003， China； 4.Department of Oral Surgery， Stomatological Hospital of Guiyang City， Guizhou Province， Guiyang 550006， China

[Abstract] Objective To study association between TGFβ3， ARNT2 polymorphisms and nonsyndromic cleft lip with or without palate. Methods 119 triads with NSCLP affected child from 2006 to 2010 were recruited in the study. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms （PCR-RFLP） was used to identify rs2300607， rs2268625 genotypes of TGFβ3 and rs2228099， rs3768017 genotypes of ARNT2. The data was analyzed by case-control analysis， transmission disequilibrium test （TDT） and family-based association study （FBAT）. Results In the TDT， T allele of TGFβ3 rs2268625 was preferentially transmitted to CLP patients （P = 0.02）. In the family-based association test， when a haplotype consisting rs2228099 and rs3768017 in ARNT2 was considered， the significant association between CT or GG haplotype and CL/P was observed （P = 0.008， 0.012）. Conclusion The genetic polymorphism of TGFβ3 and ARNT2 is relevant with nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in the south Chinese population.

[Key words] Cleft lip； Cleft palate； Transforming growth factor β3； Arylhydro carbon receptor nuclear translocator 2； Polymorphisms； Single nucleotide

非綜合征性唇腭裂是口面部最常見的嚴重出生缺陷之一，在中國人群中其發(fā)生率為1.0‰～1.3‰[1]，在我國近幾年出生缺陷的發(fā)生順位中占第二或第三位，屬高發(fā)畸形。非綜合征性唇腭裂包括唇裂（CLO）、唇裂合并腭裂（CLP）和單純性腭裂（CPO）[2]。人們認為CLO和CLP在遺傳學上具有相同的發(fā)病機制，通常將兩者歸為一類，統(tǒng)稱為唇裂伴或不伴腭裂（CL/P），而CPO的發(fā)生則可能是與另外一些基因相關。近年來的研究表明，唇腭裂因不同人種、地區(qū)、性別以及有無陽性家族史其發(fā)病率是不同的，25%～35%的CL/P和10%～20%的CPO患者都有陽性家族史[3-4]，遺傳因素在CL/P和CPO的發(fā)病中占20%～50%[5]。研究認為，非綜合征性唇腭裂是一種多基因易感性疾病，其發(fā)生受多個中效或輕度微效基因的相互作用，屬于數(shù)量性狀遺傳[6-7]。本研究選取亞洲和歐美人群中爭議較多的轉(zhuǎn)化生長因子β3（TGFβ3）和尚未在中國人群中研究過的差異表達基因芳香烴核轉(zhuǎn)位因子2（ARNT2）基因作為研究對象，分析其與中國人唇腭裂發(fā)病的關系，為進一步探討非綜合征性唇腭裂的發(fā)病機制奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象

樣本來自2006～2010年在遵義醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院和貴陽市口腔醫(yī)院就診的唇腭裂患者的核心家系（患者和雙親），排除其他系統(tǒng)畸形如范伍德綜合征、歌舞伎面譜綜合征、腭心面綜合征和Meckel綜合征等，臨床確診為非綜合征性唇腭裂，本研究方案通過華西第二醫(yī)院倫理學委員會審核批準，嚴格遵守倫理學準則《赫爾辛基宣言》中人體醫(yī)學研究的倫理原則，尊重每位采集對象的基因隱私權及自我決定權，女性均排除妊娠及哺乳，并獲得每位采集對象的書面知情同意后才納入本研究。共募集到119個核心家系，共359名，有2個唇裂家庭各有2名患兒，其余家庭都只有1名患兒。這些家庭分屬于漢、彝、苗、侗不同民族。表1是對這些家庭基本情況的描述。

1.2 基因組DNA提取

抽取患兒及其父母外周靜脈血5 mL，ACD抗凝，常規(guī)酚-氯仿法提取DNA。紫外分光光度儀定量后，取少量稀釋備用。

1.3 PCR擴增與RFLP分型

在美國生物技術信息中心（NCBI GenBank）上查詢TGFβ3基因rs2300607（T/A）和rs2268625（T/C）兩個SNP位點，以及ARNT2基因rs2228099（G/C）和rs3768017（T/G）兩個位點的上下游序列（網(wǎng)址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。擴增引物由invitrogen公司合成，rs2300607的引物序列：5′-CTGGACAACATAGGGAGGAC-3′；5′-GCAATCTCGGCTCACTGTAG-3′，退火溫度60℃，產(chǎn)物長度292bp，限制性內(nèi)切酶用XapⅠ。rs2268625的引物序列：5′-GAGGGGTT- GTTGAGGAAGTC-3′；5′-AGGGAATCGTTGGCAGTA-TC-3′，退火溫度64℃，產(chǎn)物長度245bp，用內(nèi)切酶Hin 6Ⅰ酶切。

rs2228099的引物序列：5′-TTAGGGTGGAAACCTGTGGCTGTGGA-3′；5′-TGGTTCAAAACAGGAGTCACGGAGTCTGA-3′，退火溫度64℃，產(chǎn)物長度264bp，內(nèi)切酶用DdeⅠ。rs3768017的引物序列：5′-AGAAATAAAATCCAGGTCCCCAG-3′；5′-TCCTAAGAGTTCCTAGAATACAGAAAGCAG-3′，退火溫度62.8℃，產(chǎn)物長度408bp，內(nèi)切酶用SatⅠ。PCR總反應體系為25 μL，其中包括雙蒸水15.3 μL，DNA凝膠加樣緩沖液（10×buffer）2.5 μL，2 mmol/L的dNTPs 2.5 μL，25 mmol/L的MgCl2 1.5 μL，基因組DNA 10～800 ng（約1 μL），10 pmol/μL的上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 U。產(chǎn)物PCR擴增完畢后瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。酶切體系為：PCR產(chǎn)物10 μL，10×緩沖液2 μL，酶4 U，加ddH2O至20 μL后放37℃水浴箱中過夜。次日將酶切產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠上電泳，溴乙啶染色，照相保存結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法

計算各組等位基因和基因型頻率，應用SPSS 10.0軟件計算是否符合Hardy-Weinberg平衡檢驗；采用Curtis編制的ETDT2.5應用軟件（http：//www.smd.qmul.ac.uk/statgen/dcurtis/software.html）進行傳遞失衡（TDT）檢驗。統(tǒng)計時將患病同胞拆分為獨立樣本家系；采用以家庭為基礎的關聯(lián)檢驗（FBAT）模型，應用統(tǒng)計軟件fbat 1.41，在不同的遺傳模型下，以子代，父母基因型作為基因型數(shù)據(jù)，以子代是否受累作為表型數(shù)據(jù)，對SNP位點與非綜合征性唇腭裂表型之間是否存在關聯(lián)進行線性回歸模型檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各位點的基因型分析

TGFβ3基因rs2300607的多態(tài)性表現(xiàn)為純合子TT（140、107、45 bp），純合子AA（247、45 bp），雜合子TA（245、140、107、45 bp）。rs2268625的多態(tài)性表現(xiàn)為純合子TT（245 bp），純合子CC（65、180 bp），雜合子TC（245、180、65 bp）；ARNT2基因rs2228099的多態(tài)性表現(xiàn)為純合子GG（264 bp），純合子CC（236、29 bp），雜合子GC（264、236、29 bp）。rs3768017的多態(tài)性表現(xiàn)為純合子TT（408 bp），純合子GG（379、29 bp），雜合子TG（408bp、329、29 bp）。

2.2 Hardy-Weinberg（H-W）平衡檢驗

對于漢族CLO和CLP核心家系，患兒和父母各基因型的觀察值與期望值間吻合度良好，分布未偏離H-W平衡（P > 0.05）（表2）；而對于漢族CPO核心家系，有三個位點的基因型不符合H-W平衡，不能進行后面的分析。其他少數(shù)民族家系數(shù)較少，且民族眾多，分層后統(tǒng)計差異無統(tǒng)計學意義（故以下統(tǒng)計數(shù)據(jù)均來自漢族家系）。

表2 漢族唇裂、唇腭裂和單純腭裂家系中兩基因各SNP位點的

H-W平衡檢驗

2.3 傳遞不平衡檢驗（TDT）

進行基因分型的核心家系有119個，由于TDT要求運用雜合子父母及其患病子女做分析，故需排除純合子父母家系，余下有效家系106個用于統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示TGFβ3的rs2268625等位基因與唇腭裂的發(fā)生有顯著關聯(lián)（P = 0.02），ARNT2的rs2228099等位基因與單純腭裂的發(fā)生有顯著關聯(lián)（P = 0.04）。（TDT檢驗只針對符合H-W平衡的SNP位點進行，具體數(shù)據(jù)見表3～4）。

2.4 各SNP位點的FBAT分析結(jié)果

在FBAT加性遺傳模式下，這四個SNP位點的單點分析結(jié)果與上面的TDT分析結(jié)果非常接近（表5）。在用FBAT分析TGFβ3基因與ARNT2基因的單體型數(shù)據(jù)時，將漢族CLO和CLP家系合并統(tǒng)計以獲得更多的信息家系數(shù)，由于FBAT程序中默認設置最小的信息家系數(shù)為10，信息家系數(shù)低于10的主題（等位基因、基因型和單體型）將不被分析。結(jié)果顯示TGFβ3基因2個SNP位點構(gòu)建的4個單體型中，TT單體型的頻率最高（0.529），TC單體型的頻率最低（0.047），但對該單體型的分析獲得一個有意義的結(jié)果（P = 0.045）（表6）；ARNT2基因2個SNP位點構(gòu)建的4個單體型中，CT單體型和GG單體型都與CL/P的發(fā)生存在顯著關聯(lián)（P = 0.008、0.012）（表7）。

3 討論

先天性唇腭裂發(fā)生在胚胎發(fā)育6～12周時，在致畸因素的作用下，面突、腭突的外胚間質(zhì)細胞生長減慢或停止，上皮細胞與間充質(zhì)細胞之間的相互作用受到干擾，腭中嵴上皮細胞不能正常增生、分化、凋零、退變，而是分化為口腔樣的復層鱗狀上皮，面突與腭突就只能部分融合或不能融合，出現(xiàn)不同程度的唇腭裂[8]。這個過程受到體內(nèi)多種細胞因子及信息分子的調(diào)節(jié)，TGFβ族作為一類多肽生長因子也參與其中，動物實驗表明，在胚腭突接觸前，TGFβ3誘導腭胚中嵴上皮細胞膜外出現(xiàn)絲狀偽足，絲狀偽足表面有硫酸軟骨蛋白多糖，介導腭突黏著。在腭融合時TGFβ3可能作為凋亡的誘導因子調(diào)節(jié)腭中嵴上皮細胞的轉(zhuǎn)歸，還可誘導腭成纖維細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-13的高度表達，而基質(zhì)金屬蛋白酶降解細胞外基質(zhì)是腭融合中的關鍵步驟[9-10]。ARNT2是近年來被發(fā)現(xiàn)與唇腭裂的發(fā)生相關的侯選基因，它位于人類15q23-q25染色體，Abbott等[11]證實在C57BL/6N小鼠早期腭發(fā)育的不同時期中，ARNT mRNA有不同程度的上調(diào)表達。Barrow等[12]、Muraoka等[13]對AXB和BXA近交系小鼠進行基因組掃描，證實小鼠7號染色體上的ARNT2等位基因是CPO致畸易感位點，ARNT2基因敲除小鼠會產(chǎn)生包括CPO在內(nèi)的畸形。Tami等[14]發(fā)現(xiàn)，TGFβ3或其信號通路中的其他因子與ARNT2基因編碼蛋白所在的芳香烴受體通路有關，在暴露于某些環(huán)境因素時，兩者之間有相互補充影響的作用。

關于TGFβ3基因與唇腭裂發(fā)生關系的研究最早在高加索人群中進行，如Lidral等[15]分析美洲高加索CL/P和CPO患者人群中的TGFβ3基因，發(fā)現(xiàn)第5外顯子區(qū)X5.1與CL/P之間存在傳遞不平衡，X5.1-5′UTR單體型與CL/P之間也存在顯著的傳遞不平衡。Maestri等[16]分析了160個家系受累患者唇腭裂的類型、人種、家族史與TGFβ3基因標記之間的關系，也發(fā)現(xiàn)TGFβ3與CL/P患者和CPO患者呈顯著性相關。但Moreno等[17]和Beaty等[18]分析TGFβ3基因上的短串聯(lián)重復序列，卻未發(fā)現(xiàn)TGFβ3基因與唇腭裂發(fā)生存在關聯(lián)或連鎖。上述研究都是用微衛(wèi)星遺傳標記篩查法來尋找易感基因，使用SNP這類新型遺傳標記尋找某基因與唇腭裂發(fā)生關系的研究較少。

我國人群中，研究TGFβ3基因與非綜合征性唇腭裂關系的實驗進行最多。眾多的實驗結(jié)論或相同或相悖，但設計方法多采用的是病例對照法，這種設計很難保證病例組和對照組來自遺傳背景完全相同的人群，可能會因為人群分層（病例和對照在遺傳背景上的差異）而導致虛假的關聯(lián)結(jié)果。而病例父母對照研究則可避免這種差異，因為其本身就是患兒與正常父母之間的對照，可以得到更為真實的結(jié)果。FBAT檢驗是利用雙親基因型，受累子女基因型及其表型的家系數(shù)據(jù)，進行雙等位基因或多等位基因與疾病表型的關聯(lián)分析，它是由傳遞不平衡檢驗（TDT）擴展到對任何表型，多基因或環(huán)境因素的研究。其主要優(yōu)勢在于能有力地克服人群混合、人群分層以及性狀的不同選擇等混雜因素對分析結(jié)果的影響，允許在一個家系中存在多個受累對象，并能在不同的遺傳模式下進行相關性檢驗分析等。本文就用這兩種方法分析我國南方人群中TGFβ3和ARNT2基因與非綜合征性唇腭裂的關系。

本文中TDT和FBAT單點分析結(jié)果都提示，TGFβ3基因的rs2268625位點與CLP的發(fā)生存在顯著關聯(lián)（P = 0.02），從親代到子代該位點T等位基因傳遞更多；但該位點與CLO的發(fā)生沒有關系。在對TGFβ3的單體型分析中，雖然TC單體型可能會增加漢族人CL/P發(fā)生的風險（P = 0.047），但該單體型的頻率低于0.05，需要擴大樣本量來增加說服力，再做進一步的解釋。這與Eisaburo等[19]對112個日本CL/P核心家系的研究結(jié)果略有不同，他們發(fā)現(xiàn)TGFβ3基因的rs2300607（A>T）在日本人中存在顯著傳遞不平衡（P = 0.041），rs2300607與rs2268625組成的單體型在TDT檢驗中得到的P值更低（P = 0.025），在日本人群中，這兩個SNP位點構(gòu)成的單體型比單個SNP位點與CL/P的關聯(lián)性更強。造成這種現(xiàn)象的原因需要進一步探討，目前認為，可能與人群中基因頻率的不同有關，該位點等位基因A在日本CL/P患者[20]中的頻率是0.37，而在中國人群CL/P患者中的頻率則是0.42。

ARNT2的SNP位點rs2228099與CLO的發(fā)生有顯著關聯(lián)（P = 0.04），rs3768017有增加CLP發(fā)生的趨勢，但未達到顯著性水平（P = 0.07），我們發(fā)現(xiàn)，在FBAT檢驗中rs2228099與rs3768017構(gòu)建的CT單體型和GG單體型比單個SNP位點得到的P值更低（P = 0.008、0.012），與CL/P發(fā)生存在更強的關聯(lián)性。這些結(jié)果說明ARNT2是中國漢族人發(fā)生CL/P的易感基因，而ARNT2上與CL/P的發(fā)生關聯(lián)性更強的SNP位點，應該位于與rs2228099/rs3768017單體型相連鎖的區(qū)域。

本次實驗發(fā)現(xiàn)，TGFβ3基因與我國南方漢族人群中非綜合征性唇裂合并腭裂的發(fā)生有一定的相關性，但它是否是CL/P和CPO發(fā)生的主要易感基因仍有待研究。非綜合征性唇腭裂是一種多基因疾病，可能還有其他在我國人群唇腭裂發(fā)生中起主導或輔助作用的致病基因。我們的后續(xù)實驗將繼續(xù)討論其他相關基因與唇腭裂發(fā)生的關系，為探討唇腭裂的發(fā)病機制奠定基礎。

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（收稿日期：2016-12-23 本文編輯：李亞聰）