李婷，區(qū)碩俊，王強，黃曼谷

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院,國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,廣東廣州511447）

高效液相色譜法同時測定野菊花中的4種藥用成分

李婷，區(qū)碩俊，王強，黃曼谷

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院,國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,廣東廣州511447）

建立高效液相色譜法（HPLC）測定野菊花中綠原酸、黃芩苷、槲皮素和蒙花苷的含量。樣品經(jīng)過優(yōu)化條件提取后,梯度洗脫條件下分離,二極管陣列檢測器進行檢測。4種藥用成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)在0.998 5～0.999 8之間。平均回收率為84.4%～97.2，檢出限為0.1～0.5 mg/L，相對標準偏差為4.88%～8.21%。該方法回收率高、精密度高、準確度高、重現(xiàn)性好，是測定野菊花中4種藥用成分的有效方法。

高效液相色譜；野菊花；藥用成分；同時測定

野菊花是菊科植物菊的干燥頭狀花序，以色黃無梗、完整、苦辛、花未全開者為佳。野菊花性微寒，具疏散風熱、消腫解毒[1-4]。能治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、風火赤眼、頭痛眩暈等病證[5-7]。野菊花中富含黃銅類、有機酸類、揮發(fā)油等化學成分[8-10]。其中，綠原酸、黃芩苷等藥用成分對清除自由基、抗腫瘤和改善慢性疾病有明顯的效果。因此野菊花中藥用成分的提取與檢測對醫(yī)學藥學的基礎(chǔ)研究有著重要的意義[10]。

近年來檢測工作者對測定野菊花的藥用成分作了大量的研究，但由于野菊花中的藥用成分性質(zhì)差異較大，要同時提取和分離難度大[8,9,11-13]，因此報道主要為單一組分或一類化合物的含量測定，同時測定野菊花中多種不同種類成分的含量尚少報道,本文建立的高效液相色譜法操作簡便、重復(fù)性好、靈敏度低,適用于日常檢測野菊花中4種藥用成分含量。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

島津高效液相色譜儀LC-20AT；超聲波清洗器(H66025T)；MS3 basic漩渦混合器(德國IKA公司)；實驗室用水為Milli-Q超純水；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)；磷酸，乙醇，氫氧化鈉(分析純，廣州化學試劑)；對照品：綠原酸（≥98%，中國藥品生物制品檢定所）、黃芩苷（≥98%，中國藥品生物制品檢定所）、槲皮素（≥98.5%，中國藥品生物制品檢定所）、蒙花苷（≥98%，中國藥品生物制品檢定所）；菊花藥材購于康美藥業(yè)股份有限公司。

1.2 標準溶液的配制

分別精密稱取綠原酸對照品10.0 mg，黃芩苷10.0 mg，槲皮素10.0 mg，蒙花苷10.0 mg置于同一100 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到100mg/L的標準儲備液。精密量取上述溶液，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為0.0，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0，50.0 mg/L的標準工作液。

1.3 樣品前處理

精密稱取菊花粉末1.00 g于25 mL比色管中,加入20 mL乙醇-0.1%氫氧化鈉（8:2）溶液，放入超聲波清洗器中40℃超聲15 min后取出，放冷至室溫并用乙醇稀釋至刻度，過0.22 μm有機濾膜,待上機分析。

1.4 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)不銹鋼柱,柱溫30℃；進樣量：20 μL；流量：1.0 mL/min；流動相A(0.1%磷酸溶液)，流動相B(甲醇)，梯度洗脫程序：0.0～5.0 min，90%A；5.0～10.0 min，90%～75%A；10.0～35.0 min，75%～50% A；35.0～36.0 min，50%～90%A；36.0～45.0 min，90% A。波長范圍330 nm。4種藥用成分標準色譜圖見圖1。

圖1 4種藥用成分標準色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of the four pharmaceutical components1-綠原酸;2-黃芩苷;3-檞皮素;4-蒙花苷

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇比例對回收率的影響

圖2 乙醇比例對回收率的影響Fig.2 The effect of ethanol ratio on the recoveries

由于4種藥用成分在乙醇中均有良好的溶解性，因此選取乙醇作為主要的提取溶劑。但因為黃芩苷在堿性環(huán)境下具有較強的穩(wěn)定性，所以在提取液中加入一定的堿液有助于黃芩苷保持穩(wěn)定。但由于檞皮素難溶于水，因此提取液中水相含量過高，會導(dǎo)致檞皮素回收率降低。本實驗探究了提取液乙醇比例對4種藥用成分回收率的影響，結(jié)果表明，乙醇比例在80%時，4種藥用成分的平均回收率最高，詳見圖2。

2.2 超聲時間對回收率的影響

本實驗對超聲時間對回收率的影響進行了探究，4種藥用成分的回收率隨超聲時間的增長而提高，但隨著超聲時間增長4種藥用成分回收率影響較小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲時間超過12 min后，4種藥用成分回收率趨于持平，變化不明顯，考慮到成本問題，選取超聲時間為15 min。詳見圖3。

圖3 超聲時間對回收率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on the recoveries

2.3 超聲溫度對回收率的影響

圖4 超聲溫度對回收率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic temperature on the recoveries

在超聲時間為15 min條件下探究了超聲溫度對回收率的影響，結(jié)果表明，超聲過程中加熱有助于4種藥用成分回收率的提高，但溫度過高，4種藥用成分可能因為被氧化，從而使回收率降低，綠原酸的變化尤為明顯。當溫度為40℃時，4種藥用成分的平均回收率最高，詳見圖4。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

將4種藥用成分的標準工作曲線在相應(yīng)的條件下進行測定，保留時間定性。以峰面積Y為縱坐標，相應(yīng)的濃度X（mg/L）為橫坐標，進行線性回歸定量，4種藥用成分的標準工作曲線相關(guān)系數(shù)r在0.998 5～0.999 8之間，結(jié)果表明4種藥用成分呈良好線性關(guān)系。以儀器的信噪比3倍計算，分別測得4種藥用成分的最低儀器檢出限，詳細見表1。

表1 4種藥用成分線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）和方法檢出限Table1 The linear equation,correlation coefficient and detection limits of the method

2.5 回收率及精密度實驗

用菊花粉末進行加標回收實驗，先重復(fù)測定4種藥用成分的本底值6次，取平均值，并根據(jù)本底值進行三個水平的加標。對各加標水平日內(nèi)平行測定6次，測得4種藥用成分的平均回收率為84.4%～97.2%。相對標準偏差（RSD）在4.88%～8.21%范圍內(nèi)，說明該方法重現(xiàn)性好，精密度高，達到分析要求，結(jié)果詳見表2。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法同時檢測菊花中的4種藥用成分。采用的乙醇-水溶液提取法一次性提取綠原酸、黃芩苷、槲皮素和蒙花苷，并進行提取條件優(yōu)化。在梯度洗脫程序下，4種藥用成分呈現(xiàn)良好分離度。方法學結(jié)果表明，本方法回收率高，重復(fù)性好，精密度高且靈敏度高，適用于菊花中綠原酸、黃芩苷、槲皮素和蒙花苷的同時檢測，為醫(yī)學藥學基礎(chǔ)研究提供了參考依據(jù)。

表2 回收率及精密度實驗結(jié)果（n=6）Table2 Results of recoveries and precision experiment for the method（n=6）

［1］張金杰,陳宇峰,顏鳴,等.野菊花中的黃酮類化學成分[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,32(1):15-18.

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［3］戴勝,張明,程文明,等.HPLC測定野菊花藥材中8種黃酮和有機酸的含量[J].中國中藥雜志,2013,38(12):1961-1965.

［4］陳靜梅,翁立冬,劉強,等.清咽寧顆粒的質(zhì)量標準研究[J].廣州化工,2015(20):126-129.

［5］孟慶云,符玲,高振,等.野菊花總黃酮提取方法比較及其抗氧化活性研究[J].中草藥,2015,46(21):3194-3197.

［6］鄧婷.高效液相色譜法同時測定野菊花注射液中3種有效成分的含量[J].湖南中醫(yī)雜志,2016,(7):181-183.

［7］劉帥英,王慧玉.HPLC法同時測定桑菊止咳合劑中綠原酸、連翹苷、黃芩苷[J].海峽藥學,2016,(7):49-51.

［8］袁琦,趙輝,蒲曉輝,等.HPLC法同時測定菊花中綠原酸、黃芩苷和槲皮素的含量[J].沈陽藥科大學學報,2014(2):112-115.

［9］彭貴龍,周光明,秦紅英.HPLC同時測定藥用白菊花中綠原酸、木犀草素、芹菜素和金合歡素[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014(7):1067-1071.

［10］唐婧,鄭勝彪,張雪梅,等.反相高效液相色譜同時測定菊花中黃芩苷和木犀草素的含量[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2011,30(2):25-28.

［11］沈亞芬,杜偉鋒,鄭敏霞,等.HPLC同時測定野菊花中綠原酸、咖啡酸和蒙花苷的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學, 2015(9):1117-1120.

［12］宋宏剛,裴彩云,趙韶華,等.不同產(chǎn)地野菊花藥材中蒙花苷及總黃酮含量測定[J].中成藥,2008,30(4):556-559.

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我國自主研發(fā)CAP1400反應(yīng)堆壓力容器一次通過試驗

2017年3月17日，在“大型先進壓水堆及高溫氣冷堆核電站”國家科技重大專項支持下，CAP1400示范工程1號機組反應(yīng)堆壓力容器水壓試驗順利完成。本次水壓試驗設(shè)計壓力為17.2MPa，該水壓試驗分為壓力容器本體水壓試驗和內(nèi)、外O環(huán)泄漏試驗兩階段，整體水壓試驗壓力為21.5MPa，保壓時間為10分鐘，壓力降至17.2MPa時進行內(nèi)、外O環(huán)泄漏試驗，水壓試驗期間各項指標均符合設(shè)計要求，全程無滲漏、冒汗等現(xiàn)象。該水壓試驗一次性順利完成，標志著我國自主設(shè)計研發(fā)的CAP1400反應(yīng)堆壓力容器已實現(xiàn)國產(chǎn)化，為三代核電批量化建設(shè)打下良好基礎(chǔ)。反應(yīng)堆壓力容器是核電機組的核心設(shè)備，是包容放射性物質(zhì)不外泄的最重要的安全屏障，60年壽期內(nèi)不可更換，其先進性對于確保核電站運行的安全性和可靠性至關(guān)重要。該反應(yīng)堆壓力容器由國家核電上海核工院獨立自主設(shè)計、中國一重自主制造。

Simultaneous Determination of Four Pharmaceutical Components in Chrysanthemum Indicum by HPLC

LI Ting,OU Shuo-jun,WANG Qiang,HUANG Man-gu
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food(Guangzhou),Guangdong Guangzhou 511447,China)

A high performance liquid chromatography(HPLC)method was established for simultaneous determination of chlorogenic acid,baicalin,quercetin and linarin in Chrysanthemum indicum.Samples were extracted with optimum conditions,then they were separated under the gradient elution conditions and finally detected by photodiode array detector.The results show that,four pharmaceutical components exhibits good liner relationship within the corresponding concentrations,correlation coefficient(r)is from 0.998 5 to 0.999 8.The average recoveries of four pharmaceutical components are 84.4%～97.2%,the limits of detection(LOD)of the method are 0.1～0.5 mg/L and the relative standard deviations(RSDs)are 4.88%～8.21%.So this method has high recovery,high precision,high accuracy, good reproducibility,and is suitable for determination of four pharmaceutical components in Chrysanthemum indicum.

HPLC;Chrysanthemum indicum;Pharmaceutical components;Simultaneous determination

TQ 463

A

1671-0460（2017）03-0566-03

2016-11-15

李婷（1986-），女，廣東省興寧市人，中級工程師，2008年畢業(yè)于廣州城市職業(yè)學院食品生物技術(shù)專業(yè)，研究方向：食品添加劑檢測。E-mail：543715255@qq.com。