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二甲磺酸乙烷對(duì)成年大鼠睪丸間質(zhì)不同時(shí)間點(diǎn)

[摘要] 目的 研究二甲磺酸乙烷（EDS）注射對(duì)雄性大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇關(guān)鍵合成酶表達(dá)的影響，并進(jìn)一步了解EDS對(duì)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇關(guān)鍵合成酶可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法 將25只90 d雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組（0 d，n = 5）一次性腹腔內(nèi)注射生理鹽水，EDS組（n = 20）一次性腹腔內(nèi)注射EDS 70 mg/kg體重。EDS組注射后7、21、35、90 d后取血清和睪丸組織，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血清及睪丸中的睪酮水平，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡方法（Western blot）分別檢測(cè)睪酮合成相關(guān)基因類(lèi)固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）、3β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶1型（3β-HSD1）、P45017α-羥化酶1（P450c17a1）、17β-羥基類(lèi)固醇脫氫酶3型（17β-HSD3）mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，EDS處理7 d后，睪丸內(nèi)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞幾乎完全被破壞，導(dǎo)致睪酮水平急劇下降（P < 0.01），睪酮合成相關(guān)酶StAR、3βHSD、P450scc、P450c17、17β-HSD3的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P < 0.01），而處理21、35 d后，上述相關(guān)酶mRNA及蛋白表達(dá)水平均有所回升（P < 0.01或P < 0.05），處理90 d后，上述相關(guān)酶基因及蛋白的表達(dá)水平已經(jīng)基本上恢復(fù)到與對(duì)照組相近的水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 EDS能夠特異性地破壞雄性SD大鼠睪丸組織中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，EDS的此種效應(yīng)對(duì)研究睪丸間質(zhì)細(xì)胞缺失下睪丸功能的變化進(jìn)而研究精子發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控均有較大意義。

[關(guān)鍵詞] 睪丸間質(zhì)細(xì)胞；二甲磺酸乙烷；睪酮；類(lèi)固醇合成酶

[中圖分類(lèi)號(hào)] R339.21 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）02（c）-0015-04

睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cell）是哺乳動(dòng)物睪丸間質(zhì)中的一種重要的內(nèi)分泌細(xì)胞，具有合成和分泌體內(nèi)超過(guò)90%睪酮的功能，對(duì)于雄性的生育能力及第二性征的維持至關(guān)重要，是男性體內(nèi)雄激素的最主要來(lái)源。Leydig的發(fā)育、數(shù)量及雄激素合成功能對(duì)男性的各個(gè)方面都具有決定性的影響[1]。二甲磺酸乙烷（ethane dimethane sulfonate，EDS）作為一種細(xì)胞毒性烷化劑，在20世紀(jì)80年代即已證實(shí)可以選擇性地殺死成年大鼠睪丸中的Leydig細(xì)胞，被認(rèn)為是研究Leydig細(xì)胞再生的候選藥物之一[2-3]。目前，國(guó)外采取EDS建立模型研究Leydig細(xì)胞再生及其相關(guān)研究的報(bào)道較多[4-7]，但國(guó)內(nèi)報(bào)道相對(duì)較少，因此，本研究通過(guò)觀察一次性腹腔注射EDS對(duì)成年大鼠Leydig細(xì)胞的作用，測(cè)定EDS對(duì)處理后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠睪丸Leydig細(xì)胞類(lèi)固醇關(guān)鍵合成酶類(lèi)固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR）、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）、3β-羥類(lèi)固醇脫氫酶1（3β-HSD1）、P45017α-羥化酶1（P450c17a1）、17β-羥類(lèi)固醇脫氫酶3（17β-HSD3）在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平表達(dá)的影響，為利用EDS建立體內(nèi)Leydig細(xì)胞再生模型的建立提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑儀器

90 d SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體重250～280 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK京2012-0001。主要試劑：EDS（純度>97%，洛克菲勒大學(xué)Renshan Ge教授惠贈(zèng)）；睪酮酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；RNA提取試劑盒（美國(guó)Omega公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司）；SYBR Green試劑盒（美國(guó)Promega公司）；PCR引物（上海生物工程有限公司）；抗體（美國(guó)Abcam公司）。主要儀器：熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將25只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組（0 d，n = 5）一次性腹腔內(nèi)注射生理鹽水，EDS組（n = 20）一次性腹腔內(nèi)注射EDS 70 mg/kg體重；EDS組注射后于第7、21、35、90天結(jié)束，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)固定時(shí)間處死大鼠（每組5只），采集血清和睪丸組織，用ELISA測(cè)定血清中及睪丸中的睪酮水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡方法（Western blot）分別檢測(cè)睪丸組織內(nèi)睪酮合成相關(guān)基因StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1、17β-HSD3基因和蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本文數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EDS對(duì)大鼠血清及睪丸內(nèi)激素水平的影響

EDS處理7 d后，大鼠血清中及睪丸內(nèi)睪酮水平濃度急劇下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），21 d后，濃度均有所回升，到35 d，已經(jīng)分別恢復(fù)到對(duì)照組水平的71%和75%，到90 d，濃度均已經(jīng)基本上恢復(fù)與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃剑ǚ謩e為109%和97%）。見(jiàn)圖1。

2.2 EDS暴露后對(duì)睪丸內(nèi)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平的影響

隨著EDS處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。EDS處理7 d，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1和17β-HSD3 mRNA水平較對(duì)照組急劇降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。而后隨著EDS處理時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度呈上升趨勢(shì)，處理21 d后，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3的表達(dá)分別回升24%、15%、61%、38%和60%（P < 0.01或P < 0.05），處理35 d后分別回升了43%、28%、80%、60%和77%（P < 0.01）（3β-HSD1、17β-HSD3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），到處理90 d后，上述指標(biāo)表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 EDS暴露后對(duì)睪丸內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

EDS處理7 d，StAR、P450scc、3β-HSD1和17β-HSD3蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組急劇降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。而后隨著EDS處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各蛋白的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，到90 d，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。處理21 d后，StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1及17β-HSD3的表達(dá)分別回升47%、80%、43%、55%和52%（P < 0.01）（P450scc表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），處理35 d后分別回升了72%、56%、80%、60%和76%（P < 0.01或P < 0.05）（P450scc表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），到處理90 d后，分別回升了79%、75%、80%、71%和80%，與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

Leydig細(xì)胞在其分化發(fā)育中有4個(gè)顯著不同的階段：睪丸間質(zhì)干細(xì)胞（SLC）、睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞（PLC）、未成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞（ILC）和成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞（ALC）[8，15-16]。Leydig細(xì)胞合成和分泌的睪酮是一系列酶促反應(yīng)，其主要依賴(lài)于StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17a1和17β-HSD3等關(guān)鍵酶的調(diào)控[9-10]。其中StAR主要參與類(lèi)固醇合成的早期調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是睪酮合成起始限速步驟，P450scc被認(rèn)為是睪酮合成的限速步驟，它主要是將轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，并在3β-HSD1作用下形成孕酮，后者再經(jīng)p450c17a1進(jìn)一步催化生成雄烯二酮，后者在17β-HSD的作用下，最終生成睪酮[11-13]。因此，Leydig細(xì)胞合成睪酮過(guò)程中的關(guān)鍵酶表達(dá)降低的直接結(jié)果必然是引起單個(gè)細(xì)胞合成睪酮的表達(dá)能力明顯降低，從而影響睪酮的合成和分泌[14-16]。EDS是具有Leydig細(xì)胞特異性“敲除”的化合物。

EDS可以暫時(shí)殺死成熟的Leydig細(xì)胞，其后伴隨是Leydig細(xì)胞再生的過(guò)程，這種再生過(guò)程與人類(lèi)青春期Leydig細(xì)胞的分化過(guò)程相類(lèi)似。馬學(xué)等[17]給予新生雄性SD大鼠腹腔注射EDS后，建立了“敲除”胚胎睪丸間質(zhì)細(xì)胞（FLC）模型，并確定了EDS有效和安全的劑量，為深入研究FLC和ALC之間的關(guān)系做了很好的前期研究基礎(chǔ)。張磊等[18]研究表明大鼠和小鼠EDS處理的生精小管體外培養(yǎng)模型能夠很好地模擬SLC在體內(nèi)的發(fā)育分化過(guò)程，彌補(bǔ)了細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在研究SLC發(fā)育分化中的不足，建立了一個(gè)非常有價(jià)值的研究模型，尤其是在篩選和評(píng)估不同外源物質(zhì)對(duì)SLC分化發(fā)育的影響研究有重要的作用。筆者也在前期的研究中利用EDS建立了“敲除”Leydig細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)，研究了再生后的Leydig細(xì)胞的基因表達(dá)情況[19-20]，為后續(xù)研究Leydig細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用EDS處理大鼠后，分別在第0、7、21、35、90天檢測(cè)血清中和睪丸內(nèi)睪酮水平，并用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)了相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)類(lèi)固醇合成關(guān)鍵酶StAR、P450scc、3β-HSD1、P450c17和17β-HSD3基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，這些酶的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平在EDS處理7 d時(shí)迅速下降，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)都呈回升趨勢(shì)，表達(dá)趨勢(shì)呈一致。表明，大鼠腹腔注射EDS 7 d后睪丸ALC被殺滅，但SLC仍然存在，逐漸增殖分化，Leydig細(xì)胞又會(huì)再生。結(jié)果與既往理論也不謀而合，即Leydig細(xì)胞的發(fā)育經(jīng)歷4個(gè)階段：干細(xì)胞（第0天）、祖細(xì)胞（第7天）、未成熟細(xì)胞（第21天）和成熟細(xì)胞（第90天）。

以上結(jié)果提示，EDS可以作為建立去除Leydig細(xì)胞模型的候選藥物，并且該模型也可以作為進(jìn)一步深入研究Leydig細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)研究的動(dòng)物模型，同時(shí)該模型對(duì)研究Leydig細(xì)胞缺失，進(jìn)而導(dǎo)致睪丸功能的變化以及精子發(fā)生的內(nèi)分泌調(diào)控均有較大意義。

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（收稿日期：2016-10-11 本文編輯：張瑜杰）