李鑫鑫　鄔少飛

【摘 要】數(shù)字PCR一般包括兩部分。即PCR的擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析。在PCR擴(kuò)增階段。利用數(shù)字PCR先將樣品稀釋到單分子水平[1]，平均到幾十到幾萬(wàn)個(gè)單元中進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，使得各個(gè)反應(yīng)單元中目標(biāo)分子是0或者1，使得目標(biāo)分子陽(yáng)性信號(hào)得以檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)會(huì)利用上端軟件控制實(shí)驗(yàn)室其中一臺(tái)PCR子儀器的運(yùn)行，對(duì)儀器中的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，以及對(duì)科學(xué)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，便于對(duì)基因的定量分析和檢測(cè)。該軟件要控制其中一臺(tái)PCR儀器的運(yùn)行和工作。另外這臺(tái)儀器會(huì)通過(guò)USB接口把采集的數(shù)據(jù)上傳到PC端，通過(guò)PC端的軟件程序進(jìn)行分析和處理。最后得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

【關(guān)鍵詞】數(shù)字PCR；熒光檢測(cè)儀；數(shù)據(jù)分析；生命科學(xué)與計(jì)算機(jī)；儀器控制

The Software System Design Model Based on Digital PCR Fluorescence Detector

LI Xin-xin WU Shao-fei

（Wuhan Institute of Technology School of computer science and Engineering，Wuhan Hubei 430205，China）

【Abstract】Digital PCR generally includes two parts. That is， the PCR amplification and fluorescence signal analysis. In the PCR amplification stage. Using digital PCR to dilute samples onto a single molecule level[1]， the average to dozens to tens of thousands of units in chemical reaction， make each reaction unit of target molecules is 0 or 1， makes the target molecules positive signal detection. One of them will use the upper software control laboratory PCR instrument operation， instrument of the data acquisition， as well as to the scientific analysis and processing the data collected， is advantageous for the quantitative analysis of the gene and detection. The software to control one PCR instrument operation and work. In addition this instrument will collect data uploaded to PC through USB interface， through analysis and deal with the PC software. Finally experimental conclusions.

【Key words】Digital PCR； Fluorescence detector； Data analysis； Life sciences and computer； Instrument control

0 引言

社會(huì)在不斷地進(jìn)步，人們的生活方式在提高，物質(zhì)條件也在逐步改善，越來(lái)越多的人在享受高品質(zhì)生活的同時(shí)，也愈加得關(guān)注個(gè)人的身體健康。數(shù)字PCR這種分子檢查技術(shù)除了用于疾病的預(yù)測(cè)及早期診斷外，還將用來(lái)指導(dǎo)人們的常規(guī)體檢，讓常規(guī)體檢更具有針對(duì)性，從而改變?nèi)藗兊慕】倒芾淼挠^念。除此之外，它還可以用來(lái)指導(dǎo)人們管理疾病，進(jìn)而指導(dǎo)病人安全用藥，可以幫助醫(yī)生規(guī)劃針對(duì)個(gè)體病人的治療措施，以便人們對(duì)疾病的治療更加有的放矢。

核酸分子的定量最常見(jiàn)的有三種方法；（1）利用核酸分子對(duì)光的吸收度的不同進(jìn)行測(cè)量；（2）在PCR反應(yīng)體系中添加熒光探針，用熒光信號(hào)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)過(guò)程，最后用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板處理[2]；（3）數(shù)字PCR將微量樣品進(jìn)行大量分級(jí)的稀釋和分液處理，使待測(cè)分子數(shù)不超過(guò)1個(gè)，在進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，使得含有1個(gè)目標(biāo)分子的樣品放大至幾百萬(wàn)倍，產(chǎn)生強(qiáng)大的熒光信號(hào)，對(duì)發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)的樣品計(jì)數(shù)[3]。

1 數(shù)字PCR檢測(cè)原理

數(shù)字PCR是一種基于單分子模板PCR擴(kuò)增，進(jìn)行核酸拷貝數(shù)精確定量的分析方法[4]?；A(chǔ)原理如圖1所示：

圖1 PCR檢測(cè)的基礎(chǔ)原理

首先把樣品分散到獨(dú)立的反應(yīng)單元，然后在一個(gè)板上進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立擴(kuò)增反應(yīng)，如熒光定量PCR一樣采用引物和熒光探針，陽(yáng)性反應(yīng)單元記為1，陰性反應(yīng)單元記為0[5]。接著用軟件進(jìn)行陽(yáng)性及陰性反應(yīng)單元數(shù)數(shù)，最后進(jìn)行泊松分布的計(jì)算，得出最終擴(kuò)增的拷貝數(shù)量。如圖2所示：

黑色小點(diǎn)代表陽(yáng)性反應(yīng)單元，白的小點(diǎn)代表陰性反應(yīng)單元。根據(jù)泊松概率分布公式進(jìn)行計(jì)算：

p=e（1）

其中：λ表示單位反應(yīng)單元中DNA分子的平均數(shù)量；

p表示在λ的條件下，單位單元中所含有的k個(gè) DNA分子的濃度；

設(shè)稀釋系數(shù)為m，則有λ=cm，c為樣品的原始數(shù)量。當(dāng)k=0時(shí)，p =eλ=e-cm，與此同時(shí)，p=，n-f為沒(méi)有標(biāo)記熒光時(shí)的分子反應(yīng)數(shù)目，n為參與反應(yīng)的分子總數(shù)目。所以：

=e-cm？陴cm=ln（1-）（2）

2 數(shù)字PCR熒光檢測(cè)儀的軟件模型設(shè)計(jì)

該軟件模型總體分為三個(gè)大塊：USB驅(qū)動(dòng)和信號(hào)的檢測(cè)分析和處理模塊；包含特定算法的邏輯運(yùn)算模塊；可視化的面板設(shè)置模塊?？傮w模塊設(shè)計(jì)如圖3所示。

其中USBManager主要功能：（1）USB數(shù)據(jù)的讀取和保存操作；（2）對(duì)數(shù)據(jù)處理（調(diào)用算法），并把峰值數(shù)據(jù)等保存到wellCtrl中；（3）顯示當(dāng)前運(yùn)行樣本的信息；（4）USB讀取異常處理；myMiniPlateCtrl（96孔板）主要功能：（1）選擇樣本；（2）更新畫(huà)圖和GridView顯示（3）保存選取樣本的設(shè)置。dataGridView主要功能：（1）把用戶選中樣本（孔）的每個(gè)通道的數(shù)據(jù)顯示；（2）把GridView顯示的樣本信息導(dǎo)出，并保存為Excel或CSV格式的文件。fileManager主要功能：（1）讀取和保存 Plate文件（2）讀取和保存TemplatePlate文件（3）讀取和保存 通道的.FCS文件（4）保存通道數(shù)據(jù) 至 wellCtrl類(lèi)。

concentrationPage面板中的包含循環(huán)閾值（Cycle threshold）的設(shè)置，對(duì)于一個(gè)PCR反應(yīng)，達(dá)到循環(huán)閾值時(shí)：

Nt=N0（1+E）（3）

其中，N0是初始模板的拷貝量，CT是循環(huán)閾值即擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，Nt是第CT個(gè)循環(huán)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)物的拷貝數(shù)。將上式兩邊分別取對(duì)數(shù)，得到：

計(jì)算出循環(huán)閾值

對(duì)于特定的PCR反應(yīng)，理想情況下，擴(kuò)增效率E和CT個(gè)循環(huán)反應(yīng)的拷貝數(shù)Nt均為定值，因此CT值與初始模板拷貝數(shù)N0的對(duì)數(shù)成反比關(guān)系。

3 實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境下，分別用兩組曲線圖來(lái)描述理想和非理想情況下PCR的反應(yīng)曲線圖。理想情況下的PCR反應(yīng)曲線圖：Nt=N0*2，其中橫坐標(biāo)CT表示反應(yīng)次數(shù)，縱坐標(biāo)Nt是第CT個(gè)循環(huán)反應(yīng)時(shí)產(chǎn)物的拷貝數(shù)。

圖4 理想情況下的PCR反應(yīng)曲線圖

非理想情況下的PCR反應(yīng)曲線圖：Nt=N0（1+E）CT。

4 結(jié)束語(yǔ)

數(shù)字PCR的市場(chǎng)前景大有可觀。各國(guó)科學(xué)家們致力于數(shù)字PCR的研發(fā)，已誕生了多種dPCR（Digital PCR）裝置，如液滴式、旋流片式、滑動(dòng)芯片式、集成流路芯片式等。商業(yè)化的dPCR平臺(tái)也在不斷面世。國(guó)內(nèi)一些科研單位和公司也進(jìn)行了相關(guān)研發(fā)，致力于高端儀器國(guó)有化、低成本化[6]。通過(guò)把計(jì)算機(jī)技術(shù)運(yùn)用在生命科學(xué)領(lǐng)域，能極大推動(dòng)醫(yī)學(xué)發(fā)展，該軟件模型為用戶提供了友好的人機(jī)交互，功能模塊劃分明確；但是系統(tǒng)中仍然存在一些不足之處有待改進(jìn)：

（1）實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）無(wú)法分辨2倍以下的基因表達(dá)差異或拷貝數(shù)變異，難以鑒定頻率低于1%的等位基因[7]。

（2）USB的串口通信不夠靈敏，建議改進(jìn)驅(qū)動(dòng)程序的算法。

【參考文獻(xiàn)】

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[責(zé)任編輯：朱麗娜]