劉威++袁芳艷++周丹娜++劉澤文++楊克禮++段正贏++郭銳++吳修竹++田永祥

摘要：牛支原體（Mycoplasma bovis）是引起犢牛肺炎、關(guān)節(jié)炎和成牛乳房炎的主要病原之一。從湖北恩施暴發(fā)牛支原體的肉牛場（70頭引種肉牛出現(xiàn)20%的死亡）分離得到一株牛支原體，命名為HB2015，并對其進(jìn)行了保藏（保藏號：CCTCC M 2016559），進(jìn)化分析結(jié)果顯示該菌株與M. bovis NM2012內(nèi)蒙株親緣關(guān)系較近，為牛支原體的防控提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：牛支原體（Mycoplasma bovis）；分離；鑒定；遺傳進(jìn)化分析

中圖分類號：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2016）09-0005-02

牛支原體（Mycoplasma bovis）是感染牛的一種重要的致病性病原體，可導(dǎo)致牛肺炎、耳炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜炎、流產(chǎn)或不孕等多種疾病[1，2]。2008年，在中國湖北省首次發(fā)現(xiàn)了疑似牛肺疫的呼吸道疾病，發(fā)病2 476頭（發(fā)病率高達(dá)50%～100%），死亡610頭，隨后貴州省和寧夏回族自治區(qū)也報(bào)道了類似病例[3]。通過檢測核酸，發(fā)現(xiàn)此呼吸道疾病并非牛肺疫復(fù)發(fā)，而是一種我國從未出現(xiàn)過的新發(fā)支原體傳染病[4]。目前，已有內(nèi)蒙古、廣西、天津、重慶、四川、河南等10多個省（市、自治區(qū)）報(bào)道了類似疫情，牛支原體已經(jīng)成為威脅我國養(yǎng)牛業(yè)的重要病原之一[5]。

在健康牛呼吸道中幾乎分離不到牛支原體，只有在感染牛的呼吸道中能夠分離到，并經(jīng)常引起臨床發(fā)病[6]。本研究對恩施某肉牛場送檢的牛肺臟病料進(jìn)行了病原分離和鑒定，并成功分離獲得了該致病菌株。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

我國湖北恩施地區(qū)從北部其他省份引進(jìn)牛群中，70頭引種肉牛出現(xiàn)20%的死亡，從該場收集到送檢的病變肺臟樣品3份。

1.2 分離用培養(yǎng)基

使用改良后的支原體液體培養(yǎng)基KM2，傳代。

1.3 病原分離試驗(yàn)

將待檢肺臟組織用含青霉素的雙蒸水浸泡后無菌取約5 g組織，研磨后加2 mL液體篩選培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min取上清，按1∶10倍比稀釋接種至液體篩選培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種1管，共接種5管，置37 ℃培養(yǎng)。每隔48 h進(jìn)行一次盲傳。待盲傳至2代后培養(yǎng)基顏色變黃再將其接種于平板固體培養(yǎng)基。將平板置5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h，進(jìn)行至少3次克隆純化后，將培養(yǎng)物保存于-80 ℃。

1.4 特異性PCR鑒定

通過合成的16SrRNA（F1：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；R1：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′）、oppF（F2：5′-CGTTATGCAAGATTAAATACTTACGAC-3'；R2：5′-TGAAAA

CTTTCTCAGCATTAGCC-3′）等引物對分離菌株進(jìn)行序列測定。應(yīng)用DNAstar、DNAman、MEGA5.0等生物學(xué)軟件進(jìn)行基因序列拼接、比對與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原分離

在液體培養(yǎng)基中盲傳2代后，3份樣品培養(yǎng)基顏色開始變黃，72 h后呈現(xiàn)明顯的黃色（圖1）。

2.2 PCR鑒定與遺傳進(jìn)化分析

16S rRNA測序結(jié)果表明，所分離得到的菌株為牛支原體。oppF基因的序列分析表明，M. bovis HB2015與其他菌株oppF基因相似性在99%左右，進(jìn)一步從基因水平上證實(shí)了分離株為牛支原體。同時與GeneBank中收錄的其他地方分離株比對，結(jié)果顯示M. bovis HB2015與M. bovis NM2012內(nèi)蒙株（GeneBank登錄號：CP011348.1）親緣關(guān)系較近，位于同一分支上；而M. bovis CQ-W70（GeneBank登錄號：CP005933.1）、M. bovis Hubei-1（GeneBank登錄號：CP002513.1）和 M. bovis HB0801（GeneBank登錄號：CP002058.1）親緣關(guān)系較近，位于同一分支（圖2）。

2.3 牛支原體HB2015的凍干

在菌株凍干保存時，比較了明膠-蔗糖保護(hù)劑（1.5%明膠+12.5%蔗糖）、牛奶-蔗糖保護(hù)劑（10%牛奶 +5%蔗糖）的凍干效果，結(jié)果顯示明膠-蔗糖保護(hù)劑凍干效果較好，復(fù)蘇成功率高于牛奶-蔗糖保護(hù)劑。因此，選用明膠-蔗糖保護(hù)劑對牛支原體進(jìn)行了大量的凍干，并將分離獲得的M. bovis HB2015菌株送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC M 2016559。

3 討論

牛支原體自1961年由Hale在美國從乳房炎病牛牛乳中分離出至今已有半個世紀(jì)[7]。感染?？沙蔀樾碌母腥驹唇?jīng)呼吸道傳播，其傳播過程可持續(xù)幾個月或長達(dá)幾年之久[8]。自2008年開始，中國部分地區(qū)從外地引進(jìn)肉用牛暴發(fā)了由牛支原體引起的以壞死性肺炎為主要特征的傳染性牛支原體肺炎疫情[3，4]。

病原的分離鑒定是診斷動物疫病的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于牛支原體的培養(yǎng)條件很高，分離培養(yǎng)較為困難，從臨床病料中分離、培養(yǎng)、鑒定的方法很少用于牛支原體的診斷。本試驗(yàn)采用牛支原體專用液體培養(yǎng)基KM2從3份肺臟病料樣品中分離到M. bovis HB2015分離菌株。牛支原體和無乳支原體基因組序列同源性較高[9]，有文獻(xiàn)報(bào)道在用牛支原體16SrRNA引物擴(kuò)增無乳支原體時，也可以出現(xiàn)目的條帶[10，11]。根據(jù)rifutbegovic等[12]的報(bào)道，牛支原體和無乳支原體的寡肽膜透酶（oppF）的基因差異較大，PCR擴(kuò)增時可以從牛支原體基因組中擴(kuò)增出約1.9 kb的片段，而無乳支原體則不能擴(kuò)增出任何片段，因此針對oppF基因設(shè)計(jì)的引物可以用于PCR鑒別牛支原體和無乳支原體。

我們對牛支原體分離株的oppF基因進(jìn)行了克隆與序列的測定，并構(gòu)建了進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示M. bovis HB2015與M. bovis NM2012內(nèi)蒙株（GeneBank登錄號：CP011348.1）親緣關(guān)系較近。有意思的是，提供牛支原體HB2015分離用病料的牛場恰恰是從陜西引種，運(yùn)輸回的肉牛到達(dá)恩施后發(fā)病，而M. bovis HB2015與M. bovis NM2012內(nèi)蒙株親緣關(guān)系較近，提示牛支原體可能是從陜西引種時就已呈隱性感染，引種回恩施后發(fā)病。

本研究從恩施暴發(fā)牛支原體的肉牛場中成功分離出牛支原體M. bovis HB2015菌株，并對其進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析和保藏，HB2015菌株的獲得為深入開展牛支原體的診斷試劑和防治劑研究提供了材料基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] MORTON J， MALMO J， HOUSE J， et al. Mycoplasma bovis in Australian dairy herds[J]. Aust Vet J. 2014，92（9）：322-323

[2] 張 瑞，崔 朋，巴曉亮，等.牛支原體臨床分離株牛體毒力和免疫原性比較[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（6）：126-132.

[3] 石 磊，龔 瑞，尹爭艷，等. 肉牛傳染性牛支原體肺炎流行的初步診斷[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（4）：572-572.

[4] 辛九慶，李 媛，郭 丹，等. 國內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30（9）：661-664.

[5] 伍曉紅，儲岳峰，張 軒，等.牛支原體的分離鑒定及16S rRNA基因序列分析[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：35-37.

[6] GOURLAY R N， THOMAS L H， WYLD S G. Increased severity of calf pneumonia associated with the appearance of Mycoplasma bovis in a rearing herd [J]. Veterinary Record， 1989， 124： 420-422.

[7] HALE H H， HELMBOLDT C F， PLASTRIDGE W N， et al. Bovine mastitis caused by Mycoplasma species[J]. Cornell Veterinarian， 1962， 52： 582-591.

[8] PFUTZNER H. Epizootiology of the Mycoplasma bovis infection of cattle[J]. Zentralblatt fur Bakteriologie Supplement， 1990， 20： 394-399.

[9] 楊銘偉，李 迪，趙海龍，等. 致犢牛肺炎牛支原體南疆株的分離鑒定及oppF基因序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（12）：25-29.

[10] AYLING R D， NICHOLAS R A J， JOHANSSON K F. Application of the polymerase chain reaction for the routine identification of Mycoplasma bovis [J]. Veterinary Record， 1997， 141： 307-308.

[11] HOTZEL H， SACHSE K， PFUTZNER H， Rapid detection of Mycoplasma bovis in milk samples and nasal swabs using the polymerase chain reaction[J]. Journal of Applied Bacteriology， 1996， 80：505-510.

[12] RIFATBEGOVIC M， ASSUNCAO P， POVEDA J B， et al. Isolation of Mycoplasma bovis from the respiratory tract of cattle in Bosnia and Herzegovina [J]. Veterinary Record， 2007， 160：484-485.