郭志蘭，車路陽，李晶哲，吳 雙，孫震曉，*，劉長振，*

（1.北 京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；3.中國人民解放軍總醫(yī)院骨科，北京 100853）

Metridia熒光素酶檢測(cè)條件的優(yōu)化

郭志蘭1，2，車路陽3，李晶哲2，吳 雙1，孫震曉1，*，劉長振2，*

（1.北 京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；3.中國人民解放軍總醫(yī)院骨科，北京 100853）

生物發(fā)光是自然界普遍存在的一種自然現(xiàn)象，在細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、腔腸動(dòng)物、昆蟲和魚等生物中均存在生物發(fā)光現(xiàn)象[1]。生物發(fā)光本質(zhì)是熒光素酶催化其底物熒光素發(fā)光的生物過程，熒光素酶是一種氧化酶，在有氧氣存在的情況下，催化其各自的底物氧化產(chǎn)生生物光[2-3]，一些熒光素酶發(fā)揮作用還需要ATP及Mg2+的輔助[4]。

根據(jù)熒光素酶表達(dá)的位置可將其分為胞質(zhì)型和分泌型?？蒲腥藛T在克隆了分泌型熒光素酶的基因后，將其作為報(bào)告基因廣泛運(yùn)用到科研及醫(yī)療等領(lǐng)域，如

對(duì)細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄情況[5]、體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝分布情況[6]等的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、病毒的復(fù)制過程及傳染機(jī)制等的研究[7-8]，對(duì)腫瘤增殖情況及藥物對(duì)腫瘤治療效果的判斷[9]及高通量藥物的篩選[10-11]等等。

Metridia熒光素酶(Metridia luciferase，MLuc)來源于海洋橈足動(dòng)物Metridia longa，可與特異性底物腔腸素(coelenterazine，CTZ)反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)光(λmax=480 nm)[13]，是一種熱穩(wěn)定性高的分泌型熒光素酶。Markova等[12]在2004年從Metridia longa中首次克隆出了MLuc的cDNA，全長897 bp，其中開放閱讀框656 bp，編碼相對(duì)分子質(zhì)量2.39×104的氨基酸多肽。之后研究人員對(duì)MLuc嘗試了一系列的改造，如Takenaka等[13]克隆出了野生型MLuc的兩種相對(duì)分子質(zhì)量較小的變體，分別為2.27×104和2.03×104；Markova等[14]又于2012年報(bào)道了在N末端截去一些氨基酸序列的高活性MLuc 變體，接著又在2015年報(bào)道了目前最小的，相對(duì)分子質(zhì)量為1.65×104的高活性MLuc變體[15]。

本實(shí)驗(yàn)室在使用MLuc作為報(bào)告基因的過程中發(fā)現(xiàn)，MLuc酶的發(fā)光反應(yīng)受環(huán)境影響較大，對(duì)結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性造成了較大的影響，而并未查閱到相關(guān)報(bào)道的文獻(xiàn)，故本實(shí)驗(yàn)室在不同檢測(cè)條件下對(duì)其發(fā)光強(qiáng)度及穩(wěn)定性進(jìn)行了初步比較，并嘗試摸索其合適的檢測(cè)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

感受態(tài)大腸桿菌E.coli DH5α購于天根生化科技(北京)有限公司；人胚腎上皮包裝細(xì)胞GP2-293、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa由本實(shí)驗(yàn)室保存；pQCXIP載體購于Clontech公司；NF-κB序列、MLuc序列由北京普爾普樂生物科技有限公司合成。限制性內(nèi)切酶、連接酶購于Fermentas公司；腔腸素購于Sigma公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司；Ready-To-GlowTMSecreted Luciferase Reporter System試劑盒購于Clontech公司；DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司、胎牛血清購于HyClone公司。

1.2 方法

1.2.1 pQCXIP-NF-κB-MLuc的構(gòu)建及其鑒定 首先將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP利用Bgl II、Age I進(jìn)行雙酶切，去除pQCXIP原有CMV啟動(dòng)子，然后將合成的含有轉(zhuǎn)錄因子NF-κB增強(qiáng)子和TATA box序列(序列來源于Clontech公司，兩端含有Bgl II和Age I的酶切位點(diǎn))的DNA片段經(jīng)Bgl II、Age I雙酶切裝載入改造后的pQCXIP質(zhì)粒上。MLuc(序列來源于Clontech公司，兩端含有Age I和EcoR I的酶切位點(diǎn))與上述得到的pQCXIPNF-κB質(zhì)粒分別用Age I、EcoR I進(jìn)行雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化獲得重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-NF-κBMLuc。本實(shí)驗(yàn)合成的MLuc序列的N端部分含有分泌信號(hào)肽，可幫助蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。

1.2.2 MLuc酶的制備 利用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的pQCXIP-NF-κB-MLuc質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到人的宮頸癌細(xì)胞系HeLa中進(jìn)行表達(dá)，其中質(zhì)粒與lipo2000的質(zhì)量體積比為1∶2，轉(zhuǎn)染后仍使用低血清培養(yǎng)基Opti-MEM進(jìn)行培養(yǎng)。48h后，收集培養(yǎng)基上清，離心去除殘留的細(xì)胞碎片，分裝，-80℃ 保存。

1.2.3 MLuc酶的檢測(cè) 在常規(guī)培養(yǎng)基或緩沖液中加入底物CTZ至相應(yīng)濃度，按每孔100μL加至黑色96孔板中，然后加入制備的MLuc酶或含MLuc酶的細(xì)胞上清10μL，或直接在含分泌的MLuc酶的培養(yǎng)基上清中添加CTZ至相應(yīng)濃度，充分混勻，于化學(xué)發(fā)光儀(BioTek Synergy 2)中進(jìn)行相對(duì)發(fā)光單位 (relative luminescence unit，RLU)值讀取。

1.2.4 PBS+0.02% NP-40緩沖液與Clontech試劑盒檢測(cè)靈敏度的比較 取上述制備的MLuc酶，先用培養(yǎng)基(RPMI 1640+10%胎牛血清，R10)稀釋10倍作為母液，再依次4、16、64、256、1 024倍梯度稀釋，各取100μL，加入10μL添加底物CTZ(30μmol/L)的反應(yīng)buffer(Ready-To-GlowTMSecreted Luciferase Reporter System，Clontech)，充分混勻后檢測(cè)RLU值；取上述制備的MLuc酶作為母液，用R10培養(yǎng)基4、16、64、256、1 024倍梯度稀釋，各取10μL，再加入100μL添加底物CTZ(3μmol/L)的PBS+0.02% NP-40緩沖液，充分混勻后檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 pQCXIP-NF-κB-MLuc的構(gòu)建及其鑒定

利用Bgl II、Age I雙酶切鑒定表明(圖1A)，雙酶切出來的核酸條帶與理論插入的NF-κB增強(qiáng)子/TATA box序列條帶大小吻合，說明已構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pQCXIP-NF-κB。隨后將MLuc與重組質(zhì)粒pQCXIPNF-κB經(jīng)Age I、EcoR I雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，并經(jīng)Bgl II、EcoR I雙酶切鑒定(圖1B)，結(jié)果表明MLuc序列被成功插入pQCXIP-NF-κB中，獲得了目標(biāo)質(zhì)粒pQCXIP- NF-κB-MLuc。該質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序證明序列完全正確。

2.2 MLuc酶檢測(cè)過程中的影響因素

2.2.1 pH的影響 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基(RPMI 1640+10%胎牛

血清，R10)的pH，檢測(cè)pH從5.0到9.0范圍內(nèi)MLuc與底物CTZ反應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果如圖2A，pH的波動(dòng)對(duì)發(fā)光值大小的影響非常明顯。pH在6.5時(shí)RLU值最大，7～7.5之間較平穩(wěn)，而在pH<6或>8時(shí)，其RLU值大幅下降。

圖1 pQCXIP-NF-κB-Mluc的構(gòu)建及鑒定

圖2 培養(yǎng)基對(duì)MLuc酶發(fā)光反應(yīng)的影響

2.2.2 血清的影響 將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pQCXIP-NF-κB-MLuc 24h后的HeLa細(xì)胞分別以每孔5×104、2×104、1×104、5×103、2×103、1×103、500個(gè)/孔的量接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后，取培養(yǎng)基上清進(jìn)行RLU值的檢測(cè)，結(jié)果如圖2B，在每孔5×103～5×104個(gè)細(xì)胞時(shí)，MLuc酶的表達(dá)量與細(xì)胞數(shù)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，而≤2×103時(shí)無明顯差異。各組上清經(jīng)精密pH試紙驗(yàn)證，幾乎無差別，故排除pH的影響。而同樣檢測(cè)條件下，取HeLa培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基加10%的血清，D10)及DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行RLU值的檢測(cè)，結(jié)果含血清的培養(yǎng)基其RLU值為609±61，與按每孔5×102個(gè)細(xì)胞接種的上清RLU值已相近，而DMEM僅為28± 4，也就意味著是培養(yǎng)基中的血清帶來檢測(cè)背景。

2.3 MLuc酶檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.3.1 緩沖液的選擇 我們選擇了可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的Tris、Hepes、PBS 3種緩沖液，pH均調(diào)為7.4。在含有底物CTZ(3μmol/L)的3種緩沖液(100μL)中，分別加入上述制備的MLuc酶10μL，充分混勻后，于發(fā)光檢測(cè)儀中檢測(cè)，結(jié)果如圖3，可見相比于Tris及Hepes，PBS緩沖液無論是在發(fā)光強(qiáng)度及穩(wěn)定性方面都具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

圖3 MLuc在不同緩沖液中的發(fā)光情況

2.3.2 表面活性劑的影響 在確定了選用PBS緩沖液后，我們嘗試通過添加表面活性劑來進(jìn)一步改善c

mLuc酶發(fā)光的性能。在比較了幾種常用的及不常用的表面活性劑后，我們發(fā)現(xiàn)非離子型表面活性劑NP-40會(huì)對(duì)MLuc酶的發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生較大影響，如圖4，在PBS中添加0.01% NP-40(V/V)可顯著增加其發(fā)光強(qiáng)度，增加NP-40濃度至0.05%可顯著增加其穩(wěn)定性，但同時(shí)使其RLU值略有降低。此外，添加0.01%及0.02% NP-40幾乎不會(huì)產(chǎn)生背景(RLU值在20附近)，而添加0.03% ～0.05% NP-40則使檢測(cè)背景略有提高(RLU值在200附近)。

圖4 NP-40對(duì)MLuc發(fā)光性能的影響

2.4 PBS+0.02% NP-40與Clontech緩沖液檢測(cè)靈敏度的比較

在同樣MLuc濃度及底物濃度下，比較Clontech緩沖液與PBS+0.02% NP-40能夠檢到的最低酶量，結(jié)果如圖5，PBS+0.02% NP-40緩沖液在上述制備的MLuc稀釋2 560倍時(shí)依然與其RLU值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，而Clontech緩沖液在稀釋160倍后其RLU值開始趨于平緩，無法體現(xiàn)MLuc濃度的差異。

圖5 PBS+0.02% NP-40與Clontech緩沖液檢測(cè)靈敏度比較

3 討 論

培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)過程及儲(chǔ)存過程中，由于與空氣的接觸，細(xì)胞增殖代謝等原因，pH會(huì)不可避免地發(fā)生變化，pH在6～8范圍內(nèi)的波動(dòng)很常見，這就意味著會(huì)對(duì)MLuc酶發(fā)光值大小產(chǎn)生很大影響，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。而pH變化對(duì)MLuc的RLU值影響可能是因?yàn)閜H對(duì)MLuc酶的活性產(chǎn)生較大影響，從而影響其與CTZ反應(yīng)的發(fā)光值，當(dāng)然也不排除pH會(huì)影響底物CTZ活性的可能。

針對(duì)血清也會(huì)使底物CTZ發(fā)光的現(xiàn)象，猜測(cè)其原因可能是血清中含豐富的蛋白質(zhì)及多肽等，其某些氨基酸也可以與底物CTZ相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合產(chǎn)生類似于MLuc酶的功效。Vassel等[16]對(duì)白蛋白能使CTZ化學(xué)發(fā)光的研究部分解釋了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為血清中肯定還有其他成分也有類似的作用，還需進(jìn)一步研究。對(duì)于一些比較小的體系，如小量接種的96孔板，甚至單細(xì)胞體系，血清帶來的背景，將會(huì)導(dǎo)致對(duì)實(shí)際表達(dá)酶量及各組之間酶量比例關(guān)系判斷產(chǎn)生很大誤差；此外，對(duì)于一些不太明顯的組間差異，很有可能會(huì)因?yàn)檠鍘淼南鄬?duì)較大的背景而被忽略。也就是說，血清帶來的背景影響使MLuc報(bào)告基因本身的準(zhǔn)確性及靈敏都降低了。

在發(fā)現(xiàn)上述MLuc酶活檢測(cè)過程中存在的問題后，我們開始驗(yàn)證猜想并嘗試找尋解決方案。如圖2所示，MLuc酶在不同pH條件下RLU值波動(dòng)明顯，培養(yǎng)基的血清導(dǎo)致檢測(cè)背景?？紤]到上述問題集中在MLuc酶所在的環(huán)境中——培養(yǎng)基，故我們考慮更換MLuc酶的檢測(cè)環(huán)境，選用一種緩沖液來減弱由于培養(yǎng)基的pH、所含血清等帶來的一系列問題。如圖3及圖4所示，在比較了幾種常用的緩沖體系及添加NP-40后，本研究最終選定了添加0.02%(V/V)NP-40的PBS緩沖體系，因該體系能較好地避免上述培養(yǎng)基的弊端，具有穩(wěn)定的pH檢測(cè)環(huán)境、檢測(cè)背景低，而且MLuc酶與CTZ反應(yīng)的發(fā)光值也相對(duì)穩(wěn)定。該本系與目前市場(chǎng)上Clontech生產(chǎn)的針對(duì)MLuc酶檢測(cè)的試劑盒相比，靈敏度更高(如圖5所示)。由此，我們認(rèn)為添加0.02% NP-40的PBS緩沖液更適合于對(duì)MLuc酶的檢測(cè)。此外，除了本研究中所涉及的MLuc酶，其他熒光素酶等報(bào)告基因也存在類似的檢測(cè)問題，通過類似本研究的調(diào)整方式也可進(jìn)行檢測(cè)方式的優(yōu)化，更靈敏且準(zhǔn)確地體現(xiàn)所研究的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的含量或變化量 ，從而更好地對(duì)相應(yīng)信號(hào)通路的變化情況作出判斷。

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Amodified assay system formetridia luciferase

GUO Zhilan1，2，CHE Luyang3，LI Jingzhe2，WU Shuang1，SUN Zhenxiao1，*，LIU Changzhen2，*
(1.College of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinesemedicine, Beijing 100102; 2.Beijing Key Laboratory of Research of Chinesemedicine on Prevention and Treatment formajor Diseases, Experimental Research Center, China Academy of Chinesemedical Sciences, Beijing 100700; 3.Departmentof Orthopedics, Chinese People’s Liberation Army Generalhospital, Beijing 100853, China)

目的： 探討培養(yǎng)基pH、血清對(duì)Metridia熒光素酶(MLuc)檢測(cè)的影響并嘗試找到一種優(yōu)化的檢測(cè)條件。方法：構(gòu)建表達(dá)MLuc的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞系HeLa，制備收獲MLuc；利用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)不同條件下的培養(yǎng)基對(duì)MLuc發(fā)光性能的影響，并嘗試通過不同緩沖液與試劑的組合代替培養(yǎng)基來獲得最佳條件。結(jié)果：培養(yǎng)基pH變化導(dǎo)致MLuc發(fā)光值產(chǎn)生較大波動(dòng)，血清的存在會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)背景；添加0.02%(V/V)NP-40的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.4)作為MLuc檢測(cè)的緩沖體系代替培養(yǎng)基，其發(fā)光值大小相當(dāng)，檢測(cè)背景值由原來的600左右降低到20左右。結(jié)論：以添加0.02% NP-40的PBS作為MLuc檢測(cè)的緩沖體系可消除培養(yǎng)基pH、血清的影響，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確和靈敏。

熒光素酶；pH；血清；檢測(cè)；優(yōu)化

OBJECTIVE:To investigate whether the pH and serum of cell culturemedium would affect themetridia luciferase (MLuc) assay or not，and to explore amodified assaymethod formLuc.METHODS：A recombinant retrovirus vector which expressedmLuc was constructed and then transiently transfected intohuman cervical cancer cell lineheLa to producemLuc.Then，the effects of cell culturemedium (e.g.buffers combined with reagents) on bioluminescence ofmLuc were assayed.RESULTS：Various pH levels of cell culturemedium caused great fluctuationof the bioluminescence intensity ofmLuc.In addition，serum in the cell culturemedium would alter the background ofmLuc.When the cell culturemedium was replaced by phosphate buffered saline (PBS) supplemented with 0.02% (V/V) NP-40 (pH=7.4)，the bioluminescence intensity between them was comparable.However，the background level ofmLuc was decreased from 600 to 20.CONCLUSION：Using PBS supplemented with 0.02% NP-40 as an assay buffer formLuc，the side effects from pH and serum of cell culturemedium duringmLuc assay would be reduce and applicationofmLucin research can be improved.

luciferase；pH；serum；assay；modify

Q819

A

1004-616X(2016)06-0438-05

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.005

2016-08-28；

2016-10-31

國家自然科學(xué)基金(31170829，81171762，81550017，81473418)；中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題項(xiàng)目(ZZ2015015)

作者信息：郭志蘭，E-mail：gzl20141019@163.com。*通信作者，劉長振，E-mail：lcz0220@163.com；孫震曉，E-mail：s unzxcn@hotmail.c om