鄭 劍，藍 濤，劉 威，鄧榮霞，李培茂，張艷芳，劉建軍，*

（1.湖 南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南 長沙 410013；2.深 圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518055；3.深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 518001）

三氯乙烯藥疹樣皮炎患者血清miRNAs差異表達譜分析

鄭 劍1，2，藍 濤2，劉 威2，鄧榮霞2，李培茂3，張艷芳3，劉建軍1，2，*

（1.湖 南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南 長沙 410013；2.深 圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518055；3.深圳市職業(yè)病防治院，廣東 深圳 518001）

約為20～24個核苷酸，通過與其靶基因結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，以往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在細胞的增殖、分化、凋亡和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA調(diào)控人體內(nèi)1/3的基因表達，許多疾病的發(fā)生發(fā)展與miRNA密切相關(guān)[2]。大量研究表明miRNA可作為新的分子標志物，但有關(guān)OMLDT的miRNA研究尚未見報道。因此，本研究利用基因芯片技術(shù)，篩選OMLDT與TCE接觸者血清之間的差異表達miRNA，為進一步驗證OMLDT生物標志物和闡明miRNA在OMLDT發(fā)生和發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2009年1月1日—2014年12月30日入住深圳市職業(yè)病防治院的OMLDT病例34例，對照組34例。病例組入選標準嚴格按照國家診斷標準《職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎診斷標準》[3]執(zhí)行。對照組入選標準為明確的TCE接觸史，體檢合格，均排除艾滋病、心血管、肝臟、腎臟及糖尿病等疾病。年齡、性別、居住環(huán)境等與病例組相匹配。miRNA芯片篩查選取其中5位OMLDT患者和5位對照人群的血清。實時熒光定量PCR(qPCR)驗證采用34位OMLDT患者和34位對照人群的血清。

1.2 血清收集

干燥真空管采集全血(6mL)，室溫下放置20～30min，4℃、2 000 g離心10min，收集血清，于-80℃保存待用。

1.3 總RNA抽提和質(zhì)量檢測

根據(jù)miRNeasy Serum/Plasma Kit(德國Qiagen公司)試劑盒說明書步驟，提取血清中總RNA，使用NanoDrop 2000c測定RNA的純度和濃度。

嚴肅黨內(nèi)政治生活是加強黨的自身建設(shè)的基礎(chǔ)性工作，要把我們黨建設(shè)成為始終走在時代前列、人民衷心擁護、勇于自我革命、經(jīng)得起各種風(fēng)浪考驗、朝氣蓬勃的馬克思主義執(zhí)政黨，就必須把嚴肅黨內(nèi)政治生活這一基礎(chǔ)性工作做好。習(xí)近平同志站在保持黨的馬克思主義政黨性質(zhì)、更好擔(dān)負歷史使命、全面加強自身建設(shè)和形成良好黨內(nèi)政治生態(tài)的戰(zhàn)略高度，對嚴肅黨內(nèi)政治生活的應(yīng)有作用給予充分肯定。

1.4 熒光探針的制備、標記和芯片雜交

采用miRCURY LNATMARRAY Power標記試劑盒(丹麥Exiqon公司)，用標記酶將Hy3TM熒光基團標記miRNA，得到雜交探針，在標準條件下使用MAUI雜交儀將標記好的探針和miRCURY LNATM芯片雜交。

1.5 qPCR驗證

按照miScriptⅡRT Kit試劑盒(德國Qiagen公司)說明書步驟進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為16℃、30min，42℃、40min，85℃、5min。按照miScript SYBR Green Kit(德國Qiagen公司)試劑盒說明書步驟進行PCR擴增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min；95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s，40個PCR循環(huán)。引物序列見表1。以miR-93-5p為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。

表1 引物序列表

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片熒光強度，使用GenePix Pro V6.0軟件將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息，通過配對t檢驗進行差異基因表達的分析。使用軟件MeV 4.0對數(shù)據(jù)進行聚類分析。

1.7 靶基因預(yù)測

使用miRWalk 2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/ zmf/mirwalk2/index.html)對篩選出具有顯著差異的miRNAs進行miRNA靶基因的預(yù)測，并將預(yù)測結(jié)果與miRanda、miRDB、RNA22、Target Scan軟件預(yù)測的結(jié)果進行對比，找出幾個數(shù)據(jù)庫中這些miRNA共同的靶基因。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

實驗組男性22名，女性12名，對照組男性21名，女性13名，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.63，P= 0.80)；實驗組平均年齡(26.74±9.61)歲，對照組平均年齡(26.29±6.11)歲，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t= 0.226，P= 0.82)。

2.2 病例組miRNA差異表達及聚類圖

在5位OMLDT患者(病例組)和5位對照人群(對照組)血清樣本中，提取出的總RNA D(280)/D(260)比值均在1.8～2.0之間，RNA質(zhì)量較好，能滿足miRNA芯片檢測要求。與對照組相比，病例組血清中共有69個差異表達miRNAs，其中高表達39個，低表達30個。應(yīng)用聚類分析方法，將差異表達的69個miRNA芯片數(shù)據(jù)導(dǎo)入MeV 4.0軟件，得到聚類圖(圖1)。應(yīng)用MiRanda分析軟件，搜索與OMLDT的信息，選擇與OMLDT有關(guān)的miR-199b-5p進行進一步驗證。

圖1 差異表達miRNA的聚類圖

2.3 qPCR驗證結(jié)果

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示(圖2)，miR-199b-5p在OMLDT中高表達(P<0.05)。

圖2 qPCR檢測miR-199b-5p的相對表達

2.4 差異表達miRNAs的火山圖

火山圖將不同組之間差異表達的miRNAs進行圖形化的展示，X軸表示miRNAs表達倍數(shù)的變化(log2轉(zhuǎn)換)，Y軸表示對應(yīng)的P值(-lg轉(zhuǎn)換)，如圖3。紅色表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且差異倍數(shù)>2倍。通過分析，共有22個顯著差異表達的miRNAs。

圖3 差異表達miRNAs的火山圖

2.5 靶基因預(yù)測

通過miRWalk 2.0對篩選出來差異顯著的22個miRNA進行靶基因預(yù)測，并將預(yù)測結(jié)果與其他軟件的預(yù)測結(jié)果進行比較，只有miR-409-3p和miR-485-3p在 5個數(shù)據(jù)庫中都預(yù)測到了共同的靶基因，預(yù)測結(jié)果顯示miR-409-3p的靶基因是APOBEC2、CTNND1、CNTN4、ABCA13、SPRED1、GAB1、VPS41、COMMD9、 ITGB3、TAL1、MRP63、MOBKL1A、

ZNF614、MAP4K3。miR-485-3p的靶基因是GABRA4、MEOX2、NFYB、UBA6、LOC400120、GNAI1。

3 討 論

三氯乙烯是一種常見的有機溶劑和環(huán)境污染物。近年來國內(nèi)外因職業(yè)接觸而引起的TCE中毒事件屢見報道，其中以職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎居多。該疾病發(fā)病迅速，缺乏特效治療藥物，具體發(fā)病機制仍不清楚，嚴重危害廣大工人的健康，已成為社會高度關(guān)注的職業(yè)衛(wèi)生和公共衛(wèi)生問題[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一類被稱為微小RNA(microRNA，miRNA)的非編碼小RNA在疾病發(fā)生中起著重要的調(diào)控作用。miRNA能夠與血液中蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，穩(wěn)定的存在于外周血中，疾病狀態(tài)下miRNA的異常表達，提示miRNA能夠作為疾病無創(chuàng)診斷的潛在生物標志物[5]。

本研究運用基因芯片技術(shù)，建立OMLDT和三氯乙烯接觸者之間血清miRNA差異表達譜，qPCR驗證miR-199b在OMLDT中高表達，以往的研究表明，miR-199b與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)：miR-199b在宮頸癌組織中高表達[6]，miR-199b通過靶蛋白DDR1抑制乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[7]。miR-199b在TCE處理的細胞中差異表達[8]，OMLDT是人群通過接觸TCE引起的過敏性反應(yīng)，miR-199b可能通過細胞凋亡、增殖在OMLDT發(fā)生和發(fā)展中起作用。對差異倍數(shù)2倍以上的miRNA進行靶基因預(yù)測，miR-489、miR-409在5個數(shù)據(jù)庫中都預(yù)測到了相同的靶基因，miR-489和miR-409 可能通過調(diào)控這些靶基因在OMLDT的發(fā)生、發(fā)展中起作用，為將來進一步研究miRNA在三氯乙烯誘導(dǎo)的藥疹樣皮炎中的機制指明了方向。其中Spred1是我們預(yù)測差異表達miR-409的靶基因，Spred1與Ras結(jié)合后，能夠抑制胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活化，從而下調(diào) Ras-ERK-MAPK信號通路，MAPK通路在肝臟免疫損傷、肝臟損傷與修復(fù)中起著重要作用[9]，miR-409可能靶向調(diào)節(jié)Spred1的表達，通過下調(diào)MAPK信號通路，造成三氯乙烯藥疹樣皮炎患者的肝損傷。

本研究針對OMLDT，篩選了69個差異表達的miRNAs，預(yù)測了其中差異表達miR-409和miR-485的靶基因，尤其是miR-199b經(jīng)qPCR驗證后，可作為OMLDT潛在的分子標志物，為進一步研究OMLDT 患者血清中miRNAs標志物提供了理論基礎(chǔ)，具有十分重要的意義。

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Differentially expressedmiRNA profile in workers with trichloroethylene-inducedmedicamentosa-like dermatitis

ZHENG Jian1，2，LAN Tao2，LIU Wei2，DENG Rongxia2，LI Peimao3，ZHANG Yanfang3，LIU Jianjun1，2，*
(1.Departmentof Preventivemedicine,medicine School ofhunan Normal University, Changsha 410013,hunan; 2.Shenzhen Center for Disease Control & Prevention, Shenzhen 518055, Guangdong; 3.Shenzhen Prevention and Treatment Center foroccupational Disease, Shenzhen 518001, Guangdong, China)

目的： 分析三氯乙烯藥疹樣皮炎(OMLDT)患者和三氯乙烯接觸者血清microRNA(miRNA)表達譜的差異。方法：分別采集5名三氯乙烯藥疹樣皮炎患者和5名接觸者血液，分離血清，抽提總RNA進行Hy3熒光標記，然后濃縮標記的樣品，運用miRCURY LNA芯片進行miRNA芯片雜交，雜交后進行圖像掃描，所得數(shù)據(jù)使用GenePix Pro V6.0軟件進行miRNA差異表達分析并采用qPCR進行驗證。對差異較大的miRNA用miRWalk 2.0進行靶基因預(yù)測，并與其他預(yù)測軟件結(jié)果進行比較。結(jié)果：OMLDT患者與三氯乙烯接觸者比較，共有69個差異表達的miRNAs，其中低表達30個，高表達39個(包含miR-199b)。qPCR驗證亦顯示miR-199b在OMLDT中高表達。靶基因預(yù)測結(jié)果顯示miR409-3p和miR485-3p在5個預(yù)測軟件均預(yù)測到了共同的靶基因。結(jié)論：三氯乙烯藥疹樣皮炎患者血清miRNAs表達譜發(fā)生了顯著改變，miR-199b可能是OMLDT潛在的易感生物標志物。

miRNA；三氯乙烯藥疹樣皮炎；靶基因預(yù)測；生物標志物

OBJECTIVE:To profilemicroRNAs expression among workers with trichloroethylene (TCE)-inducedmedicamentosa-like dermatitis (OMLDT).METHODS：Serum samples from 5 patients with OMLDtand with TCE contacts were collected.The total RNA was extracted then labeled withhy3 fluorescent.MicroRNAs werehybridized withmiRCURY LNA chips and images were acquired using the GenePix 4000B scanner，qPCRmethod was used to verify the results ofmiRNAmicroarray.The results were further analyzed by prediction softwares.RESULTS：A total of 69microRNAs were differentially expressed betweenoMLDtand TCE contacts.Among themicroRNAs，39 were upregulated and 30 were down-regulated.Increase ofmiR-199b-5p was verified using qPCR.Target prediction results showed that the same target genes ofmiR-409-3p andmiR-485-3phad been predicted in all forecasting software.CONCLUSION：The study showed that expressionofmicroRNA in serum of workers with OMLDT was significantly altered，andmiR-199bmight serve as a candidate biomarker foroMLDT.

miRNA；occupationalmedicamentosa-like dermatitisinduced by trichloroethylene；target gene prediction；biomarkers

R394.6

A

1004-616X(2016)06-0468-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.011

2016-07-12；

2016-11-01

國家自然科學(xué)基金(81273126)；深圳市基礎(chǔ)研究計劃項目(JCYJ 20150402102135497)；深圳市學(xué)科布局項目(JCYJ201604281423 16603)

作者信息： 鄭 劍，E-mail：653242262@qq.cm。*通訊作者，劉建軍，