陳廷玉，孫 潔，楊 玉，朱秋雙，苗 智，鐘堂武，盧春鳳*

（佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

活性氧在異煙肼誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷中的作用及槲皮素的保護(hù)效應(yīng)

陳廷玉，孫 潔，楊 玉，朱秋雙，苗 智，鐘堂武，盧春鳳*

（佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

異煙肼(isoniazid，INH)是抗結(jié)核桿菌的主要用藥之一，有很多不良反應(yīng)，最嚴(yán)重的是肝臟損傷，但到目前為止其肝臟毒性的具體機(jī)制尚未闡明[1-4]。槲皮素(quercetin)是植物界分布最廣的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜以及一些中草藥中，是人類飲食中最主要的生物類黃酮。近年來，隨著人們對槲皮素了解的深入，槲皮素的廣泛生理及藥理作用已引起國內(nèi)外學(xué)者的高度重視[5-8]。因此，本實驗以體外培養(yǎng)的人肝細(xì)胞L-02為研究對象，研究活性氧(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的線粒體損傷在INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷中的作用，及槲皮素的保護(hù)效應(yīng)和機(jī)制，以期為臨床INH肝臟毒性的防治提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

槲皮素、異煙肼、2，7-二氯熒光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)和羅丹明123(Rhodamine123，Rh123)均為美國Sigma公司產(chǎn)品；正常熔點瓊脂糖、低熔點瓊脂糖均為美國Amresco公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)L-02細(xì)胞(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)，24h后，將細(xì)胞分為4組：空白對照組(加入等體積的無血清培養(yǎng)基)；INH組(10mmol/L INH)；槲皮素低劑量組(10mmol/L INH+25μmol/L槲皮素)；槲皮素高劑量組(10mmol/L INH+50μmol/L槲皮素)。各組細(xì)胞分別經(jīng)上述處理24h后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3 彗星試驗檢測L-02細(xì)胞DNA損傷

L-02細(xì)胞用胰酶消化并制成單細(xì)胞懸液，密度為5×104/mL。將100μL正常熔點瓊脂(0.5%)鋪在磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片，4℃放置10min凝固后為第1層膠。取下蓋玻片，吸取80μL含約104個細(xì)胞的低熔點瓊脂(0.75%)鋪在第1層膠上，蓋上蓋玻片，4℃放置10min凝固后為第2層膠；在第2層膠上滴加80μL 0.75%低熔點瓊脂糖溶液，蓋好蓋玻片，4℃放置10min凝固后為第3層膠。揭去蓋玻片，將玻片浸入新配的堿性細(xì)胞裂解液中，4℃裂解1.5h。裂解后用PBS洗3次，將玻片置于新配的堿性電泳液中4℃解旋20min后，在25 V、300mA下避光電泳25min。取出玻片用Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)中和15min后，加50μL碘化丙啶(PI)染色，蓋上蓋玻片，15min后于熒光顯微鏡下觀察。計數(shù)觀察的細(xì)胞，每片隨機(jī)觀察100個細(xì)胞，采集到的圖像用CASP彗星圖像軟件進(jìn)行分析，分析指標(biāo)有彗星尾部DNA百分含量(tail DNA，%)、尾長(tail length)和尾矩(tailm oment)。

1.4 差速離心法制備L-02細(xì)胞線粒體

將L-02細(xì)胞用胰酶消化并制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為5×105/mL。將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h后，按上述分組處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后將細(xì)胞消化吹打成單細(xì)胞懸液，離心去上清。加含250mmo1/L 蔗糖的細(xì)胞裂解液3mL，吹打均勻后于4℃、6 000 r/min離心10min，取上清再于4℃、13 500 r/min離心10min，所得沉淀即為線粒體。

1.5 熒光探針DCFH-DA檢測L-02細(xì)胞內(nèi)ROS水平

將上述各組細(xì)胞線粒體用HEPES緩沖液重懸，制成線粒體懸液，加入DCFH-DA，使其終濃度為2μg/mL，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育20min。吸去培養(yǎng)液，用冷PBS洗3遍，并棄去殘液，以去除非特異性熒光，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度并拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，并計算平均熒光強(qiáng)度。

1.6 Rh123檢測L-02細(xì)胞線粒體膜電位

將上述各組細(xì)胞線粒體用HEPES緩沖液重懸，制成線粒體懸液，加入Rh123染色液，使其終濃度為5mg/L，于培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20min；冷PBS洗3遍去除非特異性熒光后，用激光共聚焦測定激發(fā)波長488 nm下的熒光強(qiáng)度值，并拍照。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，并計算平均熒光強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 INH和槲皮素對L-02細(xì)胞DNA損傷的影響

彗星試驗結(jié)果見圖1。INH和槲皮素處理細(xì)胞24h后，空白對照組細(xì)胞的DNA大部分呈圓形熒光團(tuán)，無拖尾現(xiàn)象；INH組細(xì)胞DNA有拖尾現(xiàn)象，呈現(xiàn)不同程度的頭尾分明的典型彗星圖像；槲皮素組細(xì)胞DNA拖尾現(xiàn)象明顯減輕，高劑量槲皮素組的效果更明顯。應(yīng)用CASP彗星分析軟件進(jìn)行圖像分析，結(jié)果見表1，與空白對照組相比，INH組細(xì)胞尾部DNA百分含量、尾長和尾矩均顯著增加(P<0.01)，表明INH誘導(dǎo)了細(xì)胞DNA損傷；低和高劑量槲皮素組細(xì)胞的尾部DNA百分含量、尾長和尾矩均較INH組明顯減少(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素對L-02細(xì)胞DNA損傷有保護(hù)作用，且高劑量組的保護(hù)作用更顯著。

圖1 彗星試驗檢測L-02細(xì)胞DNA損傷(×200)

表1 INH和槲皮素對L-02細(xì)胞尾部DNA百分含量、尾長和尾矩的影響

2.2 INH和槲皮素對L-02細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

熒光探針DCFH-DA檢測結(jié)果見圖2。與空白對照組相比，INH處理24h后，細(xì)胞線粒體ROS水平顯著升高(P<0.01)，表明INH可誘導(dǎo)線粒體ROS的生成；與INH組相比，低和高劑量槲皮素組細(xì)胞線粒體ROS水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素可抑制細(xì)胞線粒體ROS的生成，高劑量組抑制細(xì)胞線粒體ROS生成的作用更顯著，且高劑量組ROS水平與空白對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 L-02細(xì)胞ROS水平

圖3 L-02細(xì)胞線粒體膜電位

2.3 INH和槲皮素對L-02細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Rh123檢測結(jié)果見圖3。INH處理L-02細(xì)胞24h后，與空白對照組相比，細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)，表明INH可造成線粒體損傷；低和高劑量槲皮素組細(xì)胞線粒體膜電位均明顯增高，與INH組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素對線粒體有保護(hù)作用，高劑量組對線粒體的保護(hù)作用更明顯，且高劑量組線粒體膜電位與空白對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

研究表明INH在體內(nèi)和體外均可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷[9-10]，而且Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與槲皮素具有保護(hù)氧化應(yīng)激損傷作用有關(guān)；李堅等[12]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對內(nèi)毒素性心肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制也與槲皮素具有抗氧化作用相關(guān)。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要場所，也是多數(shù)有毒化合物攻擊的主要靶點[13-14]。研究表明，ROS過多生成可損傷線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位降低[15]。因此，本實驗以人肝細(xì)胞L-02為研究對象，從細(xì)胞DNA氧化損傷角度研究INH細(xì)胞毒性，重點探討ROS介導(dǎo)的線粒體損傷在INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA氧化損傷中的作用，以及槲皮素對INH所致細(xì)胞DNA氧化損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。我們利用彗星試驗檢測了細(xì)胞DNA損傷情況，實驗結(jié)果顯示，INH能顯著增加細(xì)胞尾部DNA百分含量、尾長和尾矩，表明INH誘導(dǎo)了L-02細(xì)胞DNA損傷。Shayakhmetova等[16]研究也發(fā)現(xiàn)INH可誘導(dǎo)雄性大鼠睪丸細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加、谷胱甘肽含量降低、DNA損傷等。Barcelos等[17-18]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對甲基汞誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞DNA損傷和人源性肝細(xì)胞的DNA損傷均有保護(hù)作用。本實驗中我們還發(fā)現(xiàn)槲皮素能顯著減少細(xì)胞尾部DNA百分含量、尾長和尾矩，表明槲皮素對L-02細(xì)胞DNA損傷有保護(hù)作用，這與Barcelos等的研究結(jié)果一致。Bournival 等[19]研究也發(fā)現(xiàn)槲皮素對高糖誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的DNA氧化損傷和凋亡有保護(hù)作用。

那么對于INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷是否與ROS誘導(dǎo)的線粒體損傷有關(guān)這一問題，本實驗檢測了線粒體ROS水平及線粒體膜電位。ROS是細(xì)胞內(nèi)主要的氧自由基，它的水平能反映細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)的情況；線粒體膜電位是反映線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)，線粒體膜電位降低，提示細(xì)胞發(fā)生線粒體損傷[20]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，線粒體ROS生成顯著增多，線粒體膜電位明顯降低；提示INH能促進(jìn)細(xì)胞線粒體ROS生成，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體損傷，引起線粒體膜電位降低。Hassan等[21]研究發(fā)現(xiàn)INH可引起大鼠肝細(xì)胞ROS生成增多，誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肝損傷，本文的研究結(jié)果與Hassan等[21]的研究結(jié)果一致。大量研究表明，槲皮素在體外可通過清除氧自由基、抑制DNA損傷、與金屬離子結(jié)合等發(fā)揮抗氧化作用[22-27]。除此之外，體內(nèi)實驗證實槲皮素可通過降低脂質(zhì)過氧化物水平、增加抗氧化物含量及提高抗氧化酶活性對肝臟氧化損傷發(fā)揮保護(hù)作用[28]。本研究中，我們的實驗結(jié)果顯示，槲皮素能明顯降低細(xì)胞線粒體ROS水平，表明槲皮素可減少細(xì)胞線粒體ROS的生成，并且槲皮素能明顯提高細(xì)胞線粒體膜電位，表明槲皮素對線粒體膜有保護(hù)作用，提示槲皮素對INH誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體損傷具有保護(hù)作用。本文的研究結(jié)果與Tang等[29]研究表明槲皮素對乙醇誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷具有保護(hù)作用結(jié)果相似。張佳君等[30]研究也發(fā)現(xiàn)槲皮素對H2O2誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，可能是槲皮素通過改善抗氧化酶活性、增強(qiáng)ROS清除能力從而發(fā)揮其對細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)合本實驗中發(fā)現(xiàn)槲皮素對INH誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞DNA損傷有保護(hù)效應(yīng)，推測其可能是通過清除線粒體ROS，抑制線粒體損傷，從而發(fā)揮保護(hù)L-02細(xì)胞DNA損傷的作用。提示，ROS介導(dǎo)的線粒體損傷是槲皮素對INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的主要機(jī)制之一。

綜上所述，在本實驗條件下，INH能誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷，可能是通過大量生成的ROS造成線粒體損傷，使線粒體膜電位降低，導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，提示ROS介導(dǎo)的線粒體損傷在INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷的過程中發(fā)揮了重要作用；槲皮素對INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷具有保護(hù)效應(yīng)，可能與其抑制ROS介導(dǎo)的線粒體損傷有關(guān)。

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The role of reactive oxygen speciesin isoniazid-induced DNA damage in L-02 cells and the protective effectof quercetin

CHEN Tingyu，SUN Jie，YANG Yu，ZHU Qiushuang，MIAO Zhi，ZHONG Tangwu，LU Chunfeng*
(Basicmedical College, Jiamusi University, Jiamusi 154007,heilongjiang, China)

目的： 探討活性氧(ROS)在異煙肼(INH)誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞DNA損傷中的作用及槲皮素的保護(hù)效應(yīng)。方法：將L-02細(xì)胞分為空白對照組、INH組(10mmol/L INH)；槲皮素低劑量組(10mmol/L INH+25μmol/L槲皮素)；槲皮素高劑量組(10mmol/L INH+50μmol/L槲皮素)。細(xì)胞處理24h后，采用彗星試驗檢測細(xì)胞DNA損傷情況；分別應(yīng)用熒光探針DCFH-DA和Rhodamine123檢測細(xì)胞ROS水平及線粒體膜電位。結(jié)果：與空白對照組比較，L-02細(xì)胞經(jīng)INH和槲皮素處理后，INH組細(xì)胞尾部DNA百分含量、尾長和尾矩均顯著增加(P<0.01)；與INH組相比，低和高劑量槲皮素組細(xì)胞的尾部DNA百分含量、尾長和尾矩均明顯減少(P<0.05或P<0.01)。INH組細(xì)胞線粒體ROS水平比空白對照組顯著升高(P<0.01)；而低和高劑量槲皮素組細(xì)胞線粒體ROS水平比INH組明顯降低(P<0.05或P<0.01)。INH組細(xì)胞線粒體膜電位顯著低于空白對照組(P<0.01)，而低和高劑量槲皮素組細(xì)胞線粒體膜電位明顯高于INH組(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：INH能誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷，ROS介導(dǎo)的線粒體損傷在INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷的過程中發(fā)揮了重要作用；槲皮素對INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞DNA損傷具有保護(hù)效應(yīng)，可能與其抑制ROS介導(dǎo)的線粒體損傷有關(guān)。

活性氧；異煙肼；槲皮素；DNA損傷

OBJECTIVE:To investigate the role of reactive oxygen species (ROS) in isoniazid (INH)-induced DNA damage in L-02 cells and the protection by quercetin.METHODS：L-02 cells were divided into several groups：blank control，INH (10mmol/L)，quercetin low dose (10mmol/L INH +25μmol/L quercetin) andhigh dose (10mmol/L INH +50μmol/L quercetin).After cells were treated for 24hours，DNA damage was detected by using the Comet test；ROS generation andmitochondrialmembrane potential were evaluated by applicationof fluorescent probes DCFHDA and Rhodamine123.RESULTS：Compared with the blank control group，the percentages of tail DNA，tail length and tailmoment (from the Cometassay) of the INH group were significantly increased (P<0.01).Compared with the INH group，the percentages of tail DNA，tail length and tailmomentof the lowandhigh dose quercetin groups were significantly reduced (P<0.05 and P<0.01，respectively).The levels ofmitochondrial ROsin cells of the INH group were significantly increased over the blank control group (P<0.01)；the levels ofmitochondrial ROsin the lowandhigh dose quercetin groups were significantly decreased than thatof the INH group (P<0.05 and P<0.01，respectively).Themitochondrialmembrane potential of the INH group was significantly lower than thatof the blank control group (P<0.01).Themitochondrialmembrane potential of the lowandhigh dose quercetin groups were significantlyhigher than thatof the INH group (P<0.05 and P<0.01，respectively).CONCLUSION：INH can induce DNA damage in the L-02 cells and the damagemay involve ROS-mediatedmitochondrial damage.Quercetinhas a protective effectagainst the INH-inductionof DNA damage and the effectmay be related to itsinhibitionof ROS-mediatedmitochondrial damage.

reactive oxygen species；isoniazid；quercetin；DNA damage

R965；R332

A

1004-616X(2016)06-0472-05

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.012

2016-08-28；

2016-10-14

國家自然科學(xué)基金資助項目(81373497)

作者信息： 陳廷玉，E-mail：chenty123@163.com。*通信作者，盧春鳳，E-mail：luchunfengchen@126.com