徐 羽，張曉紅*，班媛媛，馮 琴，張 雪，常喜玲，高啟超

（太原師范學(xué)院生物系，山西 太原 030031）

毒死蜱對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響

徐 羽，張曉紅*，班媛媛，馮 琴，張 雪，常喜玲，高啟超

（太原師范學(xué)院生物系，山西 太原 030031）

毒死蜱(chlorpyrifos，CPF)是世界衛(wèi)生組織唯一許可的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，由于其高效、廣譜、低毒等突出優(yōu)點(diǎn)，為我國(guó)禁用高毒有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides，OPs)，如對(duì)硫磷(parathion)、甲胺磷等(methamidophos)的替代品之一，具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，可防治100多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，為是我國(guó)目前應(yīng)用最為廣泛的5種殺蟲(chóng)劑之一，也是農(nóng)副產(chǎn)品中經(jīng)常檢測(cè)出的主要?dú)埩艮r(nóng)藥和超標(biāo)農(nóng)藥[1]。據(jù)報(bào)道，歐盟使用CPF每年增加50 t，美國(guó)年使用量達(dá)1萬(wàn) t，中國(guó)2011年CPF銷量達(dá)3.4×104t[2]，2013年達(dá)4.76×104t[3]。

中國(guó)蔬菜CPF農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)為1mg/kg[4]，國(guó)際上為0.02mg/kg，歐盟2016年2月修定為0.01mg/kg。CPF在環(huán)境中不易水解，多以低濃度形式長(zhǎng)期存在于自然環(huán)境中[5]。殘留在露地青菜上的CPF降解半衰期為3.93 d[1]，白菜中為1.650～1.824 d[6]，獼猴桃果實(shí)中為3.37 d[7]，土壤中為25.48 d[8]。

CPF在土壤中有較強(qiáng)的吸附能力，其殘留極易造成水體、大氣、土壤以及動(dòng)植物的污染，甚至?xí)ㄟ^(guò)生物富集對(duì)人類健康構(gòu)成很大的威脅[9-11]，CPF對(duì)人類的潛在毒性已引起廣泛關(guān)注。體質(zhì)量的改變反映動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)熱量的攝入、活動(dòng)狀態(tài)、血糖水平、體內(nèi)激素變化。研究表明，低濃度CPF類似于環(huán)境激素，對(duì)生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，可使大鼠體質(zhì)量增加[12]；體質(zhì)量改變同時(shí)反映動(dòng)物新陳代謝水平，CPF可通過(guò)抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的乙酰膽堿酯酶活性，進(jìn)而阻止神經(jīng)傳導(dǎo)最終導(dǎo)致動(dòng)物的死亡[11-12]，使小鼠腦部還原型谷胱甘肽水平降低，而氧化型谷胱甘肽水平升高[13]，H O、NO和NO的水平顯著增加[14]，對(duì)細(xì)胞、神經(jīng)軸突產(chǎn)生影響，甚至引起行為改變，進(jìn)而對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)生命周期短、易于飼養(yǎng)、繁殖快、繁殖量大，其代謝系統(tǒng)、生理功能、生長(zhǎng)發(fā)育等與哺乳動(dòng)物基本相似，是經(jīng)典遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)理想的研究材料和重要的哺乳動(dòng)物替代研究模式生物之一。用果蠅作材料檢測(cè)環(huán)境物質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)是一項(xiàng)簡(jiǎn)易快速的試驗(yàn)技術(shù)[15-17]。血糖水平、生長(zhǎng)素為導(dǎo)致動(dòng)物體質(zhì)量變化的主要因素，本研究通過(guò)觀察不同濃度CPF對(duì)雌雄果蠅體質(zhì)量的影響，探索CPF對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的影響，從而為CPF使動(dòng)物各種生化指標(biāo)變化的研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

果蠅為野生型黑腹果蠅，由太原師范學(xué)院遺傳實(shí)驗(yàn)室提供。CPF，濃度為90%的原藥，購(gòu)自揚(yáng)州某化學(xué)公司。

1.2 方法

1.2.1 半數(shù)致死濃度測(cè)定 實(shí)驗(yàn)設(shè)置含CPF濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mg/L的7組培養(yǎng)基，用其染毒果蠅成蟲(chóng)，每濃度設(shè)置6個(gè)培養(yǎng)管，每個(gè)培養(yǎng)管接入5～8h內(nèi)羽化果蠅5只(雌雄各3個(gè)培養(yǎng)管)，染毒96h。以平均數(shù)法[18]和SPSS 18.0軟件中的Probitanalyze[5]，計(jì)算毒死蜱染毒96h對(duì)果蠅成蟲(chóng)的半數(shù)致死濃度(median lethal concentration，LC50)。

1.2.2 染毒 根據(jù)上述所得CPF對(duì)果蠅成蟲(chóng)染毒96h的LC50(0.656mg/L)，設(shè)置含CPF濃度分別為0.04、0.08、0.16、0.32mg/L的4個(gè)染毒組及0.65%生理鹽水對(duì)照組培養(yǎng)基。收集5～8h內(nèi)羽化果蠅[10]，乙醚輕度麻醉(果蠅翅膀外展45°，說(shuō)明死亡)[11]，雌雄分開(kāi)，隨機(jī)分組，每濃度設(shè)置6個(gè)培養(yǎng)管，每個(gè)培養(yǎng)管接入5～8h內(nèi)羽化果蠅10只(雌雄各3個(gè)培養(yǎng)管)，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)，分別進(jìn)行24、48、72、96h染毒。每天觀察果蠅生長(zhǎng)情況，定時(shí)乙醚(或冷凍)輕度麻醉果蠅，試管收集，天平稱取各濃度組果蠅體質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以SPSS 18.0軟件采用one-way ANOVA進(jìn)行濃度組與對(duì)照組間的差異性，同一時(shí)間不同濃度組間的差異性以及同一濃度不同時(shí)間組別間的差異性分析，并用Duncanmultiple Range test進(jìn)行校正。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 CPF對(duì)果蠅的LC50

CPF染毒96h后果蠅死亡數(shù)見(jiàn)表1，平均數(shù)法[18]和Probit回歸法[5]分析果蠅死亡數(shù)，并計(jì)算CPF對(duì)雌、雄果蠅染毒96h半數(shù)致死濃度(LC50)的95%置信限。毒死蜱對(duì)雌性果蠅的LC50為0.447mg/L，對(duì)雄性果蠅的LC50為0.858mg/L，雌雄果蠅兩者合并測(cè)得的LC50為0.656mg/L。

表1 毒死蜱對(duì)果蠅的半數(shù)致死濃度

2.2 CPF對(duì)雌果蠅體質(zhì)量的影響

羽化后雌果蠅72h內(nèi)體質(zhì)量增加0.01mg/d， 72～96h體質(zhì)量增加0.03mg(圖1、表2)。CPF 0.04～0.32mg/L 濃度組在染毒24～96h時(shí)，雌果蠅體質(zhì)量減少0.01～0.03mg/d。相同染毒濃度不同時(shí)間組間，以及相同染毒時(shí)間不同濃度組間比較，體質(zhì)量變化無(wú)顯著差異，與對(duì)照組相比差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 CPF對(duì)雌果蠅體質(zhì)量的影響(n=3×10)

表2 各組雌果蠅體質(zhì)量變化

2.3 CPF對(duì)雄果蠅體質(zhì)量的影響

羽化后雄果蠅72h內(nèi)體質(zhì)量增加0.01mg/d， 72～96h體質(zhì)量增加0.02mg(圖2、表3)。CPF 0.04～0.32mg/L 濃度組在染毒24～96h時(shí)，雄果蠅體質(zhì)量減少0.01、0.03mg/d。0.04～0.32mg/L各濃度組隨染毒時(shí)間增加體質(zhì)量變化與對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。0.08mg/L染毒96h和對(duì)照組比較體質(zhì)量減少(P<0.05)。在染毒72h時(shí)0.08、0.16mg/L濃度組，染毒96h 時(shí)0.04～0.32mg/L濃度組的體質(zhì)量比對(duì)照組減少(P< 0.05)。除此外，相同染毒濃度條件下不同時(shí)間組間，以及相同染毒時(shí)間條件下不同濃度組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

CPF染毒96h對(duì)果蠅的半數(shù)致死濃度為0.656mg/L (雌雄合并計(jì)算)，其1/6半數(shù)致死濃度接近于CPF國(guó)家限量殘留標(biāo)準(zhǔn)0.1mg/kg。CPF對(duì)雌果蠅的毒性(LC50為0.447mg/L)大于雄果蠅(LC50為0.858mg/L)。

對(duì)照組中，72h內(nèi)雌雄果蠅的體質(zhì)量勻速增加(圖1、2)，72h后雌果蠅體質(zhì)量增加加速，可能是因?yàn)榇乒売鸹筮M(jìn)入產(chǎn)卵高峰期，食量加大體質(zhì)量增長(zhǎng)加快，為雌果蠅交配產(chǎn)卵蓄積能量作準(zhǔn)備。

ab不同字母間表示不同濃度組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；cd不同字母間表示不同時(shí)間組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

表3 各組雄果蠅體質(zhì)量變化

各濃度CPF染毒不同時(shí)間對(duì)雌果蠅的體質(zhì)量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)雄果蠅存在顯著差異。0.04～0.16mg/L CPF使雄果蠅體質(zhì)量平均減重0.01mg/d。低濃度CPF類似于環(huán)境激素，抑制生物內(nèi)分泌系統(tǒng)生長(zhǎng)激素產(chǎn)生，干擾激素平衡[10]，影響雄果蠅生長(zhǎng)。唐文成等[5]的研究發(fā)現(xiàn)低濃度CPF顯著增加昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)和蛹的體質(zhì)量，特別是幼蟲(chóng)相對(duì)生長(zhǎng)率、食物利用率和食物轉(zhuǎn)化率，本文結(jié)果與之相反，可能CPF對(duì)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)作用效果存在差異。

0.32 mg/L CPF染毒 72h、0.04mg/L CPF染毒96h雄果蠅日減小量增加到0.03、0.04mg，CPF對(duì)雄果蠅體內(nèi)的毒性，隨濃度加大、時(shí)間延長(zhǎng)而加大，CPF對(duì)雄果蠅體質(zhì)量的影響存在劑量-效應(yīng)、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。這一研究結(jié)果與毒死蜱使魚(yú)的體長(zhǎng)和體質(zhì)量均隨濃度升高、時(shí)間延長(zhǎng)而逐步降低一致[19]。研究表明，高濃度、長(zhǎng)時(shí)間CPF會(huì)損傷昆蟲(chóng)消化道上皮細(xì)胞，抑制、破壞消化酶活性，降低對(duì)體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)、脂肪的代謝，從而影響其消化、吸收功能，降低食物的轉(zhuǎn)化效率，使其體質(zhì)量減輕[20]。長(zhǎng)期使用CPF可對(duì)細(xì)胞、神經(jīng)軸突產(chǎn)生影響，可擾亂果蠅的取食行為，甚至引起其行為改變進(jìn)而對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[13]。

CPF染毒對(duì)雌果蠅體質(zhì)量的影響大于雄果蠅，說(shuō)明CPF對(duì)雌果蠅的毒性大于雄果蠅。這與雌果蠅半數(shù)

致死濃度小于雄果蠅結(jié)果一致。

染毒24～72h時(shí)0.04mg/L CPF使雄果蠅體質(zhì)量大幅下降(0.04～0.06mg)，0.04mg/L CPF染毒96h雄果蠅體質(zhì)量顯著下降(0.04mg)，而在0.16mg/L雄果蠅體質(zhì)量升高，說(shuō)明0.16mg/L為雄果蠅對(duì)CPF濃度的耐受濃度，染毒72、96h時(shí)隨濃度增加體質(zhì)量先下降后增加。表明雄果蠅體質(zhì)量改變與體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育生理生化指標(biāo)密切相關(guān)。不同濃度使雄果蠅體內(nèi)發(fā)生的生理生化應(yīng)激變化不同，從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育。

綜上，CPF對(duì)雌果蠅的毒性大于雄果蠅。雄果蠅體質(zhì)量的變化存在劑量-效應(yīng)，時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。雄果蠅對(duì)低濃度0.04mg/L(LC50的1/20)CPF極為敏感。雄果蠅對(duì)CPF的耐受點(diǎn)為0.16mg/L。CPF使雄果蠅體質(zhì)量的增減，反映CPF對(duì)雄果蠅生長(zhǎng)發(fā)育相應(yīng)的生理生化指標(biāo)產(chǎn)生影響。此研究結(jié)果將為果蠅作為CPF農(nóng)殘檢測(cè)指示昆蟲(chóng)，CPF農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)以及CPF的使用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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The effectof Chlorpyrifos on the growth of Drosophilamelanogaster

XU Yu，ZHANG Xiaohong*，BAN Yuanyuan，F(xiàn)ENG Qin，ZHANG Xue，CHANG Xiling，GAO Qichao
(Departmentof Biology, Taiyuan Normal University, Taiyuan 030031, Shanxi, China)

目的： 研究毒死蜱(CPF)對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響。方法：設(shè)定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和4.0mg/L共7個(gè)CPF濃度梯度對(duì)果蠅進(jìn)行急性染毒，統(tǒng)計(jì)每組果蠅96h死亡數(shù)，Probit法計(jì)算毒死蜱染毒96h對(duì)果蠅的半數(shù)致死濃度(LC50)，依據(jù)LC50分別設(shè)置含毒死蜱0.04、0.08、0.16、0.32mg/L的培養(yǎng)基，用其染毒果蠅后，檢測(cè)雌、雄果蠅體質(zhì)量變化，各濃度組隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)雌雄果蠅體質(zhì)量日增減量及各染毒時(shí)間段隨濃度增加雌雄果蠅體質(zhì)量變化。結(jié)果：CPF對(duì)雌果蠅的毒性(LC50為0.447mg/L)大于雄果蠅(LC50為0.858mg/L)。CPF各濃度在染毒不同時(shí)間對(duì)雌果蠅的體質(zhì)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。0.04～0.32mg/L CPF使雄果蠅體質(zhì)量平均日減輕0.01mg/d，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，存在明顯時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。雄果蠅對(duì)低濃度0.04mg/L(LC50的1/20)CPF極為敏感，體質(zhì)量顯著下降(0.04～0.08mg)，雄果蠅在0.16mg/L濃度染毒時(shí)體質(zhì)量增加(0.02mg)，染毒72或96h時(shí)各濃度組體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，存在明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：CPF使雄性果蠅體質(zhì)量發(fā)生變化，反映CPF可對(duì)雄性果蠅生長(zhǎng)發(fā)育生理生化指標(biāo)產(chǎn)生相應(yīng)的影響。

毒死蜱；黑腹果蠅；半數(shù)致死濃度；體質(zhì)量；生長(zhǎng)發(fā)育

OBJECTIVE:To explore effectof the chlorpyrifosherbicide (CPF) on growth of Drosophilamelanogaster (D.melanogaster).METHODS：Analyzed themedian lethal dose (LC50) using Probitafter D.melanogaster were treated with 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 and 4.0mg/L of CPF for 96h.According to LC50，weightof D.melanogaster was evaluated after beingexposed to 0.04，0.08，0.16 and 0.32mg/L CPF concentration.The experimental data were analyzed by ANOVA test.RESULTS：The toxicity of CPF tofemale D.melanogaster (LC50is 0.447mg/L) was greater than that formale (LC50is 0.858mg/L).There was no statistical significance of the weight changesin female D.melanogaster with different concentrations of CPF at different treatment times (P>0.05). With 0.04～0.32mg/L CPF，male D.melanogasterhad reductionof 0.01mg on average per day which was significantly different compared with the control group (P<0.05 or P<0.01)，and showed clear time-dependent effects.In addition，their weights decreased significantly (ranging between 0.04-0.08mg) with the treatmentof 0.04mg/L (1/20 of LC50) CPF which showed thatmale D.melanogaster was extremely sensitive to the toxicity at the low concentration.The weightofmale D.melanogaster increased by 0.02mg at 0.16mg/L CPF and was significantly differentat 72h and 96h amongeach experiment group (P<0.05). And showed clear does-dependent effect.CONCLUSION：CPFhad significant impacton the growth ofmale D.melanogaster as reflected by their weight changes.

chlorpyrifos；Drosophilamelanogaster；median lethal dose；weight；growth

Q355

A

1004-616X(2016)06-0477-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.013

2016-03-07；

2016-11-03

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610119003)；山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201311031-3)；山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2016363)

作者信息： 徐 羽，E-mail：michelle.254@163.com。*通信作者，張曉紅，E-mail：zxhongwin@163.com