蔣新格 趙晨陽 樊 興 陳子龍 黨如意 陳 玲

(1.重慶醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院,重慶 400016)(2. 重慶醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院,重慶 400016)(3.重慶醫(yī)科大學實驗教學管理中心，重慶 400016)

我國是世界上最大的煙草生產(chǎn)國和消費國，吸煙是我國目前最突出的公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。隨著近年來空氣中的PM2.5等可吸入粉塵顆粒對人體呼吸道系統(tǒng)的影響越來越大，因此對于環(huán)境中煙霧的污染造成呼吸道系統(tǒng)疾病的研究成為目前學術探討的熱點[3-7]。煙霧染毒的方法作為研究各類疾病的重要手段，動物染毒實驗是否成功直接關系著實驗的成敗。隨著儀器技術的發(fā)展，現(xiàn)在市面上有染毒效果良好的染毒柜出售，但是染毒柜因為價格高，操作復雜等原因讓許多科研機構、學校等不能選擇。雖然除了染毒柜，目前也有許多其他的簡易染毒方式可以選擇，但是現(xiàn)有的染毒方法很多無法排除因缺氧，溫度等干擾因素對實驗動物存活率的影響，這樣會造成實驗動物意外死亡率增高，實驗數(shù)據(jù)喪失，減弱了實驗的說服力。因此研究一種新式簡易的煙霧染毒方法是開展研究煙霧導致相關疾病實驗室的亟需解決的關鍵問題。

為了解決這一問題，本文在原有的染毒方法基礎上，設計了一個新型的箱狀實驗裝置。使用壓縮空氣泵向箱體內注入氧氣，通過控制氧氣的吸入及排出，使得實驗裝置更加穩(wěn)定。為今后能設計出方便控制氧氣流入，提高實驗數(shù)據(jù)的準確性的簡易染毒裝置提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

實驗動物選用SPF級雌性昆明系小鼠160只，體質量20～22 g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可編號：SCXK(渝)2017-0001。主要試劑為五牛牌香煙。

1.2 染毒裝置的組成

本裝置用可封閉染毒箱為實驗進行場所，染毒箱左右兩側各開一孔，且對稱分布，兩孔為香煙燃燒煙霧進入的孔道。染毒箱底部正中開一孔，為壓縮空氣泵通空氣入口。點燃香煙由兩孔送入煙霧，因兩側通入煙霧量相同，兩孔對稱分布且染毒箱封閉性好，可保證染毒箱里煙霧濃度恒定。底部孔用壓縮空氣泵連接長管通入空氣。簡易裝置如圖1所示。

圖1 改良煙霧染毒箱示意圖Fig.1 The schematic diagram of improved smoke poison box

1.3 方法

1.3.1分組及染毒： 動物適應性喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為對照組40只小鼠(雌雄各半)。染毒1組小鼠60只(雌雄各半)分籠置于染毒箱內，采用呼吸道靜式染毒。染毒2組小鼠60只(雌雄各半)分籠置于改良后的染毒箱內，采用呼吸道靜式染毒，同時開啟壓縮氣泵通過底部管道運送空氣入染毒箱內。實驗共進行1個月，每日染毒1次，每次進行2 h，每日染毒給藥分7次，每次點燃2支香煙，香煙燃盡后再補充同樣劑量的兩支香煙于左右兩煙霧孔，疊加后總用量為14支。點燃香煙置于染毒箱上兩孔。對照組小鼠每日相同時間被放置于染毒箱內，但未進行染毒。實驗期間觀察實驗動物的情緒狀態(tài)。

1.3.2標本采集及處理：實驗過程中記錄小鼠死亡及生命體征異常現(xiàn)象。在實驗結束后，用斷頸法處理剩余小鼠。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 一般情況比較

對照組小鼠生命體征正常，精神狀態(tài)良好，活動敏捷，體質量增加明顯；染毒組小鼠精神狀態(tài)較差，倦怠懶動，出現(xiàn)不同程度的飲食飲水量減少，其中染毒1組出現(xiàn)不良反應更為明顯。染毒期間可見染毒箱內溫度隨染毒時間的增加而有輕微的升高。

2.2 各組實驗動物存活情況

在相同時間里，經(jīng)過不同的染毒方式，小鼠均有不同程度的死亡。在染毒30 d后，染毒1組小鼠死亡數(shù)15只，染毒2組雄鼠死亡數(shù)為6只。染毒1組小鼠存活率顯著低于染毒2組小鼠，小鼠存活率差異具有統(tǒng)計學意義(x2=7.647P=0.02<0.05),見表1。

表1 各組實驗動物存活情況Table 1 The survivle rate of the experimental animals

2.3 各染毒小組染毒過程中染毒箱氧氣濃度變化

在實驗進行的第1、6、12、18、24、30天時，分別對染毒1組和染毒2組在每次染毒結束前對其染毒箱內氧濃度含量百分比進行測量，測量結果見表2。染毒1組的箱內平均氧濃度含量百分比為(16.03±1.03)%，染毒2組箱內平均氧濃度含量百分比為(18.68+0.31)%，染毒1組裝置內的氧濃度含量明顯低于染毒2組氧濃度，且染毒2組裝置內的氧濃度含量波動小，差異具有統(tǒng)計學意義(F=5.260，P=0.045<0.05)。

表2 各組染毒箱內氧濃度含量百分比Table 2 Percentage of oxygen concentration in each infected box

2.4 總懸浮顆粒物(TSP)濃度

每日染毒時，分7次燃煙，每次點燃2支，且在每次染毒結束后用粉塵采樣器測量各組染毒箱內TSP濃度，進行結果的對比見表3。結果顯示染毒1組和染毒2組裝置內的TSP濃度差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明改進的煙霧染毒裝置不影響毒物的劑量和染毒過程。

表3 染毒各組染毒箱TSP濃度對比Table 3 Comparision of TSP concentration in each infected group

3 討論

目前對于進行簡易煙霧吸入性損傷動物模型的研究大部分是將煙霧直接釋放到相對封閉的染毒箱內[8]，無法避免實驗過程中動物非實驗效果死亡，比如缺氧、溫度過高等不利因素影響。市面上雖然有販賣的染毒柜，但是價格昂貴，操作復雜，對技術要求高，工作量較大[9]。楊永國等[10]在運用靜式染毒法對正己烷吸入致大鼠肺和肝腎損害的研究中進行了相關實驗探究，因防止毒氣外溢使用封閉染毒箱，但封閉環(huán)境必然會導致在實驗過程中染毒箱中氧氣量下降，導致實驗動物呼吸受阻，最終可能使實驗動物非實驗效果死亡。何志義等[11]在研究香煙對小鼠C2C12成肌細胞分化的影響中采用簡易冷凝裝置收集香煙煙霧液體，再直接進行細胞培養(yǎng)，這種方法沒有能夠真實地模擬煙霧對實驗對象的影響，煙霧和煙霧液體兩種物理形態(tài)也可能會對實驗對象產(chǎn)生不同的實驗效果。因此，我們期望在簡易染毒箱的基礎上進行改良，使其成本低廉、制作簡單、配氣精確,可以重復使用,能夠滿足動式染毒實驗需求，使之既方便又能有效地達到實驗目的。

本研究發(fā)現(xiàn)，染毒1和染毒2組小鼠精神狀態(tài)均較差,倦怠懶動,甚至出現(xiàn)昏迷等不良反應，在染毒過程中出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而且研究發(fā)現(xiàn)染毒1組小鼠的不良反應更嚴重，且死亡率顯著高于染毒2組，又由于染毒1組氧濃度明顯低于染毒2組，因此可以推測缺氧是導致小鼠非實驗因素死亡的一個重要因素，本研究中隨著染毒時間的延長，染毒箱內的溫度有輕微的升高，因此也不排除動物死亡有可能是缺氧和溫度升高共同作用的結果。

簡易染毒裝置是在普通染毒箱的基礎上改進了對氧濃度的調控和溫度的監(jiān)測而實現(xiàn)的。實驗結果表明染毒1和染毒2組的裝置內的TSP濃度變化無明顯差異，避免了改良設備對染毒劑量本身的影響。在不改變煙霧濃度的情況下，極大地提高了實驗過程中實驗動物非藥理性的存活率，為實驗的繼續(xù)進行提供了可能。因此，改良后的簡易染毒箱具有較強的實驗可行性。

吸煙造成的煙霧和環(huán)境中的總懸浮顆粒，例如PM2.5等粉塵顆粒與呼吸系統(tǒng)多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，但至今對其致病機制仍不是很清楚[11]。近年來越來越多的學者開始關注煙霧引起疾病的機制研究[12-14]，同時目前很多大學生也在開展這個方面的自主創(chuàng)新實驗，成功地制作煙霧染毒動物模型是研究的關鍵一步，張素萍等人[15]在《香煙煙霧氣體體外染毒方法的建立》一文中提到國內已經(jīng)研制出TRANSWELL膜技術，可使細胞直接暴露于各種氣體環(huán)境進行染毒，但由于此技術還不成熟且價格昂貴，使許多欲使用者止步不前。本文改進制作的簡易染毒箱可以運用于煙霧染毒模型的構建，實驗成本低廉，實踐性極高。