李曉波 付 瑞 王 吉 王淑菁 王莎莎 李 威 秦 驍 黃宗文 賀爭鳴 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)

小鼠巨細(xì)胞病毒(Mouse Cytomegalovirus, MCMV)分類上屬皰疹病毒科，乙型皰疹病毒亞科，具有嚴(yán)格的種屬特異性，野生小鼠是該病毒的主要來源，主要通過動物親密接觸傳播，也可經(jīng)胎盤垂直傳播[1]。

自然感染小鼠多呈亞臨床過程，但病毒會潛伏在免疫功能健全動物體內(nèi)[2]，胎鼠或免疫缺陷動物感染會發(fā)生嚴(yán)重疾病[3]，如會改變小鼠呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的平衡，從而對細(xì)菌和病毒更加易感，更重要的是會抑制動物的免疫應(yīng)答，抑制抗體產(chǎn)生及Tc細(xì)胞的功能[4]。歐洲實驗動物聯(lián)合會(FELASA)、Charles river實驗室及Harlan實驗室等均已將MCMV列為實驗小鼠日常監(jiān)測項目[5]，早在八九十年代就有學(xué)者建議將MCMV作為SPF動物應(yīng)排除的病原體[6]，目前我國的實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)對MCMV的檢測沒有規(guī)定。本研究建立的MCMV特異的TaqMan探針實時熒光定量PCR(FQ-PCR)方法，具有高靈敏度和特異性的特點，為實驗小鼠MCMV日常監(jiān)測及動物源性生物制品中MCMV的檢測提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

FQ-PCR引物探針由ABI公司合成，TaqMan Universal PCR Master Mix為ABI產(chǎn)品；病毒核酸提取試劑盒購自Takara公司。

1.2 病毒株和樣品

小鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)smith株(103.75 TCID50/0.1 mL)，大鼠巨細(xì)胞病毒(RCMV)購自ATCC，編號VR-991；猴巨細(xì)胞病毒(SCMV)、人單純皰疹病毒sm44株(HSV)、偽狂犬病毒(PRV)及貓皰疹病毒I型(FHV-1)均為本室保存；2018年14家單位送檢的SPF級小鼠抗凝血樣品307份，清潔級小鼠抗凝血102份，具體見表1。

表1 臨床樣本信息Table 1 Clinical samples information

1.3 方法

1.3.1引物設(shè)計：選擇小鼠巨細(xì)胞病毒Smith株(Genbank：KY348373)DNA polymerase基因保守序列設(shè)計引物和探針，序列見表2。

表2 MCMV FQ-PCR引物探針信息Table 2 Primers and probes for MCMV FQ-PCR

1.3.2病毒核酸的提取：小鼠巨細(xì)胞病毒、大鼠巨細(xì)胞病毒、猴巨細(xì)胞病毒、人單純皰疹病毒sm44株、偽狂犬病毒及貓皰疹病毒I型，各取0.2 mL病毒液按試劑盒說明提取DNA，最后用150 μL滅菌水洗脫。

1.3.3質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備：由擎科生物合成MCMV(Genbank：KY348373)80691～80880 bp的DNA序列，轉(zhuǎn)入pClone007 Blunt Vector載體，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pClone007-MCMVp，經(jīng)測定其濃度為4.7×1010copies/μL。

1.3.4MCMV FQ-PCR擴增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：對引物、探針濃度、退火溫度等條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為：TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探針(10 μmol/L)0.2 μL，DNA模板1 μL，滅菌ddH2O補足至終體積20 μL。反應(yīng)程序為：50 ℃ 2min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，40個循環(huán)。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pClone007-MCMVp 10倍系列稀釋為109～100copies/μL，以其為模板，按上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行PCR擴增，每個稀釋度做3 個平行，選取線性較好的7 個稀釋度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5MCMV FQ-PCR方法的敏感性驗證：

1.3.5.1 以4.7×109～4.7×100copies/μL系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，用優(yōu)化好的反應(yīng)條件進行檢測，每個稀釋度做3個平行，驗證方法的敏感性。

1.3.5.2 與其他PCR方法敏感性比較：將步驟1.3.2提取的MCMV核酸10-1至10-8系列稀釋，使用本方法、文獻報道的常規(guī)PCR法、FQ-PCR方法分別檢測[7]，比較各方法的靈敏性。

1.3.6MCMV FQ-PCR方法特異性驗證：用建立的熒光定量PCR法檢測小鼠巨細(xì)胞病毒，大鼠巨細(xì)胞病毒，猴巨細(xì)胞病毒，人單純皰疹病毒，偽狂犬病毒及貓皰疹病毒I型等皰疹病毒科病毒的核酸，驗證方法的特異性。

1.3.7MCMV FQ-PCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性驗證：應(yīng)用優(yōu)化好的的反應(yīng)條件，以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(4.7×106，4.7×104和4.7×102copies/μL)為模板進行FQ-PCR擴增，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，同時選擇不同的3個時間點檢測，計算組內(nèi)和組間Ct值均值，標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。

1.3.8MCMV FQ-PCR方法的應(yīng)用

1.3.8.1 模擬感染樣本的檢測：MCMV病毒液(103.75 TCID50/0.1 mL)分別按10-1～10-8的比例摻入MCMV陰性小鼠抗凝血，模擬病毒感染樣品，每個稀釋度做3個平行，各取200 μL，按DNA提取試劑盒說明提取核酸，用MCMV FQ-PCR方法進行檢測。

1.3.8.2 臨床樣本的檢測：應(yīng)用建立的MCMV FQ-PCR方法檢測2018年14個實驗動物生產(chǎn)和使用單位送檢的小鼠抗凝血樣品，包括SPF級小鼠血清307份，清潔級小鼠102份(表1)。

2 結(jié)果

2.1 MCMV熒光定量PCR擴增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用優(yōu)化好的體系擴增108～102copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，各稀釋度擴增曲線間距均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線Slope為-3.418(在-3～-3.5之間)，R2值為0.999(>0.99)，擴增效率為96.137%(90%～105%之間)(圖1、2)。

圖1 MCMV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 MCMV FQ-PCR standard curve

圖2 MCMV熒光定量PCR方法擴增曲線Fig.2 MCMV FQ-PCR amplification curve

2.2 MCMV FQ-PCR方法的敏感性驗證

如圖3所示，4.7×109～4.7×101copies/μL各稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)S型擴增曲線，而4.7×100copies/μL的3個平行實驗有1個未出現(xiàn)S型擴增曲線，說明本方法最低可定量檢測到47copies/μL的樣品。用MCMV FQ-PCR方法和常規(guī)PCR方法檢測同樣的10-1至10-8系列稀釋的MCMV核酸樣品，由圖4可見，MCMV FQ-PCR方法最低可檢測到10-4稀釋度的MCMV核酸，常規(guī)PCR最低可檢測到10-2稀釋度，表明MCMV FQ-PCR方法敏感性比常規(guī)PCR方法高兩個數(shù)量級；用建立的MCMV FQ-PCR方法與文獻報道的FQ-PCR方法檢測相同的10-1至10-8系列稀釋的MCMV核酸樣品，每個稀釋度做3個平行，兩種方法檢測到的最大稀釋度均為10-4，但本方法每個稀釋度的Ct值均值均低于文獻方法(表3)，說明本方法的敏感性高于文獻方法。

圖3 MCMV熒光定量PCR方法敏感性驗證擴增曲線Fig.3 MCMV FQ-PCR sensitivity test amplification curve

圖4 MCMV熒光定量PCR方法(A)與常規(guī)PCR方法(B)敏感性比較注：M:100 bp DNA Marker；1～8：10-1至10-8系列稀釋的MCMV核酸；9：陰性對照Fig.4 Comparison of sensitivity between MCMV FQ-PCR (A) and conventional PCR (B)Note: M: 100 bp DNA Marker；1-8：10-1 to 10-8 serially diluted MCMV nucleic acids; 9：Negative control

表3 兩種熒光定量PCR方法敏感性比較Table 3 Comparison of sensitivity between two fluorescence quantitative PCR methods

2.3 方法的特異性驗證

圖5顯示，當(dāng)以MCMV為模板時，出現(xiàn)FAM熒光擴增曲線(Ct值為26，對應(yīng)濃度為7.71×104copies/μL)，以大鼠巨細(xì)胞病毒，猴巨細(xì)胞病毒，人單純皰疹病毒，偽狂犬病毒及貓皰疹病毒I型為模板均無明顯擴增曲線。表明所建立的熒光定量PCR法特異性強，與其他病毒均無交叉反應(yīng)。

圖5 MCMV熒光定量PCR方法特異性驗證擴增曲線注：1～7分別為MCMV、RCMV、SCMV、HSV、PRV、FHV-1、陰性對照Fig.5 MCMV FQ-PCR specificity test amplification curveNote: 1-7: MCMV、RCMV、SCMV、HSV、PRV、FHV-1 and negative control

2.4 MCMV FQ-PCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性驗證

用建立的FQ-PCR方法檢測4.7×106，4.7×104和4.7×102copies/μL三個濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，由表4可見其組內(nèi)變異系數(shù)為0.39%～0.68%，組間變異系數(shù)為0.48%～1.01%，方法的重復(fù)穩(wěn)定性良好。

2.5 MCMV FQ-PCR方法的應(yīng)用

用建立的MCMV FQ-PCR方法檢測摻入MCMV(103.75 TCID50/0.1 mL)病毒的小鼠抗凝血樣品，10-1～10-3稀釋度3個平行均為陽性，其Ct值均值分別為30.566、33.012、36.337，10-4稀釋度有2個平行出現(xiàn)擴增曲線，1個平行未出現(xiàn)，10-5～10-8稀釋度均為陰性，表明本方法可檢測到小鼠抗凝血樣品中MCMV的最大稀釋度為1∶1000，對應(yīng)病毒毒力為100.75 TCID50/0.1 mL(圖6)。檢測2018年送檢的307份SPF小鼠及102份清潔級小鼠抗凝血樣品，結(jié)果均為陰性。

3 討論

熒光定量PCR方法靈敏度高，耗時少，特異性強，目前已廣泛用于病原體的檢測[8-9]，本研究選取小鼠巨細(xì)胞病毒DNA polymerase基因保守序列設(shè)計引物和探針，建立了MCMV FQ-PCR檢測方法，各稀釋度擴增曲線間距均勻，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，Slope為-3.418，相關(guān)系數(shù)R2值為0.999，擴增效率為96.14%，說明本FQ-PCR方法可實現(xiàn)對MCMV的有效定量。MCMV FQ-PCR在以大鼠巨細(xì)胞病毒、猴巨細(xì)胞病毒等同類病毒及人單純皰疹病毒、偽狂犬病毒、貓皰疹病毒I型(FHV-1)等同科病毒為模板時均無擴增，說明方法的特異性良好；敏感性方面最低可檢測到47copies/μL的MCMV，比常規(guī)PCR方法的敏感性高兩個數(shù)量級，與已有的FQ-PCR法[7]相比各濃度的Ct值均低于后者，說明本方法的敏感性更高。選取各相差兩個數(shù)量級的3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒做方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性驗證，組內(nèi)變異系數(shù)小于1.0%，組間變異系數(shù)小于1.5%，表明本方法有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

MCMV感染小鼠后可分布在血液、唾液腺、肝、脾、肺等組織中[7，10]，本研究選取小鼠EDTA抗凝血作為檢測樣品，根據(jù)動物福利的“3R”原則，對方法進行應(yīng)用時本研究未進行動物感染實驗，而是檢測了模擬感染樣品，即將MCMV按10倍系列稀釋摻入小鼠抗凝血樣品進行檢測，結(jié)果10-1～10-3每個稀釋度的3個平行實驗均為陽性，說明本方法可有效檢測到動物血液樣品中的MCMV。不同品系小鼠對MCMV的易感性不同，其中BALB/c小鼠對MCMV較易感，而C56BL/6小鼠對MCMV有較強抵抗力[11-13]，研究人員對2018年北京地區(qū)14家單位送檢的409份小鼠血液樣品進行檢測，其中BALB/c小鼠占大多數(shù)，既有SPF級也有清潔級，結(jié)果均為陰性，表明現(xiàn)階段北京地區(qū)實驗小鼠中MCMV的控制情況良好，與前幾年報道的14.94%的感染率相比大幅下降[9]，原因可能在于實驗小鼠于2001年取消了普通級后，最低等級變?yōu)榍鍧嵓?，要求在屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，管理水平也相應(yīng)提高，杜絕了與野生鼠接觸的機會，因而感染率得到了有效控制。

鑒于MCMV傳播特點及對動物尤其是胎鼠的危害，且目前并未納入實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)，因而在實驗小鼠種群中仍存在爆發(fā)流行的風(fēng)險，對MCMV的日常監(jiān)控不容忽視。本研究建立的MCMV熒光定量PCR方法特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性好，并且有更高的檢測靈敏度，適用于實驗小鼠及鼠源性制品中MCMV的監(jiān)測，同時可為實驗動物相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定和補充提供技術(shù)參考。