武衛(wèi)國 范 濤 王 洪 王學(xué)文 劉佐民 柳全明

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

豚鼠原產(chǎn)于南美洲西北部，16世紀(jì)作為寵物由西班牙人帶入歐洲。20世紀(jì)20年代后期，英國培育的短毛豚鼠Dunkin-Hartley是最早用于實驗的品系?，F(xiàn)今，豚鼠已經(jīng)成為最常用的實驗動物之一，在生命科學(xué)、生物醫(yī)藥、獸醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著不可替代的作用[1]。

Hartley豚鼠屬封閉群品系，本單位所保持的Hartley豚鼠是1994年由日本引進，白化，清潔級(CL)，一直封閉繁育至今。近幾年，通過剖腹產(chǎn)凈化的方式對種群的微生物級別進行了提升，從清潔級上升至SPF級，并維持在屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，構(gòu)建了SPF級豚鼠核心種群，并逐步擴大生產(chǎn)。對于封閉群動物遺傳質(zhì)量控制，主要表現(xiàn)在保持其遺傳組成具有較高的雜合性，使個體間存在較大的遺傳性狀差異，同時所有基因的相對頻率保持穩(wěn)定。而在剖腹產(chǎn)凈化建立SPF種群時，用于剖腹產(chǎn)的豚鼠相對較少，改變了群體等位基因的頻率，對群體的遺傳特性造成重大改變。因此，重新建立一套清晰、明確的生物學(xué)背景數(shù)據(jù)作為各項實驗研究中的參照具有其必要性。

本研究通過對Hartley豚鼠核心群生長體質(zhì)量的監(jiān)測，以及血液樣本生理生化指標(biāo)的測定，進一步完善該封閉群豚鼠的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)與特性，為該群體遺傳質(zhì)量的維持以及日后的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1.1.1主要設(shè)備和耗材:電子秤(上海良平儀器儀表有限公司B10002，中國)；全自動血細胞分析儀(NIHON KOHDEN CelltacE MEK-7222，日本)；全自動生化分析儀(Olympus AU400，日本)；離心機(Eppendorf X22，德國)；0～100 μL微量移液器(Eppendorf，德國)；1.5 mL離心管(Axygen，美國)；1.5 mL EDTA-K2霧化抗凝管(國產(chǎn))；2 mL無菌注射器(上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司，中國)；血液生理生化檢測相關(guān)試劑由本單位實驗室提供。

1.1.2實驗動物:取Hartley豚鼠SPF級核心群中健康個體，50只，體質(zhì)量250～300 g，雌、雄各半，每個繁殖單元至少選擇1雄1雌，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所提供，許可證號：SCXK(京)2017-0013。豚鼠核心群飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，開放籠盒，環(huán)境參數(shù)：溫度22～26 ℃，相對濕度40%～70%，潔凈度7級，明暗交替12/12 h。飼養(yǎng)期間飼喂市售60Co輻照滅菌全價生長繁殖飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，高壓滅菌水(pH 7)。

1．2 實驗方法

1.2.1豚鼠稱質(zhì)量:電子秤使用前調(diào)至水平并用砝碼進行校準(zhǔn)。豚鼠出生當(dāng)日記為第0 d，剪耳標(biāo)號，逐日進行稱質(zhì)量并記錄，7 d后離乳，雌、雄分籠飼養(yǎng)(<350 g時10只/籠，≥350 g時5只/籠，籠盒尺寸：78 cm×48 cm×24 cm)，自由采食全價飼料及飲水，體質(zhì)量記錄至8周齡。

1.2.2豚鼠采血:250～300 g豚鼠通過心臟穿刺法采集血液，采血前禁食12 h，不禁水。一人抓取豚鼠保定，暴露胸口，另一人用2 mL注射器，觸摸胸口心搏最強處進針，緩慢抽取，采集1.5～2 mL血液。約1 mL血液注入霧化EDTA-2 K抗凝管中，充分顛倒混勻，用于血液生理指標(biāo)的測定；其余注入普通離心管，室溫20～25℃靜置2～3 h析出血清，3 000 r/min，離心10 min，吸取上清至新管，-20℃凍存，用于血液生化指標(biāo)的測定。

1.2.3血液生理生化指標(biāo)測定:用全自動血細胞分析儀對抗凝血液樣本進行逐一檢測，項目包括：白細胞計數(shù)(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞積壓(HCT)紅細胞體積(MCV)、血紅蛋白含量(MCH)、血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞分布寬度(RDW)、血小板計數(shù)(PLT)、血小板壓積(PCT)、血小板容積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、淋巴細胞計數(shù)(LYM)、單核細胞計數(shù)(MON)、中性粒細胞計數(shù)(NEUT)、嗜酸性粒細胞計數(shù)(EOS)、嗜堿性粒細胞計數(shù)(BAS)等；將各血清樣本室溫解凍，取300 μL置于生化管內(nèi)，放入全自動血液生化分析儀中進行檢測，項目包括：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、鈣(CA)、磷(P)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、總膽紅素(TBIL)等。

1．3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2．1 生長曲線測定結(jié)果

豚鼠0～8 周齡體質(zhì)量稱量結(jié)果見表1。根據(jù)體質(zhì)量變化數(shù)據(jù)，分別繪制雌、雄生長曲線，見圖1。

表1 Hartley豚鼠0～8周齡體質(zhì)量(g)Table 1 Body weight of Hartley guinea pigs between 0～8 weeks of age(g)

圖1 Hartley豚鼠0～8周齡生長曲線Fig.1 Growth curves of Hartley guinea pigs between 0～8 weeks of age

2．2 Hartley豚鼠血液生理測定結(jié)果

應(yīng)用全自動血細胞分析儀檢測出血液生理指標(biāo)見表2。Hartley豚鼠血常規(guī)指標(biāo)中，白細胞計數(shù)(WBC)、中性粒細胞計數(shù)(NEUT)、嗜酸性粒細胞計數(shù)(EOS)3項指標(biāo)，在雌性與雄性間有顯著性差異(P<0.05)。血小板壓積(PCT)、血小板容積(MPV)、淋巴細胞計數(shù)(LYM)、淋巴細胞百分比(LYM%)、中性粒細胞百分比(NEUT%)、嗜酸性粒細胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細胞百分比(BAS%)在雌、雄性別間表現(xiàn)為差異極顯著(P<0.01)，其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

表2 Hartley豚鼠血液生理指標(biāo)Table 2 Blood physiological indexes of Hartley guinea pigs

2．3 Hartley豚鼠血液生化測定結(jié)果

應(yīng)用全自動血液生化分析儀檢測13項生化指標(biāo)，見表3。生化常規(guī)指標(biāo)中，堿性磷酸酶(ALP)兩性別間有顯著性差異(P<0.05)，雄性顯著高于雌性。尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、膽固醇(CHO)3項指標(biāo)，兩性別間差異極顯著(P<0.01)，其中尿素氮、肌酐雄性極顯著高于雌性，而膽固醇水平雄性極顯著低于雌性。其他指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

表3 Hartley豚鼠血液生化指標(biāo)Table 3 Blood biochemical indexes of Hartley guinea pigs

2．4 SPF級與清潔級豚鼠各參數(shù)比較結(jié)果

根據(jù)2009年本單位所測得的清潔級Hartley豚鼠血液生理生化指標(biāo)[2]進行對比，結(jié)果見表4。通過11項血液生理指標(biāo)對比發(fā)現(xiàn)，在雄性SPF級與CL級豚鼠中除白細胞計數(shù)(WBC)差異不顯著(P>0.05)外，其他指標(biāo)均存在極顯著差異(P<0.01)；而雌性豚鼠中，紅細胞體積(MCV)與血小板計數(shù)(PLT)兩項指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)，其他指標(biāo)均存在極顯著的差異(P<0.01)。差異顯著的指標(biāo)中，紅細胞計數(shù)(RBC)、紅細胞分布寬度(RDW)、淋巴細胞百分比(LYM%)、血小板容積(MPV)等指標(biāo)SPF級豚鼠顯著低于清潔級。

表4 SPF級與清潔級Hartley豚鼠血液生理生化指標(biāo)比較Table 4 Comparison of hematological parameters between SPF and CL Hartley guinea pigs

在對9項血液生化指標(biāo)比較中，除兩種級別雄性豚鼠血鈣含量差異顯著(P<0.05)外，其他指標(biāo)在SPF級與清潔級豚鼠間存在極顯著差異(P<0.01)。差異極顯著的指標(biāo)中，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)等，SPF級豚鼠都顯著低于清潔級，其他指標(biāo)高于清潔級。

3 討論

血液生理生化指標(biāo)在臨床、實驗中有著重要意義，是實驗動物應(yīng)用中的重要基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)[3-7]。本實驗測定了Hartley豚鼠SPF級核心種群的生長曲線以及血液生理生化指標(biāo)，為該群的日后應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。該種群在作者所在單位已飼養(yǎng)傳代多年，并且通過剖腹產(chǎn)凈化將種群的微生物等級上升至SPF級，其血液生理生化指標(biāo)已發(fā)生了重大改變，通過與2009年的數(shù)據(jù)對比，11項血液生理指標(biāo)、9項血生化指標(biāo)都表現(xiàn)出極顯著差異。動物所處的環(huán)境，飼料、飲水種類以及飼養(yǎng)密度方式等均對血液生理生化值產(chǎn)生著影響。SPF級豚鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，溫度維持在20～26 ℃、相對濕度40%～70%，空氣潔凈度控制在萬級(7級)，所用籠具、飼料、飲水等物品均經(jīng)過高壓或輻照滅菌處理，同時，飼養(yǎng)人員在接觸動物前均要進行淋浴，更換滅菌服，因此，SPF級豚鼠接觸到外界抗原的幾率較普通級與清潔級動物大幅降低，致使其參與免疫反應(yīng)的淋巴細胞顯著減少，在血液生理指標(biāo)中SPF級豚鼠淋巴細胞數(shù)量與淋巴細胞百分比極顯著低于清潔級，這與張琨等[4]、鄺少松等[5]、張曉玉等[6]相關(guān)研究報道的結(jié)果相一致。

環(huán)境微生物的差異同時會導(dǎo)致腸道微生物菌群的改變，使得豚鼠對蛋白、糖類、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝發(fā)生變化[8-9]，進而影響血液生化中部分指標(biāo)在SPF級與清潔級豚鼠間存在顯著差異，比如堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)等。豚鼠屬草食性動物，對粗纖維消化能力強，同時，體內(nèi)缺乏左旋葡萄糖內(nèi)酯氧化酶而不能合成維生素C[10]。在GB 14924.5—2001中[11]，豚鼠生長繁殖與維持飼料中的粗纖維含量都要求在10%～15%，維持飼料中Vc含量≥1 500 mg/kg(繁殖料≥1 800 mg/kg)。保持全價飼料中粗纖維比例與Vc含量是飼養(yǎng)管理中關(guān)注的重點，同時也是維持SPF級豚鼠正常血液生理生化指標(biāo)的重要因素。

在相同環(huán)境下，SPF級豚鼠血液參數(shù)在性別之間也存在著差異，如血小板壓積(PCT)、血小板容積(MPV)兩項指標(biāo)，雌性豚鼠都極顯著低于雄性豚鼠；生化指標(biāo)中，堿性磷酸酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、膽固醇(CHO)在兩性別間也表現(xiàn)出顯著與極顯著差異，由此說明，實驗豚鼠的微生物級別、飼養(yǎng)環(huán)境、性別、周齡等都是其生理指標(biāo)的影響因素，可能會對實驗結(jié)果產(chǎn)生不同影響，在日后的應(yīng)用中應(yīng)有所選擇。

本豚鼠群是通過對清潔級豚鼠進行剖腹產(chǎn)凈化擴繁而來，剖腹產(chǎn)建群是由少數(shù)孕鼠中獲得后代，再經(jīng)過幾代形成一定規(guī)模，由于“奠基者”效應(yīng)的影響，使得新群體的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，產(chǎn)生遺傳性狀的漂移[12]。封閉群實驗動物繁育原則是盡量避免近交，同時維持該群體的遺傳穩(wěn)定性，然而在現(xiàn)有的繁育體系下，即使保持著足夠數(shù)量的群體有效含量以及較低近交上升速率，也無法阻止遺傳漂變的產(chǎn)生。因此，遺傳性狀的定期監(jiān)測更顯示出其必要性。群體各項生物學(xué)數(shù)據(jù)的正常值不僅僅是從當(dāng)前群體獲得，而是需要多年的數(shù)據(jù)積累，重新測定的基礎(chǔ)生物學(xué)數(shù)據(jù)有很多屬于遺傳力高的性狀，通過檢測，不僅了解了當(dāng)前群體的特性，同時有助于新建立群體的遺傳學(xué)質(zhì)量評價，為“二次優(yōu)選法”糾正遺傳漂變提供數(shù)據(jù)支持。