簡子海，戴抒豪，王雪菲，楊子杰，陸 強(qiáng)，楊正龍，阿吳英·哈得勒別克，尹立紅，劉 冉*

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

全氟辛烷磺酸和全氟辛酸對秀麗隱桿線蟲的生殖毒性

簡子海，戴抒豪，王雪菲，楊子杰，陸 強(qiáng)，楊正龍，阿吳英·哈得勒別克，尹立紅，劉 冉*

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

全氟羥基物質(zhì)是一類新型持久性有機(jī)環(huán)境污染物(persistentorganic pollutants，POPs)，在生物降解作用下，其在環(huán)境中不斷積累，并隨著食物鏈進(jìn)行生物放大作用[1]。在過去的幾十年，全氟羥基物質(zhì)被廣泛用

于工業(yè)生產(chǎn)和產(chǎn)品中，使其在水、植物、各種食物、動(dòng)物[2]等環(huán)境介質(zhì)中均有檢出。全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)和全氟辛酸(perfluorooctanoic acid，PFOA)是全氟羥基物質(zhì)中最具代表性的兩種物質(zhì)。PFOS和PFOA在工業(yè)和生活中的廣泛應(yīng)用造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，引起了全世界的關(guān)注。美國在2003-2004年調(diào)查[3]發(fā)現(xiàn)人體血清PFOS的濃度為：0.4～435μg/L，PFOA的濃度為：0.1～77.2μg/L。 2001年美國將PFOS列入環(huán)保署持久性有機(jī)污染物黑名單，2006年歐盟發(fā)布了《關(guān)于限制全氟辛烷磺酸銷售及使用的指令》，2009年5月，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署持續(xù)性有機(jī)污染物審查委員會(huì)將PFOS和PFOA列入了《斯德哥爾摩公約》附件B中。

研究表明PFOS與PFOA具有生殖毒性[3]。有報(bào)道稱高濃度的PFOS對精子完整性[4-5]和性激素結(jié)合球蛋白[6]水平有影響，同時(shí)有研究表明子宮內(nèi)暴露PFOA后影響子代精子質(zhì)量，但PFOS無影響[7]。PFOS和PFOA在工業(yè)上的大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，嚴(yán)重影響生態(tài)系統(tǒng)健康，威脅生物物種多樣性，運(yùn)用動(dòng)物模型來研究其毒性的方法已經(jīng)成為了一種趨勢。秀麗隱桿線蟲(以下簡稱線蟲)是一種常見的、自由生活的小型土壤線蟲，具有遺傳背景清楚、繁殖周期短、身體透明、能呈現(xiàn)出減數(shù)分裂過程中的各種變化，使其在生殖細(xì)胞的研究中具有很多與生俱來的優(yōu)勢[8]。通過多種暴露介質(zhì)(如土壤、水和淡水沉淀物等)，秀麗隱桿線蟲被用于大量的生態(tài)毒理學(xué)研究中，可以利用線蟲觀察多種不同的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(死亡率、生殖、行為等)[9]。Ruan等[10]通過線蟲暴露氯氰菊酯，結(jié)果顯示秀麗隱桿線蟲生殖和產(chǎn)卵能力降低、繁殖率減弱，提示線蟲生殖系統(tǒng)對外源性化學(xué)物具有一定敏感性。此外，秀麗隱桿線蟲還具有分化完整、結(jié)構(gòu)簡單的生殖系統(tǒng)和較哺乳動(dòng)物簡單的生殖發(fā)育過程，使其可以在相對簡單的生殖發(fā)育背景下開展相應(yīng)的生殖毒性研究。

因此，本研究應(yīng)用秀麗隱桿線蟲模型分析PFOS和PFOA對秀麗隱桿線蟲的后代數(shù)目和世代時(shí)間的影響，觀察秀麗隱桿線蟲生殖系統(tǒng)對PFOS和PFOA的敏感性，探討環(huán)境生物PFOS和PFOA暴露后生殖毒性的敏感指標(biāo)，從而為PFOS和PFOA的生態(tài)毒性以及環(huán)境監(jiān)測提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 秀麗隱桿線蟲蟲株

N2線蟲，購于秀麗隱桿線蟲遺傳中心(Caenorhabditis Genetic Center，CGC)。

1.2 主要試劑

瓊脂、多聚蛋白胨、膽固醇，購于Sigma-Aldrich公司；酵母提取物、胰蛋白胨，購于英國OXOID公司；全氟辛烷磺酸(PFOS，98%)、全氟辛酸(PFOA，96%)均為白色粉末，購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 PFOS和PFOA分別設(shè)置高、中、低3個(gè)劑量組，濃度依次為0.1、0.01、0.001mmol/L，用M9溶液配制，同時(shí)設(shè)置M9空白對照組。

1.3.2 L4期幼蟲染毒方法 每個(gè)劑量組分別吸取200 μL染毒液到24孔板中，輕微震動(dòng)24孔板使其均勻鋪開，將同步化后L4期的N2線蟲蟲液打到24孔板中，20℃恒溫培養(yǎng)箱中染毒24h，染毒結(jié)束后每個(gè)劑量組挑取10條線蟲，觀察其世代時(shí)間和后代數(shù)目。

1.3.3 L1期幼蟲染毒方法 每個(gè)劑量組分別吸取200 μL PFOS或PFOA染毒液到24孔板中，輕微震動(dòng)24孔板使其均勻鋪開，將同步化后L1的幼蟲蟲液打到已接種有OP50菌液的24孔板中，20℃恒溫培養(yǎng)箱中染毒48h，染毒結(jié)束后每個(gè)劑量組挑取10條線蟲，觀察其世代時(shí)間和后代數(shù)目。

1.3.4 后代數(shù)目(brood size)測定 染毒結(jié)束后，用挑針將蟲子分別挑入種菌的培養(yǎng)基中產(chǎn)卵，期間每隔36h轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)皿，并計(jì)數(shù)舊皿后代數(shù)目，直至停止產(chǎn)卵為止，統(tǒng)計(jì)每條線蟲發(fā)育為成蟲后產(chǎn)生的所有子代數(shù)目。

1.3.5 世代時(shí)間(generation time)測定 每個(gè)染毒劑量組統(tǒng)計(jì)10條線蟲后代數(shù)目，將染毒后的線蟲挑入已種菌的培養(yǎng)基表面，觀察并記錄線蟲成蟲產(chǎn)第1個(gè)卵的時(shí)間，此時(shí)刻記為a，繼續(xù)觀察該卵發(fā)育長成成蟲后，其產(chǎn)出第1個(gè)卵的時(shí)間，此時(shí)記為b，a和b的時(shí)間間隔即為線蟲的世代時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)利用SPSS 17.0軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，劑量組與對照組的兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 L4期幼蟲PFOS和PFOA染毒對秀麗線蟲生殖毒性的影響

同步化后L4期幼蟲經(jīng)PFOS和PFOA分別染毒24h后，與空白對照組比較，PFOS高、中劑量組后代數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PFOA 3個(gè)劑量組后代數(shù)目差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但均未顯示劑量反

應(yīng)關(guān)系。同步化后L4期幼蟲經(jīng)PFOS和PFOA分別染毒24h 后，PFOA和PFOS的3個(gè)劑量組秀麗線蟲的平均世代時(shí)間在61.60～66.30h 之間，與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 L4期幼蟲PFOS和PFOA染毒后秀麗線蟲的后代數(shù)目和世代時(shí)間(±s)

表1 L4期幼蟲PFOS和PFOA染毒后秀麗線蟲的后代數(shù)目和世代時(shí)間(±s)

與空白對照組相比，*P<0.05.

2.2 L1期幼蟲PFOS和PFOA分別染毒對秀麗線蟲生殖毒性的影響

同步化后L1期幼蟲染毒48h后，與空白對照組比較，PFOS高、中劑量組后代數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系(R2=0.963，P<0.05)；PFOA高、中劑量組后代數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，但未顯示有劑量反應(yīng)關(guān)系。同步化后L1期幼蟲染毒48h后世代時(shí)間均在61.94～72.30h之間。與空白對照組比較，PFOS 的3個(gè)劑量組世代時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈劑量反應(yīng)關(guān)系(R2=0.955，P<0.05)； PFOA的3個(gè)劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 L1期幼蟲PFOS和PFOA分別染毒后的后代數(shù)目和世代時(shí)間(±s)

表2 L1期幼蟲PFOS和PFOA分別染毒后的后代數(shù)目和世代時(shí)間(±s)

3 討 論

PFOS和PFOA是公認(rèn)的持久性有機(jī)污染物，已有研究表明其具有多種毒性，其生殖毒性是本研究的重點(diǎn)。PFOS和PFOA對雄性生物體的生殖毒性主要表現(xiàn)為影響精子的正常發(fā)育成熟[8-10]、破壞血睪屏障的結(jié)構(gòu)[11-12]、抑制睪酮合成[13-14]；雌性生殖毒性主要表現(xiàn)為對懷孕母體和子代的危害。文永霞等[15]研究表明新生發(fā)育期的雌性大鼠慢性PFOS染毒，會(huì)出現(xiàn)生長發(fā)育緩慢、生育期繁殖能力下降以及不孕不育的癥狀，且該毒性可遺傳至子代。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒出生后的體質(zhì)量、體長與其母親血清PFOS和PFOA水平呈負(fù)相關(guān)，說明其可能對嬰兒的生長發(fā)育產(chǎn)生影響。

目前，對于PFOS和PFOA生殖毒性的研究，通常選用哺乳動(dòng)物(大鼠)、禽類(鵪鶉)以及水體生物(斑馬魚)等作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這些動(dòng)物生命周期較長，性成熟時(shí)間和繁殖周期相對較長，要求相對較長的研究周期。與上述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，秀麗隱桿線蟲生長周期短、繁殖能力強(qiáng)、易于飼養(yǎng)，對于PFOS和PFOA生殖毒性的研究有較大的優(yōu)勢。

L4期線蟲約經(jīng)18h發(fā)育為成蟲，進(jìn)入產(chǎn)卵期，因此受精卵的數(shù)目對其后代的數(shù)量有著重要的影響，在此期間對其進(jìn)行24h染毒，可探究PFOS和PFOA對其受精卵產(chǎn)生的影響。L1期為秀麗線蟲開始生長發(fā)育的時(shí)期，大概46h后達(dá)到L4期，在L1期PFOS和PFOA染毒48h，可探討線蟲發(fā)育期全程PFOS和PFOA暴露是否可能通過影響其生殖系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)而表現(xiàn)出生殖毒性，同時(shí)可模擬人類從嬰幼兒期到成年期接觸PFOS和PFOA對其生殖系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生的影響。本研究以N2線蟲為研究對象，以PFOS和PFOA為受試物，對同步化后L4期線蟲染毒24h，對同步化后L1期線蟲染毒48h，以后代數(shù)目和世代時(shí)間作為其生殖毒性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)線蟲至少有38%的蛋白編碼基因與人類基因同源，用線蟲研究PFOS和PFOA的生殖毒性可以間接地反映其對人類的生殖毒性。有研究表明孕期三氯生暴露對線蟲的世代時(shí)間和后代數(shù)目均有顯著影響[17]。壬基酚暴露可使線蟲世代時(shí)間延長，而后代數(shù)目無明顯改變[18]。

本研究結(jié)果顯示，L4期線蟲染毒24h后，與對照組比較，PFOS高、中劑量組和PFOA各劑量組后代數(shù)目均有明顯差異(P<0.05)，PFOS和PFOA各劑量組世代時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。L1期幼蟲染毒48h后，與對照組比較，PFOS和PFOA中、高劑量組后代數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PFOS的3個(gè)劑量組世代時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明PFOS對發(fā)育期的線蟲具有生殖毒性，使其世代時(shí)間延長、后代數(shù)目減少，且暴露濃度越大，毒性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明L1期幼蟲比L4期幼蟲對PFOS和PFOA更敏感，PFOS和PFOA在線蟲幼年期發(fā)育全程暴露可顯著誘導(dǎo)其生殖毒性，后代數(shù)目是PFOS和PFOA生殖毒性的敏感指標(biāo)，世代時(shí)間對PFOS暴露比L4期幼蟲更敏感，但PFOA不影響線蟲的世代時(shí)間?？赡苁且?yàn)長1期線蟲生殖系統(tǒng)未發(fā)育完善，比L4期線蟲對外源化學(xué)物更敏感，L1期到成蟲期線蟲體內(nèi)累積的PFOS和PFOA更多，所以產(chǎn)生的毒性更強(qiáng)，PFOS和PFOA可能是通過影響線蟲生殖系統(tǒng)的發(fā)育而產(chǎn)生生殖毒性。此外由L1期染毒數(shù)據(jù)看出PFOS與PFOA對線蟲的抑制作用不同，這與PFOA和PFOS對大型蚤急性毒性試驗(yàn)研究[18]結(jié)果類似。PFOS和PFOA都是C8全氟化合物，PFOS的官能團(tuán)為-S(=O)2-F，PFOA的官能團(tuán)為-COOH，在生殖毒性上的差異是否與其化學(xué)結(jié)構(gòu)的差別有關(guān)，還需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。

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Reproductive toxicity of perfluorooctane sulfonate and perfluorooctanoic acid on Caenorhabditis elegans

JIAN Zihai，DAI Shuhao，WANG Xuefei，YANG Zijie，LU Qiang，YANG Zhenglong，AWUYING·Hadelebieke，YIN Lihong，LIU Ran*
(Key Laboratory of Environmentalmedicine Engineering,ministry of Education, School of Publichealth, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu, China)

目的： 探討全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)對秀麗隱桿線蟲的生殖毒性，尋找評(píng)價(jià)PFOS和PFOA生殖毒性的替代模型。方法：PFOS和PFOA分別設(shè)高、中、低3個(gè)染毒劑量(0.1、0.01、0.001mmol/L)組和空白對照組，同步化后L4期幼蟲在24孔板里染毒24h，L1期幼蟲染毒48h，測定后代數(shù)目和世代時(shí)間。結(jié)果：L4期幼蟲染毒24h后，與對照組比較，PFOS高、中劑量組后代數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PFOA的3個(gè)劑量組后代數(shù)目差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PFOS和PFOA各劑量組世代時(shí)間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。L1期幼蟲染毒48h后，與對照組比較，PFOS和PFOA高、中劑量組后代數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PFOS 3個(gè)劑量組的世代時(shí)間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論：后代數(shù)目是PFOS和PFOA生殖毒性的敏感指標(biāo)，L1期幼蟲的世代時(shí)間對PFOS暴露比L4期幼蟲更敏感，但PFOA不影響線蟲的世代時(shí)間。線蟲可能成為評(píng)價(jià)PFOS和PFOA生殖毒性的替代模型。

全氟辛烷磺酸；全氟辛酸；秀麗隱桿線蟲；后代數(shù)目；世代時(shí)間

OBJECTIVE:Caenorhabditis elegans were used to investigate the inductionof reproductive toxicity of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoic acid (PFOA)，as an alternativemodels for evaluating reproductive toxicity.METHODS：Three PFOS/PFOA dose (0.1，0.01，0.001mmol/L) groups and a control group were organized.After synchronization，L4 larvae were exposed for 24h in 24-well plates，the L1 larvae were exposed for 48h.The brood size and the generation time of Caenorhabditis elegans were evaluated to determine the inductionof reproductive toxicity by PFOS and PFOA.RESULTS：Compared with the control，thehigh and themedium dose groups with exposure for 24h showed significant difference in the brood size (P<0.05)，and the three PFOA exposure dose groups showed significant difference among them (P<0.05).Generation time showed no significant difference among the exposed and the control groups.Compared with the control group，thehigh andmedium dose groups with exposure for 48h showed significant difference in the brood size (P<0.05) and the three exposed groups showed significant difference in generation time (P<0.05).CONCLUSION：The results suggested that brood size of Caenorhabditis elegans was a sensitive indicator for evaluating reproductive toxicity of PFOS and PFOA.In addition，generation timemeasurements wasmore sensitive using L1 larvae than thatof L4 larvae.

PFOS；PFOA；Caenorhabditis elegans；brood size；generation time

R994.6

A

1004-616X(2016)06-0484-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.015

2016-08-28；

2016-10-13

國家自然科學(xué)基金(81273123)

作者信息： 簡子海，E-mail：674530636@qq.com。*通信作者：劉 冉，E-mail：ranliu@seu.edu.cn