潘鵬屹　朱建平　王云龍　郝媛媛　蔡躍　張文偉　江玲　王益華　萬建民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)中心，南京210095；*通訊聯(lián)系人， E-mail: wanjm@njau.edu.cn)

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水稻粉質(zhì)胚乳突變體ws的表型分析及基因克隆

潘鵬屹朱建平王云龍郝媛媛蔡躍張文偉江玲王益華萬建民*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)中心，南京210095；*通訊聯(lián)系人， E-mail: wanjm@njau.edu.cn)

PAN Pengyi, ZHU Jianping, WANG Yunlong, et al. Phenotyping and gene cloning of a floury endosperm mutantwsin rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 447-457.

從甲基亞硝基脲(1-Methyl-1-Nitrosourea, MNU)處理的粳稻品種滇粳優(yōu)1號(hào)突變體庫中，篩選到一個(gè)穩(wěn)定遺傳的胚乳粉質(zhì)突變體ws，其籽粒的千粒重、籽粒大小、總淀粉含量、直鏈淀粉含量等指標(biāo)均降低，淀粉在尿素溶液中的膨脹能力減弱。對(duì)成熟及發(fā)育中的胚乳淀粉結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)ws突變體的胚乳中產(chǎn)生大量小而不規(guī)則排布的單淀粉顆粒。利用F2群體中分離出的92個(gè)隱性極端個(gè)體將突變基因連鎖在第8染色體近著絲粒位置，隨后共用2025個(gè)極端個(gè)體將目標(biāo)基因定位于95 kb的區(qū)間。測(cè)序發(fā)現(xiàn)ws突變體中編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(Adenosine diphosphate glucose pyrophosphorylase, AGPase)小亞基S2的基因發(fā)生點(diǎn)突變，導(dǎo)致編碼氨基酸的替換?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)，突變體胚乳中編碼AGPase各亞基的相關(guān)基因表達(dá)量沒有發(fā)生顯著改變，而Western雜交分析顯示突變體中AGPS2b的蛋白含量下降。同時(shí)，ws突變體的胚乳中AGPase活性下降為野生型的一半。研究結(jié)果表明，OsAGPS2的突變導(dǎo)致水稻胚乳中AGPase活性降低，從而影響了淀粉合成。

胚乳粉質(zhì)突變體； AGPase； 淀粉； 基因表達(dá)； 理化性質(zhì)； 水稻

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上有1/3以上的人口以稻米為主食。淀粉作為水稻種子的主要貯藏物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)決定了稻米的外觀品質(zhì)和食味品質(zhì)。因此，對(duì)淀粉合成相關(guān)基因的克隆和鑒定，不僅在科學(xué)上對(duì)闡明水稻淀粉合成及調(diào)控的分子機(jī)制，而且在育種上對(duì)改良稻米品質(zhì)也具有重要的指導(dǎo)意義。

水稻的淀粉主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩部分組成。直鏈淀粉是α-D-葡萄糖單位以α-1,4 糖苷鍵連接的線性葡聚糖鏈，基本無分支，或分支很少；支鏈淀粉是以α-D-葡萄糖為單位組成的高度分支葡聚糖，其分子分支內(nèi)以α-1,4 糖苷鍵連接，分支間則以α-1,6 糖苷鍵相連[1]。淀粉的主要合成場(chǎng)所在造粉體，其生物合成是一個(gè)非常復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程。葉片光合作用產(chǎn)物首先以蔗糖的形式運(yùn)輸?shù)降矸酆铣善鞴俚呐呷榧?xì)胞，轉(zhuǎn)化為1-磷酸-葡萄糖(G-1-P)后進(jìn)入造粉體內(nèi)，在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、淀粉脫支酶(DBE)等的作用下形成直鏈淀粉或支鏈淀粉[2, 3]。

AGPase是淀粉合成代謝過程中涉及的第一個(gè)酶，其作用是將G-1-P 中的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到ATP上形成焦磷酸和腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)[4]。ADPG生成后，在淀粉合成酶SS的催化下，葡萄糖殘基以α-1,4 糖苷鍵摻入葡聚糖引物的非還原末端，延長一個(gè)葡萄糖單位，最終形成α-1,4 糖苷鍵連接的聚糖[4, 5]。聚糖又將作為淀粉分支酶的底物合成支鏈淀粉。顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSSⅠ)是胚乳直鏈淀粉合成過程中的關(guān)鍵酶，由Wx基因編碼[6, 7]。淀粉分支酶作用是催化α-1,4 糖苷鍵斷裂，將釋放出的寡聚糖鏈連接到葡聚糖鏈殘基的C6羥基上，形成α-1,6 糖苷鍵，產(chǎn)生淀粉的支鏈[8, 9]。淀粉脫支酶(DBE)催化水解α-1,6 糖苷鍵，根據(jù)DBE作用底物的不同，可將DBE分為普魯蘭酶(PUL)和異淀粉酶(ISA)[10, 11]。

作為水稻胚乳淀粉合成途徑中的上游關(guān)鍵酶，AGPase參與淀粉合成底物ADPG的合成。細(xì)菌中的AGPase是以由glgC基因編碼的亞基所形成的同源四聚體形式存在[12]，而在高等植物體中，AGPase是由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基所構(gòu)成的異源四聚體[13, 14]，它們由不同的基因編碼。水稻中編碼AGPase異源四聚體小亞基的基因有兩個(gè)，即OsAGPS1和OsAGPS2，其中OsAGPS2可以通過可變剪切產(chǎn)生兩類mRNA，分別在葉片和胚乳中特異性表達(dá)，其翻譯產(chǎn)物為OsAGPS2a和 OsAGPS2b；編碼異源四聚體大亞基的基因有四個(gè)，即OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPL3和OsAGPL4[15]。相關(guān)研究顯示，AGPase的催化功能由大小亞基相互協(xié)調(diào)起作用[16]。在水稻的胚乳發(fā)育過程中，OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPS1和OsAGPS2b表達(dá)量相對(duì)較高[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在谷類作物籽粒灌漿期間，胚乳的AGPase活性主要存在于胞質(zhì)中[17, 18]。OsAGPL2和OsAGPS2定位在胞質(zhì)，其各自的缺失突變體sug、shr中淀粉合成受到顯著影響，產(chǎn)生皺縮胚乳；OsAGPS2的缺失還會(huì)引起造粉體、質(zhì)體發(fā)育異常[19, 20]。在大麥突變體ris? 16中，AGPase的小亞基發(fā)生缺失，其籽粒的淀粉含量及質(zhì)量分別下降為野生型的44%和72%[21]。而當(dāng)AGPase活性上調(diào)時(shí)，水稻、玉米等作物的籽粒質(zhì)量增加[22, 23]。因此，AGPase是淀粉生物合成的關(guān)鍵酶，對(duì)胚乳中淀粉的合成具有重要影響。

在對(duì)淀粉合成相關(guān)基因的研究中，人們通過尋找胚乳粉質(zhì)突變體來揭示更多的調(diào)控機(jī)制。已報(bào)道的胚乳粉質(zhì)突變體有flo1～flo7等，它們的表型包括胚乳粉質(zhì)、皺縮、堊白等。突變體flo1直鏈淀粉含量較高，其突變基因位于第5染色體上[24]；FLO2編碼一個(gè)包含三角四肽重復(fù)基序的蛋白，其突變體表現(xiàn)為粉質(zhì)胚乳，籽粒變小[25]；flo3中16kD蛋白含量降低，突變基因位于第4染色體上[26]；flo4與flo5突變體胚乳均呈心白狀，其中FLO4編碼磷酸丙酮酸雙激酶，它可能通過調(diào)節(jié)胚乳中的碳氮代謝來影響淀粉合成[27]，而flo5突變體則是OsSSⅢa缺失突變體[28]；FLO6基因編碼一個(gè)包含529個(gè)氨基酸的未知功能的蛋白，具有淀粉結(jié)合活性并能與異淀粉酶ISA1互作[29]；FLO7基因編碼一個(gè)功能未知的調(diào)節(jié)因子，它影響淀粉合成及造粉體發(fā)育，其突變體表型為胚乳外圈呈白色粉質(zhì)狀[30]。以上突變體和基因的發(fā)現(xiàn)，為更全面地闡明淀粉的生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們篩選獲得了一個(gè)AGPS2基因發(fā)生點(diǎn)突變的水稻突變體ws，其胚乳表現(xiàn)為粉質(zhì)、不透明狀。本研究對(duì)ws突變體籽粒的理化性質(zhì)以及胚乳淀粉結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，分析了不同組織和不同發(fā)育時(shí)期胚乳中相關(guān)基因的表達(dá)情況及AGPase、UGPase的活性，旨在進(jìn)一步明確AGPase對(duì)淀粉合成的作用及其亞基間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料種植

ws是粳稻品種滇粳優(yōu)1號(hào)經(jīng)1 mmol/L MNU誘變后從中篩選得到的粉質(zhì)突變體材料，因胚乳表型為白色不透明和輕微皺縮，將其命名為ws(whiteandshrunken)，其胚乳粉質(zhì)性狀穩(wěn)定遺傳。將其與秈稻品種南京11配制雜交組合用于基因的精細(xì)定位。水稻植株生長于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地及土橋?qū)嶒?yàn)基地，田間管理同一般大田。

1.2成熟種子理化指標(biāo)測(cè)定

將成熟種子去殼后磨成糙米粉進(jìn)行測(cè)定。直鏈淀粉含量測(cè)定按照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY147-88進(jìn)行；總淀粉含量使用Megazyme總淀粉測(cè)定試劑盒測(cè)定；總蛋白含量使用FOSS公司Kjeltec 2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定，總脂肪含量使用FOSS公司Soxtec 2050全自動(dòng)脂肪測(cè)定儀測(cè)定。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.3米粉的尿素膨脹體積

分別配制濃度為0～9 mol/L的尿素溶液，均用醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.0。在1.5 mL EP管中分別加入上述尿素溶液1 mL以及20 mg糙米粉，混合均勻后在25℃下孵育24 h。室溫、8000g下離心20 min，靜置1 h。計(jì)算各EP管中可溶尿素部分的體積，淀粉顆粒的膨脹體積=總體積(1 mL)-可溶部分體積。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值。

1.4成熟種子橫切面掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察按照前人方法[27]進(jìn)行。將成熟種子從中間部分橫切制成樣品后，在3%的戊二醛溶液中室溫浸泡3 h，然后用0.1 mol/L的磷酸鈉溶液(pH為6.8)沖洗3～5次，每次進(jìn)行15 min。接著用2%的四氧化鋨溶液4℃下固定過夜，固定后的樣品用0.1 mol/L的磷酸鈉溶液(pH 6.8)沖洗2～3次，每次15 min，然后用70%、80%、95%、100%乙醇溶液逐級(jí)脫水，每次5 min，再在乙醇-異戊基醋酸(體積比為1∶3)混合液中浸泡1 h，取出干燥，最后用金粉包被，在日立S-3000N型掃描電子顯微鏡下觀察(加速電壓為10～20 kV)。

1.5胚乳半薄切片觀察

按前人所述方法進(jìn)行[29]。取花后9、12 d的胚乳，切成厚度1～2 mm的薄片，放入固定液中進(jìn)行固定。12 h后將樣品取出用PBS漂洗3次，然后于4℃下，依次用30%、50%乙醇對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，每次15 min。然后在-20℃下用70%乙醇溶液對(duì)樣品脫水處理兩次，每次30 min。脫水處理后的樣品使用LR WHITE樹脂進(jìn)行滲透、包埋、聚合等，操作過程按照其說明進(jìn)行。對(duì)聚合后的膠囊進(jìn)行修塊，然后使用Leica RM2265全自動(dòng)半薄輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)將其切成1 μm的切片。切片用1%的I2-KI溶液進(jìn)行染色后，在Zeiss AX10熒光顯微鏡下觀察。半薄切片固定液配方為2%(質(zhì)量體積比)多聚甲醛、 2%(體積比)戊二醛、250 mmol/L蔗糖、50 mmol/L PIPES-KOH，pH值7.2。

1.6WS基因的圖位克隆

我們配制了ws與南京11的雜交組合用于基因定位。在F1植株上收取F2種子，挑選其中與ws突變體一樣表現(xiàn)為粉質(zhì)不透明的F2種子，發(fā)芽后提取幼苗DNA進(jìn)行基因的精細(xì)定位。標(biāo)記的開發(fā)基于NCBI、Gramene等網(wǎng)站，測(cè)序由南京金斯瑞公司完成?；蚪MDNA采用CTAB法提取[31]。PCR體系如下：1 μL DNA模板(約20 ng)，1 μL引物(0.2 μmol/L)，1 μL dNTP (50 μmol/L)，1 μL 10 × 緩沖液(含Mg2+)和0.1 μLTaq(5 U/μL)DNA聚合酶(TaKaRa，大連)，用ddH2O補(bǔ)足10 μL。PCR程序如下：94℃下 5 min，94℃下 30 s，55℃下 30 s，72℃下 40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃下 10 min，4℃下保存。PCR產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。

1.7AGPase相關(guān)基因的表達(dá)分析

取花后12 d胚乳、發(fā)芽后7 d植株幼苗葉片，使用TIANGEN公司的植物總RNA提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后使用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒，在ABI PRISM 7500HT上擴(kuò)增，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。反應(yīng)體系包括1.8 μL cDNA模板，10 μL 2 × SYBR Premix ExTaqⅡ，0.8 μL 10 μmol/L PCR 正向引物，0.8 μL 10 μmol/L PCR反向引物，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序采用兩步法：第一步95℃下預(yù)變性30 s，95℃下 5 s，60℃下 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；第二步95℃下 15 s，60℃下 1 min，95℃下 15 s。用2-△△CT法對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，以水稻Actin基因作為內(nèi)參。所用引物部分參照前人所述[25]。

表1WS基因定位引物的序列

Table 1. Markers for fine mapping of WS.

標(biāo)記Marker正向引物Forward(5'→3')反向引物Reverse(5'→3')HY8-19TTTGTTGCTTTTCTGATTCATGATAAAGCGATAAACCAWQ8-28GAGACGGACGGGTGTTGACAATGACATCCCAGCGTAWZ8-17TAAATCATGGTGGTGGGCACCGTCGTCTAGCAAGGAGWZ8-3ATTAAGATGATATGGGAAGTACATTGACCTGGTAGAAACHY8-24ATTAAGATGATATGGGAAGTACATTGACCTGGTAGAAAC

表2實(shí)時(shí)RT-PCR引物序列

Table 2. Primers used in real-time RT-PCR.

基因Gene正向引物Forward(5'→3')反向引物Reverse(5'→3')AGPL1CATCAAGGACGGGAAGGTCAACTTCACTCGGGGCAGCTTAAGPL2CTGAGGAAGAGGTGCTTTGGTCTTTCGGGAGGATTGTGTCAGPS1AGAATGCTCGTATTGGAGAAAATGGGCAGCATGGAATAAACCACAGPS2aACTCCAAGAGCTCGCAGACCGCCTGTAGTTGGCACCCAGAAGPS2bAACAATCGAAGCGCGAGAAAGCCTGTAGTTGGCACCCAGAUGPase1CCATCACCGCCAAGTCAGACCGTTGATGTCCTTGTTCTActinCCCTCCTGAAAGGAAGTACAGTGTGTCCGAAGAATTAGAAGCATTTCC

1.8蛋白Western-blot分析

取花后12 d胚乳提取總蛋白進(jìn)行電泳。濃縮膠濃度為6%，分離膠使用8%～15%的梯度膠。濃縮膠時(shí)采用80V電壓，蛋白質(zhì)電泳至分離膠后，將電壓升到120 V，根據(jù)預(yù)染標(biāo)記條帶及目標(biāo)蛋白大小判斷電泳停止時(shí)間，剝膠后轉(zhuǎn)膜采用Bio-rad公司的濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)。PVDF膜(Minipore, 0.45 μm)在封閉液中孵育1 h后，轉(zhuǎn)移至用封閉液稀釋的一抗溶液中(1∶1000)，室溫孵育2 h；接著用10 mmol/L PBST溶液漂洗3次，每次15 min；再將PVDF膜轉(zhuǎn)移至用封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的二抗溶液中(1∶5000)，室溫孵育1 h后，重復(fù)上述漂洗過程；最后使用ECL化學(xué)發(fā)光(Tannon)檢測(cè)雜交信號(hào)。封閉液為5%脫脂牛奶，用10 mmol/L PBST溶解?？贵w由ABclonal公司制備。內(nèi)參抗體為Sigma公司的Anti-α-Tubulin單克隆抗體(T5168)。

1.9酶活測(cè)定

AGPase活性測(cè)定參照前人所述方法[32]。在1.5 mL管中依次加入100 μL ADPG(14 mmol/L)、50 μL MgCl2(50 mmol/L)、700 μL HEPES-NaOH和50 μL粗酶液，30℃下預(yù)熱10 min后加入100 μL PPi(20 mmol/L)，起始反應(yīng)，30℃下水浴15 min。沸水煮2 min，終止反應(yīng)。待溶液冷卻至室溫后加入100 μL NADP(20 mmol/L)，1.5 U的磷酸葡萄糖變位酶和1.375 U的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，再加入300 μL的HEPES-NaOH，30℃下水浴10 min后測(cè)定OD340吸光值。粗酶液提取方法如下：取5粒發(fā)育中的水稻籽粒，剝?nèi)∑渑呷橛贓P管中，稱重后加入10倍體積的提取液，充分研磨后在4℃、20 000g下離心10 min，取上清液即為粗酶液。提取液配方為50 mmol/L HEPES，2 mmol/L MgCl2，50 mmol/L β-巰基乙醇，12.5% 甘油(V/V)，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4～7.5，加水補(bǔ)足。類似地，測(cè)定UGPase活性時(shí)，在1.5 mL管中依次加入100 μL UDPG(14 mmol/L)，50 μL MgCl2(50 mmol/L)，700 μL HEPES-NaOH和20 μL粗酶液，后續(xù)步驟同AGPase測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1ws突變體表型及農(nóng)藝性狀分析

從1 mmol/L MNU處理的滇粳優(yōu)1號(hào)突變體庫中篩選獲得的胚乳性狀突變體，其成熟種子的胚乳呈粉質(zhì)、不透明狀，而滇粳優(yōu)1號(hào)成熟種子的胚乳為透明狀(圖1-A、B)。與野生型相比，突變體成熟種子的千粒重下降36%，同時(shí)其粒長、粒寬、粒厚也均有顯著降低(圖2-A、B)。此外，ws突變體的株高僅為野生型的88%，結(jié)實(shí)率為野生型的70%，一次枝梗數(shù)也由15個(gè)減少至12個(gè)(圖1-C，圖2-C)。

2.2ws突變體成熟籽粒的理化性質(zhì)分析

ws突變體的成熟籽粒中總淀粉含量和直鏈淀粉含量僅為野生型的79%和83%。

同時(shí)，ws突變體成熟籽粒的脂肪含量相比野生型上升了48%，蛋白質(zhì)含量上升了44%(圖3-A)。

A-野生型與ws突變體種子表型比較，標(biāo)尺為3 mm； B-野生型與ws突變體種子橫切面，標(biāo)尺為1 mm； C-野生型與ws突變體植株，標(biāo)尺為20 cm。DJY-滇粳優(yōu)1號(hào)(野生型)。

A, Comparison of wild-type andwsmutant seeds, bar = 3 mm; B, Seed cross-sections of wild-type andwsmutant, bar = 1 mm; C, Comparison of wild-type andwsmutant plants, bar = 20 cm. DJY， Dianjingyou 1(wild type).

圖1野生型與ws突變體的表型比較

Fig. 1. Phenotype comparison of the wild-type and ws mutant.

在尿素溶解性上，試驗(yàn)結(jié)果表明ws突變體較野生型更難溶于尿素(圖3-B、D)。在尿素濃度達(dá)到4 mol/L時(shí)，野生型的米粉開始明顯地溶解，而在突變體中直到尿素濃度達(dá)到7 mol/L才觀察到與之相當(dāng)?shù)娜芙饬?圖3-C、D)。尿素膨脹結(jié)果表明，ws突變體中支鏈淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

2.3ws突變體成熟種子的掃描電鏡觀察

利用掃描電鏡觀察ws突變體及其野生型成熟籽粒的橫斷面，可以發(fā)現(xiàn)野生型籽粒橫斷面的淀粉顆粒多為排列緊密的多面體結(jié)構(gòu)(圖4-A、B)，而在突變體籽粒橫斷面則觀察到大量小而不規(guī)則排布的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)(圖4-C、D)，說明ws突變體成熟籽粒中的淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。突變體籽粒中淀粉結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)使得光線通過時(shí)發(fā)生散射而導(dǎo)致突變體籽粒呈現(xiàn)不透明狀。

2.4ws胚乳發(fā)育過程中淀粉結(jié)構(gòu)的半薄切片觀察

對(duì)發(fā)育過程中的胚乳進(jìn)行半薄切片后，觀察其淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在野生型滇粳優(yōu)1號(hào)胚乳細(xì)胞中，存在許多復(fù)合淀粉顆粒，每個(gè)復(fù)合淀粉顆粒由多個(gè)單淀粉顆粒組成，屬于典型的水稻復(fù)合淀粉顆粒結(jié)構(gòu)(圖5-A～C)。在對(duì)ws突變體的胚乳細(xì)胞進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，突變體的胚乳細(xì)胞中存在大量單淀粉顆粒，復(fù)合淀粉顆粒相對(duì)較少，且排列松散，顯示ws突變體的胚乳發(fā)育過程中淀粉顆粒形成異常(圖5-D～F)。

千粒重n= 3，其余n= 10，取平均值±SD； 采用t測(cè)驗(yàn)，**表示P< 0.01。DJY-滇粳優(yōu)1號(hào)(野生型)。

Values are mean ± SD (n= 10, except for 1000-grain weight,n= 3);t-test,**P< 0.01. DJY， Dianjingyou 1(wild type).

圖2野生型與ws突變體的千粒重、籽粒及主要農(nóng)藝性狀比較

Fig. 2. Comparison of 1000-grain weight, seed and major agronomic traits of wild-type and ws mutant.

A-野生型與ws突變體籽粒的化學(xué)成分分析(Mean±SD)，n= 3，**，P< 0.01(t測(cè)驗(yàn))； B-野生型與ws突變體的尿素膨脹； C-4 mol/L的尿素濃度下出現(xiàn)顯著差異； D-不同尿素濃度下野生型和突變體的米粉的膨脹體積比較(n= 3)。DJY-滇粳優(yōu)1號(hào)(野生型)。

A, Comparison of chemical composition of wild-type andwsseeds, values are mean ±SD,n= 3;t-test,**P< 0.01; B, Gelatinization properties of wild type andwsmutant seeds; C, Significant difference was observed at the urea concentration of 4 mol/L urea; D, The swollen volume of wild-type andwsstarch in urea solutions of various concentrations (n= 3). DJY， Dianjingyou 1(wild type).

圖3野生型與ws突變體成熟籽粒的理化性質(zhì)分析

Fig. 3. Physicochemical characteristics of wild-type and ws mature seeds.

2.5WS基因的精細(xì)定位

將ws與南京11配制雜交組合，從F1植株上收獲的種子(F2)中挑選與ws突變體相同的胚乳粉質(zhì)不透明籽粒進(jìn)行基因定位。首先用92個(gè)極端個(gè)體將該基因連鎖在第8染色體近著絲粒的區(qū)段內(nèi)(圖6-A)，隨后擴(kuò)大定位群體，最終利用2025個(gè)胚乳粉質(zhì)不透明個(gè)體將基因定位在了標(biāo)記WQ8-28與WZ8-17之間約95 kb區(qū)域內(nèi)(圖6-B)。在水稻數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)查詢此區(qū)域內(nèi)有5個(gè)預(yù)測(cè)的開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF，圖6-C)，其中基因Os08g0345800與淀粉合成直接相關(guān)，編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的一個(gè)小亞基(AGPS2)。對(duì)突變體該基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在其編碼區(qū)第三個(gè)外顯子上，第548位核苷酸(AGPS2b序列)發(fā)生由C到T的改變，導(dǎo)致第183位氨基酸由極性的蘇氨酸(Thr)變?yōu)榉菢O性的異亮氨酸(Ile)(圖6-D)。

2.6ws突變體及野生型中的相關(guān)基因表達(dá)及酶活分析

為了分析AGPS2b的表達(dá)模式，通過RT-PCR分析野生型中不同組織以及不同發(fā)育時(shí)期胚乳中AGPS2b的表達(dá)水平。結(jié)果表明，AGPS2b在穗中表達(dá)量最高，而莖中表達(dá)量較低(圖7-A)。同時(shí)，AGPS2b在發(fā)育中后期的胚乳中表達(dá)量較高(圖7-B)。分析發(fā)芽7 d后的幼苗，發(fā)現(xiàn)突變體葉片中AGPS2a表達(dá)量較野生型極顯著降低(圖7-C)。采取同樣的方法比較了開花后12 d的野生型與突變體胚乳中編碼AGPase各亞基相關(guān)基因的表達(dá)水平。與野生型相比，ws突變體中編碼AGPase各亞基的相關(guān)基因的表達(dá)量沒有發(fā)生顯著改變(圖7-D)。提取開花后12 d胚乳中的總蛋白進(jìn)行Western-Blot分析，發(fā)現(xiàn)ws突變體中的AGPS2b蛋白水平顯著降低(圖7-E)。FLO4、PHO1為選取的影響淀粉合成的蛋白，其水平?jīng)]有發(fā)生顯著改變。酶活測(cè)定顯示，ws突變體胚乳中AGPase活性降至野生型的一半，而UGPase(UDP-glucose pyrophosphorylase)活性則有略有上升(圖7-F)。

A，B-野生型胚乳； C，D-ws突變體胚乳。A，C為籽粒橫切面，標(biāo)尺為1 mm； B，D是局部放大后的胚乳淀粉結(jié)構(gòu)(紅色方框內(nèi))，標(biāo)尺為10 μm。

A, B, Endosperm of wild-type; C, D, Endosperm ofwsmutant; A, C, Endosperm cross-section, Bars = 1 mm; B, D, Partial enlarged drawing picture, Bars = 10 μm.

圖4野生型與ws突變體成熟籽粒的掃描電鏡觀察

Fig. 4. Scanning electron microscopy observation of mature seeds of wild type and ws mutant.

3　討論

本研究中，我們通過篩選經(jīng)MNU處理的滇粳優(yōu)1號(hào)突變體庫，得到了一份胚乳呈粉質(zhì)不透明的突變體。分析突變體成熟籽粒的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)突變體成熟籽粒中的淀粉積累量以及支鏈淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。通過對(duì)突變體籽粒的橫斷面進(jìn)行掃描電鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)突變體胚乳中淀粉結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)小而不規(guī)則排列狀，這可能是導(dǎo)致其胚乳呈現(xiàn)不透明的直接原因。利用半薄切片進(jìn)一步分析了突變體發(fā)育過程中的胚乳，發(fā)現(xiàn)其發(fā)育中胚乳的淀粉結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)異常，具體表現(xiàn)為復(fù)合淀粉顆粒較少，而存在大量單淀粉顆粒。這些結(jié)果說明突變體胚乳從發(fā)育直至成熟階段的淀粉合成與積累出現(xiàn)了異常。通過圖位克隆，我們發(fā)現(xiàn)ws突變體中編碼AGPS2的基因發(fā)生了單堿基替換，導(dǎo)致編碼氨基酸的改變。

A，B-開花后9 d野生型胚乳細(xì)胞外圍、里層； C-開花后12 d野生型胚乳細(xì)胞里層； D，E-開花后9 d的ws突變體胚乳細(xì)胞外圍、里層； F-開花后12 d的ws突變體胚乳細(xì)胞里層。A，D標(biāo)尺是100 μm，B，C，E，F(xiàn)標(biāo)尺是50 μm。

A, B, Peripheral part (A) and central part (B) of wild-type endosperm cells at 9 DAF (days after flowering); C, Central part of wild-type endosperm cells at 12 DAF; D, E, Peripheral part (D) and central part (E) ofwsendosperm cells at 9 DAF; F, Central part ofwsendosperm cells at 12 DAF. Bars = 100 μm in A and D, 50 μm in B, C, E, F.

圖5野生型與ws突變體胚乳的半薄切片觀察

Fig. 5. Semi-thin sections of wild type and ws mutant seeds.

AGPS2b定位在胞質(zhì)[8]。大時(shí)報(bào)道證明，谷類作物胚乳中的APGase主要存在于細(xì)胞質(zhì)。在玉米胚乳中，質(zhì)體中AGPase活性只占其體內(nèi)所有AGPase活性的5%[33]，而大麥中的質(zhì)體APGase活性也僅占15%[34]。玉米突變體Bt2中，AGPS2發(fā)生突變，體內(nèi)的AGPase活性顯著降低[35]。同樣，在水稻胚乳中，研究已發(fā)現(xiàn)大部分AGPase的活性表現(xiàn)在質(zhì)體之外，質(zhì)體中的APGase活性只占10%[36]。在本研究中，由于ws突變體的APGS2發(fā)生了點(diǎn)突變，其整體AGPase酶活下降至野生型的一半左右，這是導(dǎo)致突變體淀粉合成出現(xiàn)異常的主要原因。

A-WS基因與標(biāo)記HY8-19和HY8-24連鎖； B-利用2025個(gè)極端個(gè)體將WS基因定位在95 kb區(qū)間內(nèi)； C-WS候選基因分析； D-突變體AGPS2中發(fā)生單堿基替換(紅色標(biāo)出)，AGPS2由10個(gè)外顯子(黑色方框表示)和9個(gè)內(nèi)含子組成，AGPS2a與AGPS2b的第一個(gè)外顯子分別為1a與1b。

A,WSwas linked with markers HY8-19 and HY8-24; B,WSwas located in a 95 kb region based on 2025 individuals; C, Candidate genes forWS; D,wsdisplayed a single nucleotide substitution inAGPS2 (in red)，AGPS2 is composed of 10 exons (filled box) and 9 introns, the alternative use of exon 1a and 1b generatesAGPS2aandAGPS2btranscripts, respectively.

圖6WS基因的精細(xì)定位

Fig. 6. Fine-mapping of WS gene.

在之前的報(bào)道中，AGPS2的缺失導(dǎo)致胚乳出現(xiàn)粉質(zhì)表型，并且明顯皺縮[19, 20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ws具有一個(gè)新的突變位點(diǎn)，雖然AGPS2的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，但AGPS2b蛋白量降低。從籽粒外觀上來看，ws突變體沒有出現(xiàn)非常嚴(yán)重的皺縮現(xiàn)象。另外，在ws突變體中，編碼AGPase各亞基的相關(guān)基因表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生明顯變化。

近年來，有許多研究者著眼于探究高等植物中AGPase異源四聚體各亞基之間的關(guān)系。按照普遍的觀點(diǎn)，AGPase的催化活性主要由小亞基(SSU)提供，而大亞基(LSU)則起結(jié)構(gòu)調(diào)控作用。

研究者最初在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)，由SSU形成的同源四聚體具有催化活性，在適當(dāng)?shù)臈l件下它甚至能具有與正常的由異源四聚體構(gòu)成的AGPase一樣的催化能力[37, 38]。在擬南芥中也有類似的報(bào)道[39]。相比之下，馬鈴薯中的LSU形成的同源四聚體并不具有催化活性[37]。擬南芥中AGPL3與AGPL4的同源四聚體活性較弱，而擬南芥AGPL1、AGPL2以及番茄AGPL3的同源四聚體則具有較強(qiáng)的活性[40, 41]，這說明高等植物中的LSU有不同的催化特性。Tuncel等[42]報(bào)道，LSU對(duì)于AGPase的功能發(fā)揮與結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)都是必不可少的，AGPL2能夠提高S2亞基的穩(wěn)定性，且缺失AGPL2時(shí)AGPase活性降低。從本研究的結(jié)果來看，突變體ws中AGPS2的突變導(dǎo)致AGPase活性降低，進(jìn)一步證明了AGPase中SSU提供主要催化活性的觀點(diǎn)。同時(shí)ws中AGPL2的基因表達(dá)水平及蛋白積累量沒有發(fā)生改變，說明AGPS2對(duì)AGPL2的表達(dá)沒有直接的影響。

A-野生型不同組織中AGPS2b的表達(dá)分析； B-野生型不同發(fā)育時(shí)期胚乳中AGPS2b的表達(dá)分析； C-野生型和ws突變體發(fā)芽7 d后幼苗葉片中AGPS2a表達(dá)分析； D-野生型與ws突變體發(fā)育中胚乳的AGPase相關(guān)基因表達(dá)分析； E-野生型與ws突變體發(fā)育中胚乳的相關(guān)蛋白表達(dá)分析； F-野生型和ws突變體發(fā)育胚乳中AGPase和UGPase活性測(cè)定。A，B，C，D，F(xiàn)中，n= 3，取平均值±SD。

A, Real-time RT-PCR analysis of the expression ofAGPS2bin different organs in wild type; B, Real-time RT-PCR analysis of the expression ofAGPS2bat different developing stages of endosperm in wild type; C, Real-time RT-PCR analysis of the expression ofAGPS2ain leaves of the wild type andwsmutant seedlings at 7 days after germination; D, Real-time RT-PCR analysis of the expression of genes encoding AGPase in wild type andwsmutant endosperm; E, Immunoblot analysis of starch biosynthesis related proteins in wild type andwsmutant endosperm; F, AGPase and UGPase activities of wild-type andwsdeveloping endosperm. For A, B, C, D and F， error bars showSD(n= 3).

圖7野生型及ws突變體中的相關(guān)基因表達(dá)及酶活分析

Fig. 7. Expression of related genes and enzyme activity in wild type and ws mutant.

本研究主要對(duì)ws突變體的胚乳淀粉合成進(jìn)行了分析，然而在對(duì)ws突變體農(nóng)藝性狀的觀察中，我們可以發(fā)現(xiàn)，ws突變體的植株高度、一次枝梗數(shù)以及結(jié)實(shí)率均低于野生型。在對(duì)AGPS2進(jìn)行組織表達(dá)分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)，AGPS2在穗以外的其他組織中也有一定的表達(dá)量。分析發(fā)芽7 d后的幼苗，發(fā)現(xiàn)突變體葉片中AGPS2a表達(dá)量較野生型極顯著降低，由此我們推測(cè)突變體葉片中的淀粉合成受到影響，因而可能進(jìn)一步造成突變體植株的表型變化。這些結(jié)果說明AGPase除了參與調(diào)控胚乳中淀粉合成以外，還在植物的其他部位及生長時(shí)期發(fā)揮作用。因此，對(duì)于AGPase及編碼其各亞基相關(guān)基因的深入研究，對(duì)揭示水稻中胚乳淀粉合成及更多生物代謝過程具有重要意義。

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Phenotyping and Gene Cloning of a Floury Endosperm Mutant ws in Rice

PAN Peng-yi, ZHU Jian-ping, WANG Yun-long, HAO Yuan-yuan, CAI Yue, ZHANG Wen-wei, JIANG Ling, WANG Yi-hua, WAN Jian-min*

(State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Biology, Genetics and Breeding of japonica Rice in Mid-lower Yangtze River, Ministry of Agriculture/The Yangtze River Valley Hybrid Rice Collaboration Innovation Center/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: wanjm@njau.edu.cn)

In this study, we obtained a stably inherited floury endosperm mutantwsfromjaponicavariety cv. Dianjingyou 1 (DJY), with its 1000-grain weight, grain size, total starch content, and amylose content in mature seeds all decreased compared with wild-type, as well as the swelling power of starch. By observing the structure of mature and developing endosperm, we found that the starch granules inwsmutant were smaller and loosely packed. TheWSlocus was first mapped to a region near the centromere in chromosome 8 with 92 recessive individuals, and then was narrowed down to a 95 kb region by using 2025 recessive individuals. Sequence analysis revealed that the coding region of thesmallsubunitofadenosinediphosphateglucosepyrophosphorylase(AGPS2) had a single nucleotide substitution, resulting in a change in the amino acid sequence. RT-PCR analysis showed no significant difference in the expression levels of genes encoding the AGPase subunits in the mutant endosperm, while immunoblot analysis revealed a reduced protein content of the AGPS2b. Meanwhile, the enzyme activity of AGPase in the mutant was decreased to half of the wild-type. These results showed that the mutation ofOsAGPS2 caused the decreased activity of AGPase, thus affecting the starch biosynthesis in rice endosperm.

floury endosperm mutant; AGPase; starch; gene expression; physicochemical property; rice (OryzasativaL.)

2016-03-19； 修改稿收到日期: 2016-04-28。

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08001006); 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31371598)； 江蘇省科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(BE2014394)； 農(nóng)業(yè)部長江中下游粳稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、長江流域雜交水稻協(xié)同創(chuàng)新中心、江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)中心資助項(xiàng)目。

Q343.5; Q785; S511.01

A

1001-7216(2016)05-0447-11

潘鵬屹, 朱建平, 王云龍, 等. 水稻粉質(zhì)胚乳突變體ws的表型分析及基因克隆. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(5)： 447-457.