裔傳燈　王德榮　蔣偉　李瑋　成曉俊　王穎　周勇　梁國(guó)華　顧銘洪

(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 揚(yáng)州225009；*通訊聯(lián)系人， E-mail: cdyi@yzu.edu.cn)

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水稻粒寬基因GS5的功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)和單倍型鑒定

裔傳燈*王德榮蔣偉李瑋成曉俊王穎周勇梁國(guó)華顧銘洪

(揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 揚(yáng)州225009；*通訊聯(lián)系人， E-mail: cdyi@yzu.edu.cn)

YI Chuandeng, WANG Derong, JIANG Wei, et al. Development of functional markers and identification of haplotypes for rice grain width geneGS5. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 487-492.

水稻粒寬是影響籽粒粒形的重要因素之一，也是一個(gè)與水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)密切相關(guān)的重要性狀。在基因GS5序列分析的基礎(chǔ)上，對(duì)該基因第2外顯子的ACC/CTA和第9外顯子A/C的兩個(gè)變異位點(diǎn)分別開(kāi)發(fā)了功能標(biāo)記，并將其用于294份水稻微核心種質(zhì)和2007-2013年江蘇省審定的65份粳稻品種的基因型鑒定。研究結(jié)果表明，這兩個(gè)變異位點(diǎn)的等位變異在水稻籽粒的粒長(zhǎng)、粒寬和長(zhǎng)寬比性狀上存在顯著或極顯著的差異；其在水稻微核心種質(zhì)中組成的4種單倍型在水稻秈亞種的粒寬、粒厚和長(zhǎng)寬比性狀上存在極顯著的差異，在粳亞種的粒寬和長(zhǎng)寬比性狀上存在極顯著的差異；而江蘇省審定的粳稻品種中僅發(fā)現(xiàn)Hap1和Hap2兩種單倍型，其分別有64個(gè)和1個(gè)代表性品種。這些研究結(jié)果為水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)育種中充分利用GS5的優(yōu)異等位基因或單倍型奠定了基礎(chǔ)。

水稻； 粒形； 基因GS5； 功能標(biāo)記； 單倍型

水稻粒形性狀包括粒長(zhǎng)、粒寬、粒厚和長(zhǎng)寬比[1]。它對(duì)稻米品質(zhì)有著重要的影響[2]，尤其是稻米的外觀品質(zhì)(堊白粒率、堊白度)和碾磨加工品質(zhì)(糙米率、精米率和整精米率)，如GW8[3]和GW7[4]。同時(shí)，通過(guò)影響千粒重、水稻粒形性狀對(duì)水稻單產(chǎn)水平也有著重要的作用[5]。如GW8[3]、GS3[6]、qGL3[7]、qSW5/GW5[8, 9]、GS5[10]和TGW6[11]。因此，水稻粒形性狀遺傳調(diào)控機(jī)理的研究對(duì)水稻產(chǎn)量育種和稻米品質(zhì)育種都有著重要的指導(dǎo)意義。

GS5是決定水稻粒形的重要基因之一。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)GS5是編碼類絲氨酸羧肽酶的蛋白質(zhì)，其對(duì)粒寬、籽粒灌漿速率和粒重有著正調(diào)控作用。相對(duì)于水稻品種H94的gs5而言，水稻品種珍汕97的GS5正向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期上游的基因促進(jìn)有絲分裂和增加細(xì)胞數(shù)量，從而增加粒寬，加快籽粒灌漿，結(jié)果導(dǎo)致粒重和單株產(chǎn)量得以提高；同時(shí)轉(zhuǎn)基因證實(shí)來(lái)自水稻品種珍汕97的GS5啟動(dòng)子表達(dá)水平比較高，并與籽粒增大有著高度的相關(guān)性。Xu等[12]進(jìn)一步研究表明轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1109 bp和-1032 bp的兩處單堿基變異對(duì)啟動(dòng)子的差異表達(dá)有重要的影響。目前，該基因其他的變異位點(diǎn)對(duì)水稻粒形性狀有何效應(yīng)還不清楚。為了全面認(rèn)識(shí)GS5不同等位變異的效應(yīng)，本研究對(duì)該基因未知功能的錯(cuò)義突變開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的功能標(biāo)記，結(jié)合水稻微核心種質(zhì)和近年來(lái)江蘇審定的粳稻的基因型檢測(cè)，分析了這些變異位點(diǎn)和組合(單倍型)對(duì)水稻粒形性狀的影響，以期為水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)育種提供理論依據(jù)和快捷的選擇手段。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試水稻材料包括來(lái)自國(guó)內(nèi)外不同稻作區(qū)的水稻微核心種質(zhì)294份[13]以及2007-2013年江蘇省審定的粳稻品種65份[14]，它們分別引自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。鑒于上述研究材料感光性存在明顯的差異，為了確保正常抽穗，將所有供試水稻品種于2014年11月種植在海南陵水(短日照條件)，2015年1月移栽大田，田間管理同常規(guī)水稻品種。待水稻籽粒蠟熟后收種，充分曬干后進(jìn)行水稻籽粒相關(guān)性狀的測(cè)量。

1.2水稻籽粒粒形相關(guān)性狀的測(cè)定

水稻種子收獲風(fēng)干后，挑選飽滿成熟種子，用游標(biāo)卡尺(精確到0.01 mm)測(cè)量粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚，5次重復(fù)，計(jì)算平均值。用電子天平測(cè)定1000粒成熟烘干種子的質(zhì)量，3次重復(fù)，計(jì)算千粒重的平均值。

1.3基因GS5 序列變異的分析和功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)

根據(jù)水稻粒形基因GS5的研究結(jié)果[10]，從NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載基因到GS5的相關(guān)DNA序列，即來(lái)源于秈稻品種珍汕97的cDNA序列(JN256056)和基因組DNA序列(JN256058)，來(lái)源于秈稻品種H94的cDNA序列(JN256055)和基因組DNA序列(JN256057)。以上述序列作為種子序列，在NCBI網(wǎng)站水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到1條高度同源的基因組DNA序列(NC_008398.2)；在水稻基因組注釋計(jì)劃(Rice Genome Annotation Project)網(wǎng)站cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到2條高度同源的cDNA序列(AK106800和CT833291)。借助BioEdit軟件對(duì)上述序列進(jìn)行比對(duì)分析。

利用Primer Premier 5.0 軟件，本研究對(duì)GS5第2和第9外顯子的兩個(gè)錯(cuò)義突變分別設(shè)計(jì)了酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)標(biāo)記和衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS) 標(biāo)記。引物的合成和序列的測(cè)定在上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.4DNA提取

收集供試材料分蘗盛期新鮮幼嫩的葉片，采用SDS法提取水稻基因組DNA。

1.5PCR擴(kuò)增、酶切和電泳

PCR反應(yīng)體系含50 ng/μL基因組DNA 2.0 μL，2 μmol/L引物F和R各2.5 μL，10×緩沖液2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶(TaKaRa Code: R001C) 0.2 μL，滅菌雙蒸補(bǔ)足至20 μL。PCR在德國(guó)艾本德Mastercycler pro梯度PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件如下： 94℃下預(yù)變性5 min； 94℃下30 s；55～60℃下30 s；72℃下1 min，共35個(gè)循環(huán)； 72℃下再延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行水平電泳分離。

利用開(kāi)發(fā)的PCR引物擴(kuò)增GS5的目標(biāo)片段，進(jìn)一步用于酶切反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系為10 μL，分別包含PCR產(chǎn)物5 μL，10×緩沖液 1 μL，DNA限制性內(nèi)切酶(10 U/μL) 0.25 μL，ddH2O 3.75 μL?；靹蚝笾糜?7℃恒溫水浴鍋酶切3～4 h，酶切產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，EB染色，經(jīng)紫外凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.6數(shù)據(jù)分析

本研究中所有數(shù)據(jù)的分析和處理利用Excel和SPSS軟件進(jìn)行。

表1基于GS5第2和第9外顯子DNA序列變異設(shè)計(jì)的PCR引物

Table 1. PCR primers based on the GS5 DNA sequence variations of exon 2 and exon 9.

標(biāo)記名稱Marker變異位點(diǎn)所在區(qū)域aRegionofsequencevariationa基因型Genotype引物序列Primersequence標(biāo)記類型MarkertypeGS5-1Exon2(817bp)ACC/CTAF:GCAAGACAAGGAGCAGCACTACAPS-DdeⅠR:AGAAGCCGACCCCAACAGGS5-2Exon9(3796bp)A/CF:CAGTTCTCGGTACTGCGTCGAdCAPS-SalⅠR:CACAAACCTCCCAGCAACC

a以GS5的基因組序列JN256058作為參照。

aGenomic DNA sequence(JN256058) of geneGS5 as a reference.

表2GS5不同變異位點(diǎn)的籽粒粒形性狀及其t測(cè)驗(yàn)

Table 2. Grain-related traits and their t-tests of different alleles in geneGS5.

性狀TraitGS5-1基因型Genotype樣本數(shù)Samplenumber平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤Mean±SEt值tvalueGS5-2基因型Genotype樣本數(shù)Samplenumber平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤Mean±SEt值tvalue粒長(zhǎng)Grainlength/mmACC1708.03±0.082.98**A2108.09±0.072.33*CTA1248.34±0.07C838.33±0.08粒寬Grainwidth/mmACC1703.05±0.032.21*A2103.04±0.032.01*CTA1242.97±0.02C832.96±0.03粒厚Grainthickness/mmACC1702.13±0.011.03A2102.13±0.011.68CTA1242.11±0.01C832.10±0.01長(zhǎng)寬比RatiooflengthtowidthACC1702.70±0.052.29*A2102.72±0.042.04*CTA1242.84±0.04C832.85±0.05千粒重1000-grainweight/gACC17024.71±0.310.26A21024.74±0.280.04CTA12424.82±0.30C8324.75±0.33

*和**分別表示在0.05水平和0.01水平上差異顯著。

*and**mean significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively.

2　結(jié)果與分析

2.1基因序列分析和分子標(biāo)記設(shè)計(jì)

DNA序列分析表明GS5共有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因的基因組DNA有37處序列變異，其中25個(gè)變異發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)，已有研究證實(shí)啟動(dòng)子區(qū)域的序列變異對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄水平有著重要的影響[10, 12]。除此之外，9個(gè)變異發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域，3個(gè)變異發(fā)生在外顯子區(qū)域。內(nèi)含子在基因轉(zhuǎn)錄為成熟RNA時(shí)會(huì)被剪切掉，但是這些外顯子區(qū)的變異對(duì)籽粒性狀有何作用還不清楚。以寬粒珍汕97的GS5基因組序列JN256058作為參照，第1外顯子28 bp處、第2外顯子817 bp處和第9外顯子3796 bp處分別有6 bp(GCGGCG)的插入、三堿基(ACC/CTA)變異和單堿基(A/C)變異。這3處變異都引起氨基酸序列的變化，其中前兩個(gè)變異高度相關(guān)。因此，本研究對(duì)基因GS5的第2和第9外顯子的兩個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)分別開(kāi)發(fā)了CAPS標(biāo)記GS5-1和dCAPS標(biāo)記GS5-2(表1)。

對(duì)于GS5第2外顯子817 bp處的ACC/CTA變異而言，利用標(biāo)記GS5-1在水稻品種中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為225 bp的PCR產(chǎn)物(圖1-A的泳道1和2)，經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶DdeⅠ酶切后，能夠被切成196 bp條帶的水稻品種為珍汕97，其基因型為CTA(圖1-A的泳道4)；PCR產(chǎn)物仍為225 bp的水稻品種為日本晴，其基因型為ACC(圖1-A的泳道3)。

對(duì)于GS5第9外顯子3796 bp處的A/C單堿基變異而言，我們利用標(biāo)記GS5-2在水稻品種中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為188 bp的PCR產(chǎn)物(圖1-B的泳道1和2)，經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶SalⅠ酶切后，能夠被切成169 bp條帶的水稻品種為珍汕97，其基因型為C(圖1-B的泳道4)；PCR產(chǎn)物仍為188 bp的水稻品種為日本晴，其基因型為A(圖1-B的泳道3)。

表3GS5不同單倍型籽粒粒形性狀的方差分析

Table 3． Analysis of variances (ANOVA) of different haplotypes in gene GS5.

籽粒性狀與變異來(lái)源Graintraitandsourceofvariation秈亞種indica自由度df平方和MeansquareF值Fvalue粳亞種japonica自由度df平方和MeansquareF值Fvalue粒長(zhǎng)Grainlength 單倍型間Amonghaplotypes30.9291.27232.4823.493* 單倍型內(nèi)Withinhaplotypes1540.7301320.711粒寬Grainwidth 單倍型間Amonghaplotypes30.5686.131**30.3773.940** 單倍型內(nèi)Withinhaplotypes1540.0931320.096粒厚Grainthickness 單倍型間Amonghaplotypes30.1297.354**30.0381.305 單倍型內(nèi)Withinhaplotypes1540.0181320.029長(zhǎng)寬比Ratiooflengthtowidth 單倍型間Amonghaplotypes31.4245.145**30.9735.141** 單倍型內(nèi)Withinhaplotypes1540.2771320.189千粒重1000-grainweight 單倍型間Amonghaplotypes331.5932.47034.1650.279 單倍型內(nèi)Withinhaplotypes15412.78813214.953

*和**分別表示在0.05水平和0.01水平上差異顯著。

*and**mean significant difference at the 0.05 and 0.01 levels, respectively.

表4GS5不同單倍型對(duì)水稻粒形性狀的差異顯著性分析

Table 4. Analysis of the difference of grain-related traits based on different haplotypes in geneGS5.

單倍型HaplotypeGS5-1GS5-2樣品數(shù)Number粒長(zhǎng)Grainlength/mm粒寬Grainwidth/mm粒厚Grainthickness/mm長(zhǎng)寬比Ratiooflengthtowidth千粒重1000-grainweight/g秈亞種indicaHap1ACCA578.61±0.14 2.74±0.04b2.00±0.02b3.20±0.08a23.07±0.52Hap2ACCC88.13±0.233.01±0.11a2.10±0.03ab2.75±0.18b23.60±0.41Hap3CTAA348.36±0.132.99±0.05a2.13±0.02a2.84±0.08b24.76±0.67Hap4CTAC598.38±0.102.93±0.04a2.09±0.01a2.89±0.06b24.65±0.41粳亞種japonicaHap1ACCA1027.70±0.08b3.23±0.03a2.20±0.02 2.41±0.04b25.68±0.40Hap2ACCC38.28±0.51a3.03±0.27b2.15±0.082.77±0.28a25.51±2.22Hap3CTAA188.19±0.22a3.01±0.04b2.12±0.032.73±0.09a24.80±0.85Hap4CTAC138.28±0.18a3.03±0.09b2.14±0.032.77±0.14a25.76±0.76

表中籽粒相關(guān)性狀的數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。數(shù)據(jù)后跟相同小寫(xiě)字母表示差異未達(dá)顯著水平(最小顯著差數(shù)法)。

All data about grain-related traits were given as mean±SE. Values followed by common lowercase letters are not significantry different by least significant difference(LSD) test.

2.2GS5不同變異位點(diǎn)對(duì)水稻粒形性狀的影響

為了解析GS5第2和第9外顯子的兩個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)水稻籽粒相關(guān)性狀的影響，我們利用標(biāo)記GS5-1和GS5-2分別對(duì)水稻微核心種質(zhì)的基因型進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的不同變異類型進(jìn)行了t測(cè)驗(yàn)。從表2中可以看出，GS5的第2和第9外顯子的兩個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)水稻籽粒的粒長(zhǎng)、粒寬和長(zhǎng)寬比的影響達(dá)到了顯著或極顯著的水平；但這兩個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)水稻千粒重的影響沒(méi)有達(dá)到顯著水平，這表明GS5的第2和第9外顯子的兩個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)水稻籽粒的粒形性狀均有重要影響。

2.3基因GS5的單倍型類型及其效應(yīng)分析

為了進(jìn)一步明確GS5這兩個(gè)變異位點(diǎn)的不同組合(單倍型)對(duì)水稻籽粒相關(guān)性狀的效應(yīng)，我們依據(jù)這兩個(gè)變異位點(diǎn)在水稻微核心種質(zhì)中的不同組合將GS5分成了4個(gè)單倍型(表4)。鑒于秈粳亞種間的籽粒性狀差異明顯，我們進(jìn)一步利用GS5的4個(gè)單倍型對(duì)水稻微核心種質(zhì)按秈粳亞種分別進(jìn)行了方差分析(表3)和多重比較(表4)。

A-引物GS5-1的擴(kuò)增產(chǎn)物和DdeⅠ酶切電泳。B-引物GS5-2的擴(kuò)增產(chǎn)物和SalⅠ酶切電泳。M, DL2000 DNA 標(biāo)記(TaKaRa); 泳道1和3為水稻品種日本晴；泳道2和4為珍汕97。

A, PCR amplification products and their correspondingDdeⅠ-digested ones of primer GS5-1; B, PCR amplification products and their correspondingSalⅠ-digested ones of primer GS5-2. M, DL2000 DNA Marker(TaKaRa). Lanes 1 and 3, Nipponbare; Lanes 2 and 4, Zhenshan 97.

圖1水稻基因GS5特異引物GS5-1(A)和GS5-2(B)的PCR擴(kuò)增和酶切鑒定

Fig. 1. PCR identification and enzyme-digested characterization of specific primers GS5-1(A) and GS5-2(B) for gene GS5 in rice.

在水稻秈亞種中，從表3中可以看出，GS5的不同單倍型在粒寬、粒厚和籽粒長(zhǎng)寬比這3個(gè)粒形性狀都存在極顯著的差異。表4的多重比較進(jìn)一步表明GS5的不同單倍型對(duì)上述3個(gè)粒形性狀也有著不同程度的影響，其中，以單倍型Hap1的粒寬最小，粒厚最小，長(zhǎng)寬比最大。

在水稻粳亞種中，從表3中可以看出，GS5的不同單倍型在粒厚和籽粒長(zhǎng)寬比這2個(gè)粒形性狀上都存在極顯著的差異，在粒長(zhǎng)性狀上也存在顯著的差異。表4的多重比較進(jìn)一步表明GS5的不同單倍型對(duì)上述3個(gè)粒形性狀也有著不同程度的影響，其中，以單倍型Hap1的粒長(zhǎng)最小、粒寬最大，長(zhǎng)寬比最小。這些結(jié)果表明水稻秈粳亞種間調(diào)控粒形性狀的遺傳基礎(chǔ)有所差異。

2.4近年來(lái)江蘇育成品種的GS5單倍型分析

為了更好地將上述研究結(jié)果應(yīng)用到江蘇省的水稻育種實(shí)踐中，我們對(duì)2007-2013年江蘇省審定的65份粳稻品種GS5的兩個(gè)目標(biāo)變異位點(diǎn)進(jìn)行了基因型測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)近年來(lái)江蘇省審定的粳稻品種中，只有1個(gè)水稻品種(鎮(zhèn)稻13)利用GS5的Hap2單倍型，而其余64個(gè)水稻品種為同一單倍型(Hap1)。這表明江蘇省近年來(lái)育成水稻品種利用粒形基因GS5的等位變異較少。

3　討論

在過(guò)去的十年間，隨著水稻基因組的快速發(fā)展，許多粒形相關(guān)的QTL被定位和克隆。與粒寬有關(guān)的基因?yàn)镚W8[3]、GW7[4]、qSW5/GW5[8, 9]、GS5[10]、GW2[15]、GS6[16]；與粒長(zhǎng)有關(guān)的基因?yàn)镚S3[6]、qGL3/qGL3.1[7, 17, 18]；與籽粒充實(shí)有關(guān)的基因?yàn)镚S5[10]、GIF1[19]。這些基因通過(guò)調(diào)節(jié)水稻籽粒的大小和形狀(即粒形)，提高千粒重，進(jìn)而提高了水稻的產(chǎn)量水平。除GS5和GW8為正調(diào)控因子外，其余基因?qū)λ玖Ｐ味计鹭?fù)調(diào)控作用。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，將窄粒品種H94的GS5的cDNA片段接到35S啟動(dòng)子或來(lái)源于寬粒品種珍汕97基因GS5的啟動(dòng)子下，構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)為粒寬增加和粒重提高，這表明啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率的高低是影響GS5調(diào)控粒寬和粒重的主要因素。本研究中利用水稻微核心種質(zhì)，我們也發(fā)現(xiàn)GS5的第2和第9外顯子兩個(gè)錯(cuò)義突變對(duì)水稻粒長(zhǎng)、粒寬和長(zhǎng)寬比性狀上存在顯著或極顯著的差異。在GS5的單倍型分析時(shí)，秈亞種的不同單倍型在粒寬、粒厚和長(zhǎng)寬比性狀上存在極顯著的差異；粳亞種的不同單倍型在粒寬和長(zhǎng)寬比性狀上存在極顯著的差異，在粒長(zhǎng)性狀上存在顯著的差異；不論秈亞種和粳亞種，不同單倍型對(duì)粒重的影響沒(méi)有達(dá)到顯著水平，這可能是因?yàn)樗镜那ЯＶ厥芏鄠€(gè)基因位點(diǎn)調(diào)控，且與粒形性狀有著不同的調(diào)控機(jī)制，導(dǎo)致在遺傳背景復(fù)雜的水稻微核心種質(zhì)中，難以準(zhǔn)確檢測(cè)GS5對(duì)水稻千粒重的效應(yīng)。

雖然許多與水稻產(chǎn)量相關(guān)的重要功能粒形基因已被克隆，但是當(dāng)前水稻育種工作中還很少涉及到這些基因，其原因主要是這些基因缺乏成本低廉且簡(jiǎn)便實(shí)用的基因功能標(biāo)記，這些基因有多少等位變異類型及其效應(yīng)如何等等。利用近等基因系和轉(zhuǎn)基因的方法，Li等[10]證實(shí)了GS5的啟動(dòng)子變異是該基因?qū)λ玖Ｐ纹鹱饔玫闹饕颉u等[12]進(jìn)一步通過(guò)截短啟動(dòng)子的方法證實(shí)啟動(dòng)子區(qū)的-1109 bp和-1032 bp的兩處單堿基變異對(duì)GS5的表達(dá)水平有重要的影響。本研究發(fā)現(xiàn)GS5的第2和第9外顯子的兩個(gè)錯(cuò)義突變對(duì)水稻粒形性狀也有著明顯的效應(yīng)，為此我們分別開(kāi)發(fā)了基于這些序列變異的PCR標(biāo)記，為其應(yīng)用到水稻育種實(shí)踐提供了便利的選擇方法，但是其遺傳機(jī)理還值得深入研究。

謝辭：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李自超教授和張洪亮博士提供了水稻微核心種質(zhì)；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院王軍博士提供了2007-2013年江蘇省審定的粳稻品種，在此一并表示感謝。

[1]Qiu X, Pang Y, Yuan Z, et al. Genome-wide association study of grain appearance and milling quality in a worldwide collection ofindicarice germplasm.PLoSOne, 2015, 10(12): e0145577.

[2]徐正進(jìn), 陳溫福, 馬殿榮, 等. 稻谷粒形與稻米主要品質(zhì)性狀的關(guān)系. 作物學(xué)報(bào), 2004, 30(9): 894-900.

Xu Z J, Chen W F, Ma D R, et al. Correlations between rice grain shapes and main qualitative characteristics.ActaAgronSin, 2004, 30(9): 894-900.

[3]Wang S, Wu K, Yuan Q, et al. Control of grain size, shape and quality byOsSPL16 in rice.NatGenet, 2012, 44(8): 950-954.

[4]Wang S, Li S, Liu Q, et al. TheOsSPL16-GW7 regulatory module determines grain shape and simultaneously improves rice yield and grain quality.NatGenet, 2015, 47(8): 949-954.

[5]Zuo J, Li J. Molecular genetic dissection of quantitative trait loci regulating rice grain size.AnnuRevGenet, 2014, 48: 99-118.

[6]Fan C, Xing Y, Mao H, et al.GS3, a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembrane protein.TheorApplGenet, 2006, 112(6): 1164-1171.

[7]Zhang X, Wang J, Huang J, et al. Rare allele ofOsPPKL1 associated with grain length causes extra-large grain and a significant yield increase in rice.ProcNatlAcadSciUSA, 2012, 109(52): 21534-21539.

[8]Shomura A, Izawa T, Ebana K, et al. Deletion in a gene associated with grain size increased yields during rice domestication.NatGenet, 2008, 40(8): 1023-1028.

[9]Weng J, Gu S, Wan X, et al. Isolation and initial characterization ofGW5, a major QTL associated with rice grain width and weight.CellRes, 2008, 18(12): 1199-1209.

[10]Li Y, Fan C, Xing Y, et al. Natural variation inGS5 plays an important role in regulating grain size and yield in rice.NatGenet, 2011, 43(12): 1266-1269.

[11]Ishimaru K, Hirotsu N, Madoka Y, et al. Loss of function of the IAA-glucose hydrolase geneTGW6 enhances rice grain weight and increases yield.NatGenet, 2013, 45(6): 707-711.

[12]Xu C, Liu Y, Li Y, et al. Differential expression ofGS5 regulates grain size in rice.JExpBot, 2015, 66(9): 2611-2623.

[13]Zhang H, Zhang D, Wang M, et al. A core collection and mini core collection ofOryzasativaL. in China.TheorApplGenet, 2011, 122(1): 49-61.

[14]王軍, 楊杰, 徐祥, 等. 水稻千粒重基因TGW6功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與利用. 中國(guó)水稻科學(xué), 2014, 28(5): 473-478.

Wang J, Yang J, Xu X, et al. Development and application of a functional marker for grain weight geneTGW6 in rice.ChinJRiceSci, 2014, 28(5): 473-478.

[15]Song X, Huang W, Shi M, et al. A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase.NatGenet, 2007, 39(5): 623-630.

[16]Sun L, Li X, Fu Y, et al.GS6, a member of theGRASgene family, negatively regulates grain size in rice.JIntegrPlantBiol, 2013, 55(10): 938-949.

[17]Qi P, Lin Y S, Song X J, et al. The novel quantitative trait locusGL3.1 controls rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1;3.CellRes, 2012, 22(12): 1666-1680.

[18]Hu Z, He H, Zhang S, et al. A Kelch motif-containing serine/threonine protein phosphatase determines the large grain QTL trait in rice.JIntegrPlantBiol, 2012, 54(12): 979-990.

[19]Wang E, Wang J, Zhu X, et al. Control of rice grain-filling and yield by a gene with a potential signature of domestication.NatGenet, 2008, 40(11): 1370-1374.

Development of Functional Markers and Identification of Haplotypes for Rice Grain Width Gene GS5

YI Chuan-deng*, WANG De-rong, JIANG Wei, LI Wei, CHENG Xiao-jun, WANG Ying, ZHOU Yong,LIANG Guo-hua, GU Ming-hong

(Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops/Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;*Corresponding author， E-mail: cdyi@yzu.edu.cn)

As a major component of rice grain shape, the grain width is an important trait which is correlated with the rice yield and quality. Based on the alignment of geneGS5 genomic DNA sequence, two functional markers were developed based on two missense polymorphisms (ACC/CTA in the exon2, A/C in the exon9, respectively). Subsequently, the markers were used to identify the genotypes of geneGS5 in the 294 accessions of a rice mini-core collection and 65japonicavarieties released in Jiangsu Province from 2007 to 2013. We found that the allelic variations at the two target loci had significant or extremely significant differences in the grain shape traits(grain length, grain width and ratio of length to width). Based on the two variation sites of geneGS5, four haplotypes (combinations) were found in the rice mini-core collection, and had extremely significant effect on grain width, grain thickness and ratio of length to width in theindicagroup, and on grain width and ratio of length to width in thejaponicagroup, respectively. While injaponicavarieties released by Jiangsu, only two haplotypes, Hap1 (represented by 64 varieties) and Hap2 (represented by one variety) were found. The results will lay a foundation for the application of the useful allelic variations or haplotypes of geneGS5 to the rice yield and quality breeding program.

rice; grain shape; geneGS5; functional markers; haplotype

2016-03-07； 修改稿收到日期: 2016-04-12。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31571624, 31071382)； 國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2010CB125904, 2013CBA01405)； 江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(15KJA210004)； 江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目(BE2015341)； 江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

Q755; S511.032

A

1001-7216(2016)05-0487-06

裔傳燈, 王德榮, 蔣偉，等. 水稻粒寬基因GS5的功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)和單倍型鑒定. 中國(guó)水稻科學(xué)， 2016， 30(5)： 487-492.