丁慧　俞咪娜　王亞會　于俊杰　尹小樂　薄惠文　黃星　劉永鋒,*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所， 南京 210014；*通訊聯(lián)系人, E-mail:liuyf@jaas.ac.cn)

?

稻曲病菌T-DNA插入突變體B2510的插入位點(diǎn)分析

丁慧1,2俞咪娜2王亞會2于俊杰2尹小樂2薄惠文1,2黃星1劉永鋒2,*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所， 南京 210014；*通訊聯(lián)系人, E-mail:liuyf@jaas.ac.cn)

DING Hui, YU Mina, YU Junjie,et al. Molecular characterization ofUstilaginoideavirensT-DNA insertion mutant B2510. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 541-551.

以稻曲病菌T-DNA插入突變體庫中致病力減弱突變菌株B2510為材料，通過分析T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列和突變基因，分離出在稻曲病菌致病過程中起作用的基因。通過測定突變菌株B2510的生長速率、產(chǎn)孢能力及致病力發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株P(guān)1相比，B2510田間接種表現(xiàn)為致病性減弱；在MM培養(yǎng)基上生長速率下降，而在PSA和TB3培養(yǎng)基中生長速率與野生型沒有顯著差異，但喪失產(chǎn)孢能力。Southern雜交顯示T-DNA在突變菌株B2510中以雙拷貝形式插入，利用TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增緊鄰T-DNA兩側(cè)的側(cè)翼序列，經(jīng)過比對分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA分別插在基因UV8b_1412的啟動子區(qū)域和UV8b_1386的下游3′端，且稻曲菌基因組序列均未丟失，T-DNA上只有幾個堿基發(fā)生變化。半定量RT-PCR分析基因的表達(dá)情況，顯示兩個基因在突變體B2510的表達(dá)量較P1均顯著下降，推測T-DNA插入位點(diǎn)處的基因與稻曲病菌致病性相關(guān)，可能在某一階段參與調(diào)控稻曲病菌在水稻上的致病過程。

稻曲病菌； T-DNA插入突變； ATMT轉(zhuǎn)化； 致病力； 側(cè)翼序列

水稻稻曲病是一種穗部病害，隨著氣候的變化、施肥水平的增加等一些因素[1]，稻曲病發(fā)生頻率上升，危害日益加重，已由次要病害上升為主要病害。稻曲病菌(Ustilaginoideavirens)侵染稻?？尚纬珊稚聊G色的稻曲球，造成空秕率上升、千粒重下降，嚴(yán)重影響水稻品質(zhì)和產(chǎn)量[2, 3]。而且稻曲球中還有稻曲菌素[4, 5]，能抑制微管蛋白組裝，干擾細(xì)胞骨架形成，對人畜產(chǎn)生危害。因此，深入了解稻曲病的致病機(jī)理，可為抗病水稻的育種和新靶標(biāo)藥劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

目前，稻曲病菌的研究大都集中在其生物學(xué)特性[6]、侵染循環(huán)[7, 8]和病害防治[9, 10]及稻曲毒素[5, 11, 12]等方面，而對稻曲病菌的致病機(jī)理方面的了解比較缺乏。張震等[13]根據(jù)稻瘟病菌中PMK1的保守序列，克隆到了稻曲病菌的UVMK1基因，同時在稻瘟病菌中進(jìn)行了功能驗證；此外還通過構(gòu)建稻曲病菌的cDNA文庫，克隆到參與致病和防御過程中的R5基因[14]。劉聯(lián)盟等[15]根據(jù)絲狀真菌G蛋白β亞基編碼基因的同源保守序列設(shè)計簡并引物，結(jié)合TAIL-PCR技術(shù)獲得了其序列，為稻曲病菌致病機(jī)理的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation，ATMT)是分離與鑒定病原菌的致病相關(guān)基因的一種有效途徑[16]。通過ATMT方法將 T-DNA 隨機(jī)插入到真菌的基因組中，構(gòu)建突變體庫，并根據(jù)突變體的表型篩選獲得相關(guān)功能基因，已經(jīng)在多個真菌中實現(xiàn)。Nakamura等[17]通過篩選刺盤孢菌(Colletotrichumsansevieriae)ATMT突變體庫，研究了病原菌的致病相關(guān)基因；吳小燕等[18]通過篩選稻瘟病菌ATMT庫，獲得一株致病性增強(qiáng)的菌株，成功克隆并分析了相關(guān)基因MgThiJ1。稻曲病菌的ATMT方法也成功建立[19]。于俊杰等[20]研究分生孢子高產(chǎn)ATMT突變菌株 A2588，克隆到相關(guān)基因，并分析該基因在稻曲病菌分生孢子形成中的功能。俞咪娜等[21]通過篩選得到致病力增強(qiáng)菌株5062，克隆和分析了 T-DNA插入?yún)^(qū)域的相關(guān)基因，為稻曲病菌致病機(jī)理的解析、致病相關(guān)基因克隆奠定基礎(chǔ)。王亞會等[22]對致病力喪失突變菌株B1464從生物學(xué)形態(tài)和分子遺傳變異方面進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)T-DNA的插入導(dǎo)致了染色體重排，并破壞了C2H2鋅指蛋白、蘋果酸合成酶等基因的正常表達(dá)。

為深入認(rèn)識稻曲病菌在水稻上的侵染和致病機(jī)制，我們通過研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入稻曲病菌致病力減弱突變體B2510的生物學(xué)特性，并利用TAIL-PCR技術(shù)克隆B2510基因組的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，RT-PCR檢測突變基因表達(dá)量變化，分離并解析了可能與稻曲病菌致病相關(guān)的新的基因，在分子水平上為水稻抗稻曲病菌的育種和稻曲病的防治提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株與水稻

稻曲病菌的野生菌株P(guān)1，分離自田間自然發(fā)病的稻曲球上并取單胞菌株保存。致病力減弱突變菌株B2510(由本實驗室通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化P1得到一個突變體庫，并經(jīng)過田間致病力測驗篩選獲得)，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害與生物防治實驗室保存。稻曲病菌ATMT突變體獲得的具體方法參照Mullins等[23]的方法進(jìn)行。常規(guī)DNA片段轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌E.colitrans T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

稻曲病菌致病性檢測采用感病水稻品種兩優(yōu)培九。

1.2試劑

本研究的引物合成(表1)及測序由Invitrogen公司完成；限制性內(nèi)切酶SalⅠ、HindⅢ和RNA提取用的Trizol、用于RT-PCR的RNA反轉(zhuǎn)錄酶(PrimeScript Reverse Transcriptase)均購自TaKaRa公司；PCR所用的TaqDNA聚合酶和連接所需的pEASY-T1 載體均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Southern 雜交試劑盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ)購自Roche公司，雜交用的帶正電荷尼龍膜(Hybond N+)購自上海索萊寶生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自東盛生物科技有限公司。其他生化試劑購于美國的Sigma公司或國產(chǎn)分析純。

1.3稻曲病菌突變體表型測定

取保存的原始菌株P(guān)1和突變菌株B2510，分別接種至PSA固體培養(yǎng)基(200 g/L馬鈴薯煮汁，20 g/L蔗糖，12 g/L瓊脂)上活化，28℃培養(yǎng)15 d后，在菌落生長邊緣處取菌碟(打孔器內(nèi)徑為3.5 mm)，用于生物學(xué)特性、致病力測定。以上各處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3.1菌株生長速率測定

取上述菌碟，分別接至PSA、TB3、MM固體培養(yǎng)基上，28℃避光培養(yǎng)20 d后觀察菌落形態(tài)，測量菌落直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.3.2菌株分生孢子和菌絲形態(tài)觀察

分別將P1和突變菌株B2510接種至含50 mL PS液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中， 130 r/min搖培7 d，通過顯微鏡(10 × 40)觀察分生孢子數(shù)量和測量菌絲直徑，每次取10段不同菌絲。

表1引物列表

Table 1． Primers applied in the research.

引物名稱Name引物序列Sequence(5’→3’)hyg1.4F[21]ACAGAAGATGATATTGAAGGAGChyg1.4R[21]TACTCTATTCCTTTGCCCTCGLAD8[21]ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNACGTG*LAD10[21]ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT*GFP-1[21]CCATCCTGGTCGAGCTGGAGFP-2[21]CGAACTCCAGCAGGACCATGGRB3[21]TGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCHLB1[21]GATTCCCAATACGAGGTCGCCAAHLB2[21]TGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGHLB3[21]AGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGAAC-S2[21]GAGTTTAGGTCCAGCGTCCGTCGACGATGGACTCCAGAGAC-S3[21]GAGTTTAGGTCCAGCGTCCGT8H1CGAGTTCCAACAGACCCCTA8R1ATGGCCAAACTTCAACCCTT10H1ATGGACCAGCCACAACTAAA10R1TGTCAAAGATGCAAGGTCART-1FGACCTTTTGTTCCGAGCCATRT-1RGTCTTTGGCGGGTTTATCAGRT-U-1ACCGCTTCAGCAGATGGGRT-U-2GGCGTCTGCTACTCGCTCTART-D-1GTCCCCTCAGGTCGCAATAGRT-D-2TAAGTTCCCTCCCACCAGCCα-tubulin2F[24]GGCGTTTACAATGGCACTTCα-tubulin2RCGGAACAGTTGACCAAAAGG

*B=T, C or G; N=A, T, C or G.

1.4菌株致病性測定方法

參考張君成等[24]的稻曲病菌接種方法，取1.3中所用野生菌株P(guān)1和突變菌株B2510的菌碟各2個，分別接種至PS培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)，7 d后將含有孢子和菌絲的混合培養(yǎng)液接種水稻感病品種兩優(yōu)培九。每個菌株接10穗，每穗接種1 mL菌絲和孢子混合培養(yǎng)液。接種試驗重復(fù)3次，分別接種于2014年8-9月江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田內(nèi)3個批次的水稻，21 d后調(diào)查水稻的發(fā)病情況。

1.5PCR檢測和Southern雜交

接種菌絲塊置于50 mL PS培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)7 d后收集菌絲體，采用CTAB法提取菌株基因組DNA。以P1為對照，PCR檢測突變體中的綠色熒光蛋白基因GFP(擴(kuò)增引物為GFP-1和GFP-2)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因HPH(擴(kuò)增引物為hyg1.4F和hyg1.4R)[21]。反應(yīng)體系如下：2.5 μL 10×TransTaqHiFi PCR 緩沖液，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，引物各1 μL，0.5 μL HiFi DNA 聚合酶(5 U/L)，1 μL基因組DNA，去離子水補(bǔ)齊25 μL。PCR條件：94℃下預(yù)變性4 min, 94℃下30 s, 60℃下60 s, 72℃下1.5 min (35個循環(huán)), 72℃下10 min。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

用引物hyg1.4F和hyg1.4R進(jìn)行PCR，擴(kuò)增pCAMBIA1300質(zhì)粒中的HPH基因片段，回收產(chǎn)物。參照Southern雜交試劑盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ)，將回收產(chǎn)物用DIG標(biāo)記作為探針，使用終濃度為25 ng /mL。將約為5 μg B2510和P1的基因組DNA分別用SalⅠ、Hind Ⅲ單酶切過夜后，經(jīng)過0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，通過鹽橋法將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，DNA通過紫外交聯(lián)固定在尼龍膜上后，參照上述試劑盒提供的方法對附有DNA的尼龍膜進(jìn)行預(yù)雜交、雜交，洗滌，顯色。

1.6突變菌株側(cè)翼序列的克隆及分析

利用TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced-PCR)法，采用簡并引物L(fēng)AD8和LAD10和特異性引物HLB1 / HLB2 / HLB3擴(kuò)增插入的T-DNA片段的LB端鄰接稻曲病菌序列，以稻曲病菌基因組DNA為模板擴(kuò)增突變菌株T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列。TAIL-PCR方法參照Mullins等[23]，具體引物序列見表1。

根據(jù)插入位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列分別設(shè)計引物8H1/8R1和10H/10R1。反應(yīng)體系如下： 5 μL 10×TransTaqHiFi PCR 緩沖液，4 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，引物各1 μL，0.5 μL HiFi DNA 聚合酶(5 U/L)，1 μL基因組DNA，去離子水補(bǔ)齊50 μL。PCR條件：94℃下預(yù)變性4 min，94℃下 30 s，60℃下 60 s，72℃下 4 min(35個循環(huán))，72℃下10 min。使用的引物分別是8H1/8R1， GRB3/ 8R1和10H1/10R1，GRB3/10R1, PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收(參照說明書)，測序。

RT-PCR選用的RNA提取選用搖培4 d的菌絲體，采用Trizol法提取野生型菌株P(guān)1和突變菌株B2510的總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄方法參照試劑盒說明書。測序結(jié)果參照稻曲病菌的全基因組序列以及轉(zhuǎn)錄組序列，進(jìn)行序列相似性比對和分析采用NCBI網(wǎng)站BLAST、ORF Finder等程序完成。

2　結(jié)果與分析

2.1突變菌株分子檢測

為了確定T-DNA是否穩(wěn)定地插入突變菌株中，將突變菌株在無潮霉素的PSA平板上經(jīng)5輪傳代培養(yǎng)后，再用CTAB法分別提取野生型菌株P(guān)1和突變菌株B2510基因組DNA，通過引物GFP-1/GFP-2和hyg1.4F/hyg1.4R分別對其進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)增出約600 bp和約1 400 bp長的GFP基因和HPH基因片段(圖1-A)，而在野生型菌株P(guān)1中沒有擴(kuò)增到條帶。Southern雜交檢測T-DNA在突變菌株B2510的拷貝數(shù)，結(jié)果表明T-DNA已經(jīng)整合到稻曲病菌基因組中，且突變體中的T-DNA為雙拷貝插入(圖1-B)，這有利于后續(xù)T-DNA插入位點(diǎn)的分析和相關(guān)基因功能的研究。

2.2突變菌株B2510致病力減弱

田間分別接種突變菌株B2510和野生型菌株P(guān)1的菌絲和孢子混合液，21 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，接種突變菌株B2510的水稻平均每穗有2個病粒，而接種菌株P(guān)1的水稻平均每穗有25個病粒，即突變菌株B2510的致病能力減弱(圖2)。由此推測，外源T-DNA的插入可能影響到某個致病相關(guān)的正調(diào)控基因，從而減弱了菌株在水稻上的致病能力。

A-PCR檢測，其中泳道1、3分別為以P1為模板檢測GFP基因和HPH基因； 泳道2、4分別為以B2510為模板檢測GFP基因和HPH基因。B-Southern雜交檢測，其中泳道1為P1基因組SalⅠ、Hind Ⅲ雙酶切后HPH基因Southern雜交；泳道2、3分別為B2510基因組SalⅠ、HindⅢ酶切后HPH基因Southern雜交。

A, PCR analysis of theGFPgene andHPHgene. Lanes 1 and 2, PCR detection of theGFPgenes of P1 and B2510, respectively. Lanes 3 and 4, PCR detection of theHPHof P1 and B2510. Lane M, DNA marker; B， Southern blot detection of B2510, showing that a double T-DNA insertion event occurred in the B2510 genome. Lane 1, Genomic DNA of P1 was digested withSalⅠ andHind Ⅲ. Lanes 2 and 3, Genomic DNA of B2510 was digested withSalⅠ,HindⅢ, respectively.

圖1稻曲病菌突變菌株B2510的分子檢測

Fig. 1. Molecular detection of mutant strain B2510.

A-突變菌株B2510接菌稻穗上的稻曲球數(shù)顯著少于野生菌株P(guān)1。粗箭頭所指為稻曲球； B-突變菌株B2510和野生菌株P(guān)1分別接種兩優(yōu)培九后病粒數(shù)統(tǒng)計。**表示極顯著性差異，P< 0.05。

A,Number of diseased grains caused by the mutant strain B2510 was significantly decreased than that of wild strain P1. The coarse black arrows indicate false smut balls; B, Statistical analysis of the number of diseased grains per panicle on Liangyoupeijiu.**shows significant difference at 0.05 level.

圖2突變菌株B2510的致病性測定

Fig. 2. Pathogenicity test of the mutant strain B2510.

2.3突變菌株表型分析

將突變菌株B2510與野生菌株P(guān)1分別接種在PSA、TB3、MM培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后測量菌落直徑。突變菌株B2510在營養(yǎng)較豐富的PSA和TB3培養(yǎng)基上，與野生型菌株P(guān)1相比，生長速率和菌落色澤沒有顯著差異，但其菌落形態(tài)上明顯不同，菌絲生長得更致密且生成褶皺。在MM培養(yǎng)基上，突變菌株B2510的菌落形態(tài)與野生型菌株P(guān)1相比，菌絲沒有徑直往外延伸，從而顯得更稠密。B2510的生長速度較慢，菌落直徑為18.81 mm，野生菌株P(guān)1對應(yīng)的菌落直徑為25.92 mm(圖3-A、B)，兩菌株在生長速率上差異極顯著。

將B2510和P1分別進(jìn)行液體PS培養(yǎng)液搖培，6 d后，取菌液用血球計數(shù)板計算產(chǎn)分生孢子量，并觀察孢子形態(tài)。結(jié)果顯示，突變菌株B2510不產(chǎn)生分生孢子，只產(chǎn)生菌絲(圖3-C)。通過顯微鏡測量比較后發(fā)現(xiàn)(圖3-D)，B2510的菌絲比P1小，且差異極顯著。由此推測，T-DNA的插入可能破壞了B2510基因組營養(yǎng)吸收、運(yùn)輸或利用相關(guān)基因，使其不能正常地使用環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致生長速率下降，產(chǎn)孢能力降低，菌絲生長異常，從而使其致病能力減弱。

2.4突變菌株T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列克隆與分析

TAIL-PCR是克隆T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的一種有效方法。首先，分別以P1和B2510的基因組DNA為模板，使用T-DNA特異性引物HLB1/HLB2/HLB3和簡并引物L(fēng)AD8和LAD10擴(kuò)增T-DNA的LB端側(cè)翼序列，得到長度分別為959 bp和1055 bp的兩段特異序列。將得到的兩段序列與農(nóng)桿菌雙元載體和稻曲病菌基因組序列進(jìn)行比對(圖4-A)，發(fā)現(xiàn)突變菌株中兩個T-DNA的LB端都只有末端4～6個堿基發(fā)生變化，獲得稻曲病菌基因組上序列長度分別為55 bp和210 bp。

將上述獲得的兩段 T-DNA 側(cè)翼序列與稻曲病菌全基因組序列進(jìn)行比對。根據(jù)得到的序列設(shè)計引物8R1和10R1，分別與引物GRB3擴(kuò)增P1和B2510基因組，得到插入位點(diǎn)的RB端序列分別為500 bp和300 bp左右(圖4-B、C)，比對發(fā)現(xiàn)T-DNA和稻曲基因組都沒有發(fā)生堿基丟失。

A-突變菌株B2510與野生菌株P(guān)1在MM、PSA 和TB3這三種不同培養(yǎng)基上菌落直徑的比較。在MM培養(yǎng)基中突變菌株B2510的生長速率明顯慢于P1，且差異極顯著；B-突變菌株B2510與P1分別在MM、PSA 和TB3不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài), 圖中標(biāo)尺=1 cm; C-在顯微鏡(10× 40)下觀察到的突變菌株B2510與P1孢子和菌絲，標(biāo)尺= 20 μm；D-突變菌株B2510與P1菌絲直徑的比較。

A, Difference of colony diameters between mutant strain B2510 and wild-type strain P1 on MM, PSA and TB3 medium. The growth rate of B2510 was significantly slower than that of P1; B, Colonies of mutant strain B2510 and P1 on different media; bar=1 cm; C, Analysis and comparison of conidium and hypha between mutant strain B2510 and P1 under microscope (10× 40); bar= 20 μm; D, Comparison of the sizes of hypha between mutant strain B2510 and P1.

圖3突變菌株B2510和野生菌株P(guān)1的菌絲生長及產(chǎn)孢特性分析

Fig. 3. Analysis of colonies and sporulation of mutant strain B2510 and wild-type strain P1.

根據(jù)上述得到的序列，設(shè)計引物8H1、10H1，分別和8R1、10 R1以P1和B2510基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果在B2510基因組中能擴(kuò)到約4 kb的條帶，經(jīng)測序驗證為目的片段；而在P1基因組中分別擴(kuò)增到1500 bp和1000 bp左右的片段(圖4-B、C)，經(jīng)測序驗證為稻曲病菌的序列。

2.5突變菌株T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼基因分析

將T-DNA插入的兩個側(cè)翼序列分別與稻曲病菌全基因組序列比對，得到兩個基因即UV8b_1412和UV8b_1386。BioEdit分析T-DNA插入位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在UV8b_1412基因中T-DNA插入到5′上游區(qū)域，距起始密碼子1069 bp(圖5-A、B)，Promoter 2.0 Prediction預(yù)測顯示T-DNA插入位點(diǎn)很有可能是啟動子區(qū)域。在UV8b_1386基因中T-DNA插入在距終止密碼子400 bp左右處。提取 PS 培養(yǎng)液中搖培 5 d 的稻曲病菌菌絲的RNA， 使用RT-1F/RT-1R和α-tubulin2F /α-tubulin2R引物對基因組表達(dá)量進(jìn)行半定量 RT-PCR 檢測，結(jié)果表明UV8b_1412基因表達(dá)水平明顯降低(圖 5-C)，推測該基因表達(dá)水平降低可能是導(dǎo)致產(chǎn)孢能力喪失、致病力減弱的原因之一。以同樣的方法設(shè)計引物RT-U-1/RT-U-2和RT-D-1/RT-D-2檢測UV8b_1386基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)基因5′端能正常表達(dá)，而3′端不表達(dá)(圖5-D)，推測該基因在突變體中不能形成完整的蛋白。

進(jìn)一步分析兩個基因UV8b_1412和UV8b_1386，發(fā)現(xiàn)UV8b_1412編碼區(qū)全長3646 bp，含有兩個分別為1278 bp和91 bp內(nèi)含子，基因編碼一個含758個氨基酸的C6 轉(zhuǎn)錄因子(GenBank: KDB17528.1)蛋白。將該蛋白與一些植物病原真菌中同源蛋白進(jìn)行氨基酸同源序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)稻曲病菌中的C6轉(zhuǎn)錄因子與其他真菌的同源性都很低，最高的是白僵菌(Beauveriabassiana)，為43%，可以看出UV8b_1412編碼的C6 轉(zhuǎn)錄因子在稻曲病菌中有一定的獨(dú)特性(圖6-A)。

A-突變體B2510中T-DNA插入的結(jié)構(gòu)以及各引物在基因組上的位置； B,C-PCR驗證T-DNA插入位點(diǎn)處右端的側(cè)翼序列，并分析T-DNA插入后的基因組序列變化。

A, Schematic diagram of T-DNA insertion event in mutant B2510 and the positions of primers on genome; B and C，Analysis of T-DNA right border flanking region and genome sequence after T-DNA insertion using PCR.

圖4突變菌株B2510 T-DNA 插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的擴(kuò)增與分析

Fig. 4. Cloning and analysis of T-DNA flanking region in mutant strain B2510.

UV8b_1386編碼區(qū)全長2691 bp，含有4個分別為128 bp、88 bp、66 bp和78 bp的內(nèi)含子，CDS序列編碼一個含776個氨基酸的類RasGTP酶激活蛋白(GenBank: KDB17502.1)。通過與一些真菌同源蛋白的氨基酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)(圖6-B)，其RasGTP酶激活蛋白與綠僵菌的同源性最高(96%)，親緣關(guān)系最近；且與其他真菌的同源性也很高，與里氏木霉(Trichodermareesei)、冬蟲夏草(Ophiocordycepssinensis)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的同源性分別為92%、90%和92%；與稻瘟病菌同源性最低，也達(dá)到88%，說明該蛋白在真菌生物中非常保守。

3　討論

T-DNA插入突變已經(jīng)成為標(biāo)記和分析功能基因的一種有效途徑，并廣泛應(yīng)用于植物、絲狀真菌等生物。本研究的菌株B2510就是通過該方法轉(zhuǎn)化野生型菌株P(guān)1篩選獲得的。通過生物學(xué)特性及T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼基因的分析，發(fā)現(xiàn)其在營養(yǎng)缺乏的條件下生長速率下降，說明T-DNA插入在一定程度上影響了營養(yǎng)的運(yùn)輸，這可能與致病力的減弱有關(guān)。

目前，對于稻曲病菌的傳播與侵染過程方面比較認(rèn)可的觀點(diǎn)是，稻曲病菌以菌核、厚垣孢子等形式在田間或稻種上越冬，次年在適宜條件下萌發(fā)，在芽期、苗期或孕穗期侵染水稻，或是隨風(fēng)飛散的各種形式的孢子落在孕穗期葉鞘內(nèi)或直接侵染花器致病[2, 24]。張君成等[24]認(rèn)為采用稻曲病菌分生孢子和菌絲混合液對水稻接種，可以得到較高的發(fā)病率，且在一定范圍內(nèi)孢子濃度越高越容易發(fā)病；李燕等[25]也證明了稻曲病菌的產(chǎn)孢量與致病力正相關(guān)，表明稻曲病菌的分生孢子在其侵染過程中起著重要作用。本研究中的B2510突變體喪失產(chǎn)孢能力，其致病力減弱，驗證了上述研究結(jié)果，同時也從另一方面說明單獨(dú)的稻曲病菌菌絲也可以侵染水稻并形成稻曲球。

A,B-兩個基因中 T-DNA插入位置； C,D-RT-PCR檢測突變菌株B2510中兩個基因的表達(dá)變化，α-tubulin為內(nèi)參基因。D中Uv8b_1386-Up指的是該基因5′端的表達(dá)量，Uv8b_1386-Down則是基因3′端的表達(dá)量。

A and B, Schematic diagram of T-DNA insertion event in the two genes; C and D, RT-PCR analysis of the expression level of the two genes in mutant strain B2510,α-tubulinwas used as the reference gene. In Fig.5-D,Uv8b_1386-Up indicates the expression of 5′ flanking region ofUv8b_1386, andUv8b_1386-Down, the expression of the gene 3′ flanking region.

圖5稻曲病菌突變菌株B2510中T-DNA 插入位點(diǎn)側(cè)翼基因分析

Fig. 5. Analysis of T-DNA flanking gene in U.virens mutant strain B2510.

C6 轉(zhuǎn)錄因子是一種類似GAL4調(diào)控的Zn2Cys6鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子。Zn2Cys6基序中的半胱氨酸與2個鋅離子結(jié)合,因而命名為Zn2Cys6鋅指蛋白,這類蛋白僅存在于真菌中,可參與調(diào)節(jié)真菌的基礎(chǔ)代謝、次級代謝、藥物抗性及減數(shù)分裂等過程,對其生長發(fā)育起到一定的影響[26]。C6 轉(zhuǎn)錄因子屬于真菌轉(zhuǎn)錄因子MHR超級家族,調(diào)控中間包含一個N端C6雙核簇結(jié)構(gòu)的同源區(qū)域[27, 28]。在稻瘟病菌上敲除該類轉(zhuǎn)錄因子，有部分突變體表現(xiàn)為生長速率減慢，產(chǎn)孢量減少，孢子萌發(fā)率及附著胞形成率降低，致病力減弱，說明Zn2Cys6鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子在一定程度上影響著稻瘟病菌的生長發(fā)育及致病性[29]。鏈孢霉中也發(fā)現(xiàn)一類GAL4類型的C6 鋅指簇蛋白，是 在分生孢子的萌發(fā)和生長調(diào)節(jié)過程中一種必需的轉(zhuǎn)錄因子[30]。Ras-GTP酶激活區(qū)域被稱為RasGAP[31, 32]，它綁定在Ras-GTP酶上，促進(jìn)GTP水解為GDP[33]。RasGTP酶在一些信號通路中作為分子開關(guān)，且當(dāng)GAP活性降低時，信號傳遞會延遲[34]。在曲霉屬和鐮刀菌屬中孢子形成和毒素產(chǎn)生都是在G蛋白信號通路上被調(diào)控的[35, 36]，RasGAP是G蛋白信號通路上的一個重要組成部分，因此也間接對真菌的生長起到一定的調(diào)控作用。 突變體B2510不能產(chǎn)生分生孢子，且菌絲直徑比P1小，可能是由于GAPA蛋白被破壞，使細(xì)胞中的某種物質(zhì)不能特異性結(jié)合在GAPA區(qū)域，導(dǎo)致傳遞信號的通路受阻，影響細(xì)胞骨架的形成和物質(zhì)的運(yùn)輸，從而對細(xì)胞的生長起到一定的抑制作用。

A-通過MEGA6程序計算其分散距離，制作稻曲病菌的C6 轉(zhuǎn)錄因子與其他16種不同真菌同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹；每個菌株后的號碼與GenBank中登記的一致。B-通過MEGA6程序計算其分散距離，制作稻曲病菌的類RasGTP酶激活蛋白與其他10種不同真菌同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹；每個菌株后的號碼與GenBank中登記的一致。

A, Phylogenetic tree of C6 transcription factor ofU.virensand 16 other species was constructed by observed divergency distance method in the program MEGA6. Numbers correspond to GenBank accession numbers. B, Phylogenetic tree of GTPase-activator protein for Ras-like GTPase containing protein ofU.virensand 10 other species was constructed by observed divergency distance method in the program MEGA6. Numbers correspond to GenBank accession numbers.

圖6基于蛋白氨基酸序列的稻曲病菌及其他多種真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

Fig. 6. Phylogenetic tree of U.virens and several fungi based on amino acid sequence of proteins.

本研究從稻曲病菌T-DNA插入突變體庫中篩選得到一株致病力減弱突變體B2510。對突變體B2510的生物學(xué)和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其與野生型相比表現(xiàn)為：喪失產(chǎn)孢能力，菌絲直徑變小；T-DNA雙拷貝插入基因組，且分別插在基因UV8b_1412的啟動子區(qū)域和UV8b_1386的下游3’端；兩個基因在突變體中的表達(dá)量均下降。由于T-DNA插入破壞了兩個基因，可能是單個基因或是兩個基因共同作用使突變體B2510的表型發(fā)生變化，要明確各個基因的功能，還有待后續(xù)通過基因敲除等方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。

[1]王文斌, 尹小樂, 李燕, 等. 影響稻曲病嚴(yán)重度主要因素的研究. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2014, 7(3): 1067-1071.

Wang W B, Yin X L, Li Y, et al. Study on main factors affecting severity of false smut.SouthwestChinaJAgricSci, 2014, 7(3) : 1067-1071.

[2]胡東維, 王疏. 稻曲病菌侵染機(jī)制研究現(xiàn)狀與展望. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(22): 4604-4611.

Hu D W, Wang S. Progress and perspectives in infection mechanism ofUstilaginoideavirens.SciAgricSin, 2012, 45(22): 4604-4611.

[3]李小娟, 劉二明, 肖啟明, 等. 稻曲病研究進(jìn)展. 農(nóng)藥研究與應(yīng)用, 2006, 10(3): 9-12.

Li X J, Liu E M, Xiao Q M,et al. Advances on studies about false smut of rice.AgrochemRes&Appl, 2006, 10(3): 9-12.

[4]祭芳, 曹歡, 徐劍宏, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測稻谷中的稻曲病菌毒素A和 D. 中國水稻科學(xué), 2012, 26(2): 246-250.

Ji F, Cao H, Xu J H,et al. Simultaneous quantitative determination of ustiloxin A and ustiloxin D in rice grains by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.ChinJRiceSci, 2012, 26(2): 246-250.

[5]尹小樂, 陳志誼, 劉永鋒, 等. 稻曲毒素 A 的相對含量分析及其與致病力的相關(guān)性. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(22): 4720-4727.

Yin X L, Chen Z Y, Liu Y F,et al. Detection of the relative content of ustiloxin A in rice false smut balls and correlation analysis between pathogenicity and ustiloxin A production ofUstilaginoideavirens.SciAgricSin, 2012, 45(22): 4720-4727.

[6]李燕, 尹小樂, 劉永鋒, 等. 稻曲病菌生物學(xué)特性與致病力相關(guān)性研究. 植物病理學(xué)報, 2012, 42(4): 353-364.

Li Y, Yin X L, Liu Y F, et al. Relativity of biological characteristics and pathogenicity ofUstilaginoideavirens.ActaPhytopatholSin, 2012, 42(4): 353-364.

[7]劉見平, 唐濤, 張松柏, 等.稻曲病初侵染源及病菌侵染適期初步研究. 雜交水稻, 2009, 24(1): 74-77.

Liu J P, Tang T, Zhang S B, et al. Priminary studies on initial infection sources and pathogen-infecting favorable stage for rice false smut.HybridRice, 2009, 24(1): 74-77.

[8]繆巧明. 稻曲病的侵染途徑研究. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1992, 7(1): 40-42.

Miao Q M. Studies on infection route of rice false smut.JYunnanAgricUniv, 1992, 7(1): 40-42.

[9]Chen Y, Zhang Y, Yao J, et al. Frequency distribution of sensitivity ofUstilaginoideavirensto four EBI fungicides, prochloraz, difenoconazole, propiconazole and tebuconazole, and their efficacy in controlling rice false smut in anhui province of China.Phytoparasitica, 2013, 41(3): 277-284.

[10]汪愛娟, 王國榮, 孫磊, 等. 稻曲病防治藥劑篩選及防控技術(shù)研究. 中國稻米, 2015, 21(6): 45-51.

Wang A J, Wang G R, Sun L,et al. The control technologies and fungicides screening for rice false smutUstilaginoideavirens.ChinaRice, 2015, 21(6): 45-51.

.[11]范允卿, 張舒, 喻大昭, 等. 稻曲病病原菌毒素研究進(jìn)展. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 51(21): 4701-4704.

Fan Y S, Zhang S, Yu D Z,et al. Research progress onUstilaginoideavirens.HubeiAgricSci, 2012, 51(21): 4701-4704.

[12]卞英芳, 于莎莎, 牟仁祥, 等. 高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法鑒定水稻稻曲病菌毒素. 色譜, 2015, 33(10): 1046-1050.

Bian Y F, Yu S S, Mou R X ,et al. Identification of ustiloxins in false smut balls of rice based on high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry.ChinJChrom, 2015, 33(10): 1046-1050.

[13]張震, 杜新法, 柴榮耀, 等. 稻曲病菌PMK1類同源基因克隆及在稻瘟病菌遺傳互補(bǔ)中的功能驗證. 微生物學(xué)報, 2008, 48(11): 1473-1478.

Zhang Z, Du X F, Chai R Y,et al. Cloning of a homologous gene ofMagnaporthegriseaPMK1 type MAPK fromUstilaginoideavirensand functional identification by complement inMagnaporthegriseacorresponding mutant.ActaMicrobiolSin, 2008, 48(11): 1473-1478.

[14]張震, 王教瑜, 杜新法, 等. 稻曲病菌cDNA文庫的構(gòu)建 . 植物病理學(xué)報, 2008(5): 462-467.

Zhang Z, Wang J Y, Du X F, et al. Construction of a cDNA library of the fungusUstilaginoideavirens.ActaPhytopatholSin, 2008(5): 462-467.

[15]劉連盟, 王玲, 黃雯雯, 等. 水稻稻曲病菌G蛋白β亞基基因的克隆、表達(dá)與序列分析. 中國水稻科學(xué), 2010, 24(4): 353-359.

Liu L M, Wang L, Hunag W W,et al. Cloning, expression and sequence analysis of G proteinβsubunit gene of rice false smut pathogenUstilaginoideavirens.ChinJRiceSci, 2010, 24(4): 353-359.

[16]Chen X L, Yang J, Peng Y L. Large-scale insertional mutagenesis inMagnaportheoryzaebyAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation.MetMolBiol, 2011, 722: 213-224.

[17]Masayuki N, Hideto K, Keisuke O, et al.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation for investigating pathogenicity genes of the phytopathogenic fungusColletotrichumsansevieriae.CurrMicrobiol, 2012, 65(2): 176-182.

[18]吳小燕, 王教瑜, 張震, 等. 稻瘟病菌致病性增強(qiáng)突變體B11的基因分析. 中國水稻科學(xué), 2009, 23(6): 611-615.

Wu X Y, Wang J Y, Zhang Z,et al. Analysis on gene locus ofMagnaportheoryzaeB11, a pathogenicity-enhanced mutant.ChinJRiceSci, 2009, 23(6): 611-615.

[19]張震, 杜新法, 柴榮耀, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化稻曲病菌. 中國水稻科學(xué), 2006, 20(4): 440-442.

Zhang Z, Du X F, Chai R Y,et al.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation of the pathogen ofUstilaginoideavirens.ChinJRiceSci, 2006, 20(4): 440-442.

[20]于俊杰, 聶亞鋒, 俞咪娜, 等. 稻曲病菌分生孢子高產(chǎn)突變體A2588的T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼基因分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(24): 5132-5141.

Yu J J, Nie Y F, Yu M N,et al. Characterization of T-DNA insertion flanking genes of enhanced-conidiationUstilaginoideavirensmutant A2588.SciAgricSin, 2013, 46(24): 5132-5141.

[21]俞咪娜, 胡建坤, 黃磊, 等. 稻曲病菌T-DNA插入突變體5062的插入位點(diǎn)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(9): 1790-1798.

Yu M N, Hu J K, Huang L,et al. Molecular characterization of T-DNA integration of theUstilaginoideavirensmutant 5062.SciAgricSin, 2013, 46(9): 1790-1798.

[22]王亞會, 劉永鋒, 陸凡, 等. 稻曲病菌 T-DNA 插入突變體 B1464 插入位點(diǎn)分析. 中國水稻科學(xué), 2015, 29(3): 311-318.

Wang Y H, Liu Y F, Lu f,et al. Molecular characterization of T-DNA integration intoUstilaginoideavirensmutant B1464.ChinJRiceSci, 2015, 29(3): 311-318..

[23]Mullins E D, Chen X, Romaine P , et al.Agrobacterium-mediated transformation ofFusariumoxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer.Phytopathology, 2008, 91(2): 173-180.

[24]張君成, 陳志誼, 張炳欣, 等. 稻曲病的接種技術(shù)研究. 植物病理學(xué)報, 2004, 34(5): 463-467.

Zhang J C, Chen Z Y, Zhang B X,et al. Inoculation techniques used for inducing rice false smut efficiently.CtaPhytopatholSin, 2004, 34(5): 463-467.

[25]李燕, 于俊杰, 劉永鋒, 等. 稻曲病菌產(chǎn)孢能力及致病力測定. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(20): 4166-4177.

Li Y, Yu J J, Liu Y F,et al. Determination of sporulation and pathogenicity ofUstilaginoideavirens.SciAgricSin, 2012, 45(20): 4166-4177.

[26]MacPherson S, Larochelle M, Turcotte B. A fungal family of transcriptional regulators: the zinc cluster proteins.MicrobiolMolBiolRev, 2006, 70(3): 583-604.

[27]Aron M B, Lu S, Anderson J B, et al. a conserved domain database for the functional annotation of proteins.NuclAcidsRes, 2011: D225-D229 .

[28]Marchler-Bauer A, Derbyshire M K, Gonzales N R, et al. CDD: NCBI's conserved domain database.NuclAcidsRes, 2014, 43 (D1): D222-D226.

[29]張莉林. 294 個稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄因子基因的敲除和功能分析. 杭州: 浙江大學(xué), 2013.

Zhang L L. Knock-out and functional analysis of 294 transcription factor genes inMagnaportheoryzae. Hangzhou: Zhejiang University, 2013.

[30]Bailey L A, Ebbole D J. The fluffy gene ofNeurosporacrassaencodes a Gal4p-type C6 zinc cluster protein required for conidial development.Genetics, 1998, 148(4): 1813-1820.

[31]Maruta H, Burgess A W. Regulation of the Ras signalling network.Bioessays, 1994, 16(7): 489-496.

[32]Wang Y, Boguski M, Riggs M, et al.Sar1, a gene fromSchizosaccharomycespombeencoding a protein that regulates ras1.CellReg, 1991, 2(6): 453-465.

[33]Bourne H R, Sanders D A, McCormick F. The GTPase superfamily: Conserved structure and molecular mechanism.Nature, 1991, 349(6305): 117-127.

[34]Colicelli J. Human RAS superfamily proteins and related GTPases.Science′sSTKE, 2004, 2004(250): RE13.

[35]Brodhagen M, Keller N P. Signalling pathways connecting mycotoxin production and sporulation.MolPlantPathol, 2006, 7(4): 285-301.

[36]Yu J H, Keller N. Regulation of secondary metabolism in filamentous fungi.AnnRevPhytopathol, 2005, 43(1): 437-458.

Molecular Characterization of Ustilaginoidea virens T-DNA Insertion Mutant B2510

DING Hui1,2, YU Mi-na2, WANG Ya-hui2, YU Jun-jie2, YIN Xiao-le2, BO Hui-wen1,2, HUANG Xing1, LIU Yong-feng2,*

(1College of Life Science， Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, E-mail: liuyf@jaas.ac.cn)

To isolate the gene concerned with molecular pathogenic process ofUstilaginoideavirens(U.virens) , T-DNA integration flanking sequence and the mutant genes of a mutant strain B2510 were analyzed. Compared with the wild-typeU.virensstrain P1, the pathogenicity of the mutant strain B2510 in the field was significantly decreased. The growth rate of B2510 on MM medium was slower than that of P1, but was not significantly different on PSA and TB3medium which were nutritionally endowed. The mutant strain B2510 did not produce conidiophores in PS broth medium. Genomic Southern bolt analysis confirmed that there were double T-DNA events inserted in genome of mutant strain B2510. The flankingU.virenssequences of T-DNA obtained by TAIL-PCR were adjacent in the wild type and with no sequences lost, and only a few bases of T-DNA were changed. The T-DNA insertion site was in the promoter region ofUV8b_1412 and downstream 3′region ofUV8b_1386, respectively. RT-PCR analysis confirmed that the expression of both of two genes in B2510 were significantly decreased. The genes which were affected by T-DNA insertion may be associated with pathogenicity and participate in the regulation of pathogenic process ofU.virensin rice.

Ustilaginoideavirens; T-DNA insertion mutant; ATMT transformation; pathogenicity; flanking sequence

2015-12-31； 修改稿收到日期: 2016-03-25。

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金資助項目[CX(15)1054]； 國家自然科學(xué)基金資助項目(31301624)。

Q343.5; S435.111.4+6

A

1001-7216(2016)05-0541-11

丁慧, 俞咪娜, 王亞會, 等. 稻曲病菌T-DNA插入突變體B2510的插入位點(diǎn)分析. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(5)： 541-551.