王芳權(quán)　范方軍　李文奇　朱金燕　王軍　仲維功　楊杰,*

(1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/國家水稻改良中心南京分中心/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心， 南京 210014；2揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 揚(yáng)州 225009； *通訊聯(lián)系人， E-mail： yangjie168@aliyun.com)

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利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻Pi21基因的效率分析

王芳權(quán)1,2范方軍1,2李文奇1,2朱金燕1,2王軍1,2仲維功1,2楊杰1,2,*

(1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/國家水稻改良中心南京分中心/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心， 南京 210014；2揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 揚(yáng)州 225009；*通訊聯(lián)系人， E-mail： yangjie168@aliyun.com)

WANG Fangquan, FAN Fangjun, LI Wenqi, et al. Knock-out efficiency analysis ofPi21 gene using CRISPR/Cas9 in rice. Chin J Rice Sci, 2016, 30(5): 469-478.

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，針對Pi21基因的兩個(gè)靶位點(diǎn)(靶位1和靶位2)，構(gòu)建基因敲除載體，轉(zhuǎn)化水稻品種南粳9108。經(jīng)PCR鑒定，獲得了28株T0代陽性轉(zhuǎn)基因植株。對靶位點(diǎn)酶切檢測發(fā)現(xiàn)，靶位 1突變效率為78.57%，靶位 2突變效率為92.86%；靶位 1和靶位 2同時(shí)突變的效率為78.57%，突變效率較高。通過對靶位點(diǎn)進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)突變類型較多，包括堿基缺失、堿基插入、堿基缺失后插入其他堿基和大片段DNA缺失等類型。對突變株系進(jìn)行氨基酸預(yù)測，發(fā)現(xiàn)大部分株系都存在移碼突變現(xiàn)象而使基因突變徹底，少數(shù)株系表現(xiàn)為部分氨基酸的缺失或變異。成功敲除了水稻Pi21基因，并對突變效率和類型進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步驗(yàn)證Pi21基因功能、培育廣譜抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9； 稻瘟??；Pi21； 基因敲除

CRISPR/Cas9是近幾年發(fā)展起來的一類基因編輯技術(shù)，它能對特定的靶位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯，技術(shù)門檻低，操作簡單，試驗(yàn)周期短，成本低廉[1-4]。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷完善和成熟，該技術(shù)已經(jīng)在微生物[5,6]、動(dòng)物[7-9]和植物[10-13]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。利用CRISPR/Cas9技術(shù)，科研工作者已經(jīng)在水稻[12-14]、擬南芥[15]、煙草[15,16]、玉米[17]、小麥[13,18]、高粱[11]、大豆[19-21]、番茄[22]等植物上實(shí)現(xiàn)了基因組編輯。Shan等[13]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻OsPDS-P1和OsBADH2基因進(jìn)行編輯，開啟了CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻基因編輯中的先河。目前，CAO1[23]、PDS[24]、PMS3[14]、AOX1[25]、Waxy[26]等水稻重要功能基因已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)編輯。

表1本研究所用的引物

Table 1. Primers used in this research.

引物名稱Primername引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')Pi21g-FACCAAAGCCTGTCTATCTGCPi21g-RCACATCGATCAGCCTCGTGPi21UT1-FGGCAGAAGCTGTGCAAGAAGATCPi21UT1-RAAACGATCTTCTTGCACAGCTTCPi21UT2-FGCCGCCGCTGCGATGCCAAGATCPi21UT2-RAAACGATCTTGGCATCGCAGCGGpU-FCTCCGTTTTACCTGTGGAATCGgRNA-RCGGAGGAAAATTCCATCCACPi21T1L-FTTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGGPi21T1L-RAGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTCPi21T2L-FTTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGGPi21T2L-RAGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTCSP1CCCGACATAGATGCAATAACTTCSP2GCGCGGTGTCATCTATGTTAPi21T1-FAGGCTAATCAGCAGTGTTCCTPi21T1-RCAGCTTGCACTCCGGCTTCGPi21T2-FATTGGTAACATTCGGCAAATTPi21T2-RGTTCTTCACGTCGTACTCCA

稻瘟病是水稻生產(chǎn)上危害性極大的病害之一，目前已經(jīng)報(bào)道了很多主效稻瘟病抗性基因，但大多數(shù)都是小種特異性基因[27]。Pi21基因是一個(gè)廣譜抗稻瘟病基因，其抗性不因稻瘟病菌生理小種的變化而改變，具有很好的應(yīng)用前景[28-30]。在Pi21基因多個(gè)編碼區(qū)缺失的復(fù)等位基因中，只有其功能缺失型等位基因pi21才具有稻瘟病抗性，而且該抗病基因型pi21與高堊白相關(guān)基因緊密連鎖[29]，因而用傳統(tǒng)雜交方法獲得的抗稻瘟病株系稻米品質(zhì)往往較差，為培育優(yōu)質(zhì)的抗稻瘟病水稻品系增加了很大困難。

為了獲得廣譜抗稻瘟病的水稻遺傳材料，本研究構(gòu)建了含有Pi21基因兩個(gè)靶位點(diǎn)的CRISPR/Cas9突變載體，以優(yōu)良食味水稻品種南粳9108為受體材料，獲得了一系列Pi21基因突變株系，并對其突變情況進(jìn)行了分析。本研究成功實(shí)現(xiàn)了水稻Pi21基因的單基因雙靶點(diǎn)同時(shí)敲除，有利于進(jìn)一步驗(yàn)證Pi21基因功能，為水稻稻瘟病抗病育種提供了新思路。

1　材料與方法

1.1植物材料、載體和菌株

轉(zhuǎn)基因受體材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育的優(yōu)良食味水稻品種南粳9108。

本研究所用引導(dǎo)序列載體gRNA-U3、gRNA-U6a和轉(zhuǎn)基因載體CRISPR/Cas9由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授課題組開發(fā)[26]。pMD19-T購自TaKaRa公司，大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑

限制性內(nèi)切酶BsaⅠ購自NEB公司，T4 DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自TaKaRa公司?？敲顾氐绕渌肿由飳W(xué)試劑購自南京天為生物科技有限公司。

1.3引物

本研究所設(shè)計(jì)的引物見表1。引物由南京銳真生物科技有限公司合成。

1.4靶位點(diǎn)的選擇與驗(yàn)證

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游約20 nt核酸序列的特點(diǎn)設(shè)計(jì)2個(gè)靶位點(diǎn)(靶位1和靶位2)，靶位點(diǎn)的特異性通過Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)分析和水稻基因組BLAST分析進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建

利用合成引物Pi21UT1-F/Pi21UT1-R和Pi21UT2-F/Pi21UT2-R，分別制成靶點(diǎn)接頭Pi21T1(1 μmol/L)和Pi21T2(1 μmol/L)。分別將接頭Pi21T1和Pi21T2連接gRNA-U3和gRNA-U6a載體，反應(yīng)體系包括gRNA載體 1 μL，接頭1 μL，10 × DNA連接緩沖液1 μL，BsaⅠ (5 U) 0.5 μL，T4 DNA連接酶0.2 μL，去離子水6.3 μL。反應(yīng)程序如下：37℃下5 min，20℃下 5 min；5個(gè)循環(huán)。

獲得的產(chǎn)物進(jìn)行2輪巢式PCR。第一輪PCR體系包括2 × PrimeSTAR GC緩沖液7.5 μL，dNTP 混合液1.5 μL，引物pU-F、gRNA-R各1.5 μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.2 μL，gRNA連接產(chǎn)物2 μL，去離子水0.8 μL。PCR程序如下：95℃下1 min；95℃下10 s，60℃下15 s，68℃下20 s，10個(gè)循環(huán)；95℃下10 s，60℃下15 s，68℃下30 s，22個(gè)循環(huán)；4℃下保存。第二輪PCR體系與第一輪PCR類似，將擴(kuò)增引物換成Pi21T1L-F/Pi21T1L-R和Pi21T2L-F/Pi21T2L-R，擴(kuò)增模板為第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍。

將Pi21T1和Pi21T2擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)連接CRISPR/Cas9載體。反應(yīng)體系包括Pi21T1、Pi21T2擴(kuò)增產(chǎn)物各1 μL，CRISPR/Cas9載體5 μL，BsaⅠ 1 μL，10 × DNA連接緩沖液2 μL，T4 DNA 連接酶0.5 μL，去離子水4.5 μL。反應(yīng)程序如下：37℃下5 min，10℃下5 min，20℃下5 min；15個(gè)循環(huán)。

連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)約12 h。挑取平板上長出的單菌落，搖菌擴(kuò)繁。以菌液為模板，以引物組合SP1/Pi21T1-R和Pi21T2-F/SP2進(jìn)行PCR驗(yàn)證。提取陽性菌株的質(zhì)粒，再以上述引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。質(zhì)粒送往南京銳真生物科技有限公司測序驗(yàn)證。將確認(rèn)無誤的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。

1.6陽性轉(zhuǎn)基因植株的獲得及驗(yàn)證

利用構(gòu)建好的陽性農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)化水稻品種南粳9108的愈傷組織，用潮霉素篩選獲得再生組培苗，即為T0代植株。組培苗經(jīng)煉苗后，移栽盆缽，按轉(zhuǎn)基因水稻種植要求嚴(yán)格管理。提取T0代植株的基因組DNA，用T-DNA特異引物SP1和Pi21T1L-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，理論產(chǎn)物長度約為525 bp，能擴(kuò)增出目的片段的植株即為陽性轉(zhuǎn)基因植株。

1.7酶切檢測靶位點(diǎn)

為了檢測靶位點(diǎn)的突變情況，跨越靶位 1設(shè)計(jì)引物Pi21T1-F和Pi21T1-R(表1)，理論產(chǎn)物長度為494 bp；野生型水稻的擴(kuò)增產(chǎn)物能被BglⅡ (A/GATCT)識別并完全酶切成181和313 bp條帶，突變基因型則不能被酶切?？缭桨形?2設(shè)計(jì)引物Pi21T2-F和Pi21T2-R(表1)，理論產(chǎn)物長度為654 bp，野生型水稻的擴(kuò)增產(chǎn)物能被MboⅠ(/GATC)識別并完全酶切成450和204 bp條帶，突變基因型則不能被酶切。

1.8測序檢測Pi21基因型和靶位點(diǎn)

以南粳9108品種基因組為模板，用Pi21g-F和Pi21g-R引物組合擴(kuò)增Pi21基因，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送往南京銳真生物科技有限公司測序，用DNAMAN軟件進(jìn)行核酸序列比對分析。

利用Pi21T2-F和Pi21T1-R引物組合，能同時(shí)擴(kuò)增出包含靶位 1和靶位 2的DNA序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD19-T載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取的單菌落搖菌后用PCR檢測，陽性菌液送往南京銳真生物科技有限公司測序。每個(gè)株系檢測2～4個(gè)單菌落。測序結(jié)果用FinchTV軟件讀取，核酸序列分析、氨基酸序列預(yù)測和比對采用BioXM 2.6軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1南粳9108的Pi21基因型及靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

接種鑒定試驗(yàn)表明，南粳9108苗期對江蘇省稻瘟病B、C、D生理小種都表現(xiàn)為高感[31]。對水稻品種南粳9108的Pi21基因測序分析表明，其富脯氨酸編碼區(qū)的部分堿基缺失，未造成移碼突變(圖1)。Pi21基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，其功能區(qū)域?yàn)閮啥胃缓彼岬陌被峄颍摳桓彼嵩幋a序列完全缺失導(dǎo)致Pi21基因喪失功能而具有稻瘟病抗性，而另外11種富脯氨酸元件編碼序列部分缺失類型(缺失堿基數(shù)都為3的倍數(shù))均未造成Pi21基因功能喪失，不具有稻瘟病抗性[29]。利用RNA干擾Pi21基因，能顯著提高水稻對稻瘟病的抗性[29]。因此，南粳9108的Pi21基因?qū)儆诟械疚敛』蛐停ㄟ^基因突變有望提高對稻瘟病的抗性。

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別特點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個(gè)靶位點(diǎn)，靶位點(diǎn)位于富脯氨酸編碼序列之前(圖2)。靶位 1在編碼區(qū)+158到+180處，其理論突變位點(diǎn)的堿基序列AGATCT能被BglⅡ識別并切割；靶位2在編碼區(qū)+38到+60處，其理論突變位點(diǎn)的堿基序列GATC能被MboⅠ識別并切割。選擇能被限制性內(nèi)切酶識別并切割的位點(diǎn)進(jìn)行突變，有利于對轉(zhuǎn)基因植株突變情況進(jìn)行檢測。將設(shè)計(jì)的靶序列進(jìn)行Cas-OFFinder分析和BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)靶位 1和靶位 2特異匹配目標(biāo)位點(diǎn)，不會(huì)或不易引起脫靶效應(yīng)。靶位 1和靶位 2的命名是根據(jù)它們在載體上的前后順序來確定的，而不是它們在基因位點(diǎn)的順序。

南粳9108感稻瘟病, 為Pi21感病基因型; Owarihatamochi抗稻瘟病, 為pi21抗病基因型。

Nanjing 9108 is a blast sensitive variety, containing the susceptible allelePi21. Owarihatamochi is a blast resistant variety, containing the resistant allelepi21.

圖1Pi21基因編碼序列比對

Fig. 1. Coding sequences co-linearity analysis of Pi21 gene.

加粗的堿基為PAM，下劃線標(biāo)出的堿基為限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，黑色區(qū)域?yàn)橥怙@子，白色區(qū)域?yàn)閮?nèi)含子，灰色方框標(biāo)識區(qū)域?yàn)楦桓彼嵩?/p>

The base in bold indicates PAM; The restriction endonuclease recognized site is underlined; The black region indicates exon; The white region indicates intron; The gray box region indicates proline-rich motifs.

圖2Pi21基因結(jié)構(gòu)及gRNA靶點(diǎn)位置

Fig. 2. Schematic diagram of Pi21 gene structure and gRNA targets.

2.2表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化水稻

采用酶切連接的方法構(gòu)建Pi21突變載體，Target 1-gRNA由OsU3基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng),Target 2-gRNA由OsU6a基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，構(gòu)建好的載體命名為CRISPR/Cas9-Pi21載體(圖3)。經(jīng)過PCR、酶切和測序驗(yàn)證無誤后(數(shù)據(jù)未顯示)，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。以陽性農(nóng)桿菌EHA105菌株為介體轉(zhuǎn)化水稻品種南粳9108的愈傷組織，篩選獲得抗潮霉素的再生T0代組培苗。用載體特異性引物(SP1和Pi21T1L-R)鑒定組培苗是否攜帶目的基因。如圖4所示，野生型植株不能擴(kuò)增出目的片段；42株組培苗中，28株能擴(kuò)增出目的片段，為陽性轉(zhuǎn)基因苗；14株不能擴(kuò)增出目的片段，為假陽性苗。

圖3CRISPR/Cas9-Pi21載體結(jié)構(gòu)

Fig. 3. Schematic diagram of the CRISPR/Cas9-Pi21 vector construction.

M-DL 2000 DNA標(biāo)記； 1～42-T0代轉(zhuǎn)基因株系； WT-南粳9108(野生型)。

M, DL 2000 DNA marker; 1-42, T0transgenic lines; WT, Nanjing 9108 (wild-type).

圖4PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株

Fig. 4. PCR identification of the positive transgenic plants.

2.3酶切法分析Pi21基因突變效率

利用引物組合Pi21T1-F和Pi21T1-R，分析靶位1突變情況，結(jié)果如圖5所示。從PCR擴(kuò)增產(chǎn)物來看，株系10、14和20的PCR產(chǎn)物明顯小于野生型的條帶，可初步判定這3個(gè)株系發(fā)生突變。野生型擴(kuò)增出494 bp條帶，其產(chǎn)物能被BglⅡ完全酶切成181 bp和313 bp條帶。轉(zhuǎn)基因植株酶切分析發(fā)現(xiàn)，42個(gè)T0代株系中，19個(gè)株系(1、3、7、10、13～16、19～22、24、25、35、37、39、41和42)不能被酶切，為兩個(gè)等位基因都發(fā)生突變的株系；3個(gè)株系(4、11和17)只能被部分酶切，為只有一個(gè)等位基因發(fā)生突變的株系；20個(gè)株系(2、5、6、8、9、12、18、23、26～34、36、38和40)能被完全酶切，為未發(fā)生突變的株系。從PCR產(chǎn)物大小推斷株系10、14和20發(fā)生突變的結(jié)果得到酶切結(jié)果的驗(yàn)證。經(jīng)PCR驗(yàn)證為假陽性植株的14個(gè)株系(9、18、23、26～30、32～34、36、38、40)，在酶切檢測靶點(diǎn)突變的結(jié)果中都表現(xiàn)為未突變。有6個(gè)株系(2、5、6、8、12和31)雖然為陽性轉(zhuǎn)基因植株，但靶位1未發(fā)生突變。

利用引物組合Pi21T2-F和Pi21T2-R，分析靶位 2突變情況。如圖6所示，野生型擴(kuò)增出654 bp條帶，其產(chǎn)物能被MboI完全酶切成450和204 bp條帶。從PCR產(chǎn)物來看，株系14和41的PCR產(chǎn)物小于野生型的條帶，可初步判定這兩個(gè)株系發(fā)生了突變。酶切后發(fā)現(xiàn)，42個(gè)T0代株系中，24個(gè)株系(3、4、6～8、10～17、19～22、24、25、35、37、39、41和42)不能被酶切，1個(gè)株系(株系31)酶切后大小與野生型不同，為兩個(gè)等位基因都發(fā)生突變的株系；1個(gè)株系(株系1)只能被部分酶切，為只有一個(gè)等位基因發(fā)生突變的株系；16個(gè)株系(2、5、9、18、23、26～30、32～34、36、38和40)能被完全酶切，為未發(fā)生突變的株系。利用PCR產(chǎn)物大小推斷株系14和41發(fā)生突變的結(jié)果得到酶切結(jié)果的驗(yàn)證。經(jīng)PCR驗(yàn)證為假陽性植株的14個(gè)株系，靶位 2均未發(fā)生突變。有2個(gè)株系(2和5)盡管攜帶CRISRP/Cas9-Pi21結(jié)構(gòu)，但靶位 2未發(fā)生突變。

A-酶切前； B-酶切后。 1～42-T0代轉(zhuǎn)基因株系； WT-南粳9108(野生型)。

A, Before digestion; B, After digestion. 1～42, T0transgenic lines; WT, Nanjing 9108 (wild-type).

圖5酶切鑒定靶位 1突變情況

Fig. 5. Mutation identification at Target 1 by enzyme digestion.

A-酶切前； B-酶切后。 1～42-T0代轉(zhuǎn)基因株系； WT-南粳9108(野生型)。

A, Before digestion; B, After digestion. 1～42, T0transgenic lines; WT, Nanjing 9108 (wild-type).

圖6酶切鑒定靶位 2突變情況

Fig. 6. Mutation identification at Target 2 by enzyme digestion.

因此，經(jīng)過酶切法分析，在28株陽性轉(zhuǎn)基因植株中，22株靶位 1發(fā)生突變，突變效率為78.57%；26株靶位 2發(fā)生突變，突變效率為92.86%；靶位 1和靶位 2同時(shí)發(fā)生突變的株系有22株，突變的效率為78.57%。

2.4靶位點(diǎn)突變類型分析

基于酶切鑒定的結(jié)果，我們對靶位 1、靶位 2都發(fā)生突變的8個(gè)株系進(jìn)行了測序分析，進(jìn)一步研究了靶位點(diǎn)突變情況，結(jié)果如圖7和圖8所示。與酶切檢測結(jié)果一致，所測序的8個(gè)株系的靶位 1和靶位 2均發(fā)生了不同類型的堿基變異。其中，4個(gè)株系(16、21、22和41)，靶位 1和靶位 2的兩個(gè)等位基因突變類型均相同，為突變純合系。3個(gè)株系(13、20和39)，靶位 1和靶位 2的兩個(gè)等位基因同時(shí)發(fā)生突變，但突變類型不一致，為雜合突變系。株系10的酶切鑒定結(jié)果為突變雜合型(PCR產(chǎn)物長度呈多種帶型)，但3個(gè)獨(dú)立的單克隆測序都只檢測到一種突變類型，可能另一種突變類型PCR擴(kuò)增效率低，測序時(shí)沒有檢測到。因此，測序的8個(gè)株系中，靶位 1和靶位 2都檢測到11個(gè)突變類型。

靶位 1和靶位 2突變均主要以堿基缺失為主。對于靶位 1，在檢測的11個(gè)突變類型中，有3個(gè)為缺失1 bp的突變類型，占27.27%；其他還包括缺失4、15、23、34和180 bp等突變類型。對于靶位 2，在檢測的11種突變型中，缺失2或4 bp為主要的突變類型，占63.64%。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，20-2突變系存在DNA大片段(559 bp)缺失，靶位 1和靶位 2中間的序列全部刪除，這可能是靶位 1和靶位 2的突變事件同時(shí)發(fā)生的結(jié)果。

已有研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂修復(fù)過程中，插入突變的堿基通常為A或T[26]。我們也發(fā)現(xiàn)了靶位 1和靶位 2存在著堿基插入的現(xiàn)象。株系16的靶位 1有一個(gè)堿基A插入；株系20-1的靶位 1和株系10的靶位 2均在缺失部分堿基后，又插入了一個(gè)堿基(T/A)；株系13-2的靶位 2則在缺失19 bp后，又插入了15 bp，插入的堿基中，有12 bp(GTATAATAAATT)可能來源于與突變靶位點(diǎn)相鄰的位置(圖8)。

圖7野生型、轉(zhuǎn)基因株系16和21靶位測序結(jié)果

Fig. 7. Sequencing results of target sites from wild-type, transgenic lines 16 and 21.

“-1”和“-2”表示不同突變類型，括號內(nèi)的數(shù)值為測序的克隆數(shù)，箭頭所指的位置為Cas9剪切位點(diǎn)，加粗堿基為前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)，紅色字體的堿基為靶序列，藍(lán)色字體的堿基為插入堿基。WT， 野生型；#， 轉(zhuǎn)基因株系； d， 缺失； i， 插入。

“-1” and “-2” indicate different mutation type; The numbers in brackets are the numbers of sequenced clone; The arrows indicate the digestion sites of Cas9; The base in bold indicates protospacer adjacent motif(PAM); The base in red is the target sequence; The base in blue is the insert base; WT, Wild-type; #, Transgenic lines; d, Deletion; i, Insert.

圖8靶位點(diǎn)突變序列分析

Fig. 8. Analysis of mutation sequences of targets.

圖9突變株系的氨基酸序列共線性分析

Fig. 9. Co-linearity analysis of amino acid sequences of mutant lines.

2.5突變植株的氨基酸序列分析

進(jìn)一步對突變株P(guān)i21基因表達(dá)氨基酸序列進(jìn)行分析(圖9)，發(fā)現(xiàn)株系13、16、20-1、21、22和39的表達(dá)均由于靶位 2變異引發(fā)的移碼突變而提前終止；株系20-2中DNA大片段缺失引起基因起始密碼子丟失，Pi21基因不表達(dá)；株系41中靶位 2缺失12個(gè)氨基酸，靶位 1造成移碼突變；株系10中靶位 2突變造成11個(gè)氨基酸缺失和1個(gè)氨基酸改變，靶位 1缺失60個(gè)氨基酸。表明本研究所獲得的轉(zhuǎn)基因植株，Pi21基因編碼的氨基酸都存在不同程度的變異。

3　討論

CRISPR/Cas9技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，具有簡單、快速、高效等特點(diǎn)，目前已經(jīng)在微生物、動(dòng)物和植物中獲得了廣泛應(yīng)用[5-13]。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，針對水稻Pi21基因設(shè)計(jì)兩個(gè)靶位點(diǎn)(靶位 1和靶位 2)，實(shí)現(xiàn)了Pi21基因的敲除。

根據(jù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)識別特點(diǎn)，選擇能被限制性內(nèi)切酶識別并切割的位點(diǎn)進(jìn)行突變，有利于快速且較準(zhǔn)確地檢測轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)是否發(fā)生突變。但CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯后突變情況較復(fù)雜，酶切檢測可能無法包含所有突變類型；因此，實(shí)際突變率可能略高。

本研究設(shè)計(jì)的兩個(gè)靶位點(diǎn)雖然位于同一基因，但它們的突變效率存在差異，靶位 1突變效率為78.57%，靶位 2突變效率為92.86%。在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，gRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶識別并剪切靶位點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)基因編輯的關(guān)鍵，gRNA識別、結(jié)合靶位點(diǎn)的能力直接影響基因編輯的效率[26]。GC含量較高的靶序列，基因突變的效率往往也較高。我們選擇的兩個(gè)靶點(diǎn)中，靶位 1的GC含量為45%，突變效率為78.57%；靶位 2的GC含量為65%，突變效率為92.86%，與前人報(bào)道結(jié)果類似[26]。兩個(gè)靶位點(diǎn)表現(xiàn)出不同的突變效率，可能與gRNA對靶序列的結(jié)合能力有關(guān)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)對靶位點(diǎn)的編輯會(huì)引發(fā)基因多種形式的突變，例如堿基的缺失、插入或替換等[13,15,16,32]。本研究中出現(xiàn)的突變類型主要是少數(shù)堿基缺失，部分株系也存在堿基插入、堿基缺失和插入同時(shí)發(fā)生、大片段DNA缺失等突變現(xiàn)象。在突變株系中，39-1的靶位 1和41的靶位 2出現(xiàn)的缺失堿基數(shù)為3的整數(shù)倍，導(dǎo)致基因在相應(yīng)位點(diǎn)直接刪除若干個(gè)氨基酸而不引起移碼突變。因此，若選擇適當(dāng)位點(diǎn)進(jìn)行突變，可能獲得部分靶基因表達(dá)產(chǎn)物活性減弱的株系，可以為某些必需基因的突變、改變蛋白某個(gè)活性中心、改變蛋白空間結(jié)構(gòu)等研究提供突變材料。

Ma等[26]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻Os03g0126800和Os03g0409500基因進(jìn)行雙靶點(diǎn)編輯時(shí)發(fā)現(xiàn)，部分突變株系的兩個(gè)靶位點(diǎn)之間的序列出現(xiàn)刪除。本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)株系20-2的靶位 1和靶位 2中間的序列全部缺失，可能是由于兩個(gè)位點(diǎn)的突變事件同時(shí)發(fā)生引起，為敲除兩個(gè)位點(diǎn)中間一段序列提供了一定的依據(jù)。株系13-2的靶位 2出現(xiàn)了19個(gè)堿基缺失后15個(gè)堿基的插入，插入堿基以T/A為主，與以前人報(bào)道的結(jié)果類似[14,26]；分析發(fā)現(xiàn)，插入堿基中的12個(gè)堿基可能來源于PAM位點(diǎn)下游的一段序列，這可能為CRISPR/Cas9系統(tǒng)對編輯基因機(jī)理的探索提供部分依據(jù)。

利用CRISPR/Cas9突變載體對靶序列的編輯時(shí)，通常會(huì)得到多種類型的T0代株系，包含無突變型、雜合突變型、突變純合型、突變雜合型等[25]。由于等位基因突變類型不同，雜合突變型和突變雜合型株系自交后代存在功能喪失、功能減弱或無義突變等類型的分離，不利于基因功能分析或穩(wěn)定新品系選育。突變純合型后代則不會(huì)出現(xiàn)分離，能從T1代植株中直接選育到基因型純合、性狀穩(wěn)定的株系，有利于加快新品系選育。在本研究測序的8個(gè)株系都能檢測到突變發(fā)生，其中有4個(gè)株系為突變雜合型，4個(gè)株系為突變純合型，純合突變比例較高，能快速獲得遺傳穩(wěn)定的株系。

傳統(tǒng)的回交遺傳改良，周期長，工序繁瑣，連鎖累贅難以打破，因而較難達(dá)到理想的效果[33]。CRISPR/Cas9技術(shù)可以特異地對一個(gè)基因或多個(gè)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，實(shí)現(xiàn)對一種或多種特定性狀的定向改變，大大縮短了作物品系改良的周期，且不影響作物的其他性狀。通過后代的自交分離，能獲得剔除外源基因的株系，在作物育種和遺傳改良方面具有重要的應(yīng)用前景[25]。

稻瘟病是水稻主要病害之一，近年來在全國范圍內(nèi)均有發(fā)生，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和品質(zhì)[34]。培育水稻抗稻瘟病品種是防治稻瘟病最有效的手段，但由于稻瘟病菌生理小種多樣，進(jìn)化速度快，導(dǎo)致這些抗病品種推廣3～5年后即失去抗性。目前，已報(bào)道的抗稻瘟病基因中，大多數(shù)是垂直抗性基因，而pi21為水平抗性基因。本研究針對粳稻品種南粳9108Pi21的感病基因型，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了Pi21基因的定點(diǎn)突變，但Pi21基因突變的遺傳性及突變株系是否提高了對稻瘟病的抗性，還需進(jìn)一步研究。

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Knock-out Efficiency Analysis of Pi21 Gene Using CRISPR/Cas9 in Rice

WANG Fang-quan1,2, FAN Fang-jun1,2, LI Wen-qi1,2, ZHU Jin-yan1,2, WANG Jun1,2, ZHONG Wei-gong1,2,YANG Jie1,2,*

(1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Nanjing Branch of Chinese National Center for Rice Improvement/Jiangsu High Quality Rice R & D Center, Nanjing 210014, China;2Jiangsu Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;*Corresponding author, E-mail: yangjie168@aliyun.com)

A CRISPR/Cas9 vector, which contains two targets (Target 1 and Target 2) ofPi21gene, was constructed and transformed to rice variety Nanjing 9108. Twenty-eight T0transgenic lines were obtained and confirmed by T-DNA specific PCR. Restriction digestion analysis revealed 78.57% mutant ratio in Target 1 site, 92.86% mutant ratio in Target 2 site, 78.57% ratio of lines containing both Target 1 and Target 2 mutant in transgenic lines. Through sequencing analysis, we found the mutant types of targets, such as deletion of bases, insertion of bases, insertion behinds deletion of bases, and long fragment deletion of DNA, etc. Moreover, except amino acid deletion, most transgenic lines displayed frameshift mutation,which caused function loss ofPi21. In this way, a series ofPi21-knock-out rice lines were obtained, and further, could be used for functional analysis ofPi21 and rice blast broad-spectrum resistant breeding.

CRISPR/Cas9; rice blast;Pi21; gene knock-out

2016-01-18； 修改稿收到日期: 2016-03-03。

江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(BE2015355); 國家重大農(nóng)技推廣項(xiàng)目(NG[15]003); 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31301652)； 江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20130723)。

Q755； S511.01

A

1001-7216(2016)05-0469-10

王芳權(quán), 范方軍, 李文奇, 等. 利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻Pi21基因的效率分析. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(5)： 469-478.