羅秋辭 沈華苑 李盈佳 張英華 楊承美 王志敏

(中國農業(yè)大學 農學院，北京 100193)

種子萌發(fā)和幼苗生長被認為是植物生長的關鍵階段[1]。種子萌發(fā)包括吸水膨脹的物理過程、營養(yǎng)物質轉化的生物化學過程和種胚萌芽的生物學過程3個階段[2-3]。在種子萌發(fā)過程中胚與胚乳發(fā)生密切的相互作用，并協(xié)同響應光[4]、溫度[5-6]、營養(yǎng)[7]和水[8-9]等環(huán)境因素的變化。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境信號可以調節(jié)種子中的激素代謝以及種子對激素的響應[10-12]。

在種子萌發(fā)過程中，種胚起主導作用，會向胚乳發(fā)出信號，誘導胚乳中貯藏物質降解，促進營養(yǎng)物質向胚流動[13]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，在種子萌發(fā)過程中，胚乳也具有積極的調控作用，并能感應環(huán)境變化。擬南芥種子被分離重置的胚乳能夠感受光信號，并合成和分泌ABA調控胚的生長[14]。因此胚乳功能表達可能并不完全受種胚的調控，種子萌發(fā)過程中胚與胚乳之間不僅有物質的轉換，也存在信號的轉導[15]，胚乳能夠通過主動釋放信號調控胚的生長[16]。目前，深入揭示胚與胚乳之間的互作機制已成為植物生理學研究的熱點之一。

為了研究胚和胚乳的互作關系，進行胚乳置換可能是一種有用的方法。胚乳置換是將原種子胚乳去掉，僅留下種胚與其他去胚種子的胚乳連接固定從而實現(xiàn)胚乳替換的方法[17]。胚乳置換可以在同一品種、不同品種和不同作物種子之間進行，以此可以探究異源種子胚乳對種胚萌發(fā)生長的調控影響[17]。20世紀50—60年代，國內外曾有關于單子葉作物種子胚乳切割和種胚嫁接的研究報道[18-19]，但對小麥胚乳切割置換方法的可行性，置換后發(fā)芽出苗及中后期生長的影響及胚乳置換后胚與外源胚乳之間的信號轉導和物質交換尚未見報道。本研究對小麥種子切割和胚乳置換方法的有效性進行測試，旨在探明胚乳置換對小麥種子萌發(fā)和苗期生長的影響，以期為探究種子萌發(fā)過程中胚乳與胚的互作機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用4個小麥品種，分別為‘S38-2’、‘藁優(yōu)5766’、 ‘農大3753’和‘ML-1’，其中‘藁優(yōu)5766’為強筋品種，‘農大3753’為黑粒品種，‘S38-2’和‘ML-1’為常規(guī)品種材料。

1.2 試驗處理

試驗于2018—2019年在中國農業(yè)大學溫室進行。包括2組不同品種的小麥種子胚乳置換試驗處理。第1組試驗(E1)相互置換品種為‘S38-2’和‘藁優(yōu)5766’，見表1；第2組試驗(E2)相互置換品種為‘農大3753’和‘ML-1’，見表2。

表1 胚乳置換試驗1(E1)處理及代號Table 1 Treatments and corresponding abbreviation of endosperm replacement test 1 (E1)

1.3 胚乳置換試驗

選取飽滿一致的小麥種子，用20%的H2O2消毒15 min并用蒸餾水沖洗干凈后在水中浸泡3 h，此時種子尚未萌動露白，易于進行胚乳置換。

用單面刀片根據(jù)圖1(a)所示進行切割，沿虛線方向將小麥種胚與胚乳分離后，將每組中兩不同品種小麥種子胚乳置換，滴1滴無菌水在胚乳切割口，待表面因水濕潤而糊化后，再將另一品種的種胚粘合上去進行固定。即將小麥品種1的種胚與品種2的胚乳結合固定，品種2的種胚與品種1的胚乳結合固定。試驗環(huán)境要求清潔無菌，切胚乳過程要求一刀切下，速度快，角度準確，保證切割面的平滑，便于與種胚進行接合。試驗增加了置換失活的胚乳這一處理，失活胚乳即是在浸種前將正常種子在微波爐中高溫加熱2 min，以使種子失去活性。

表2 胚乳置換試驗2(E2)處理及代號Table 2 Treatments and corresponding abbreviation of endosperm replacement test 2 (E2)

(a)小麥種子切割方向與位置; (b)小麥種子胚乳置換過程;(c) 胚乳置換后的小麥種子SG; (d)胚乳置換后的小麥種子HA(a) Cutting direction and position of wheat seed; (b) The process of wheat seed’s endosperm replacement; (c) The wheat seed SG after replacing the endosperm; (d) The wheat seed HA after replacing the endosperm圖1 胚乳置換法切割示意圖Fig.1 Schematic diagram of endosperm replacement method

將接合好的小麥種子靜置2 h，之后播種在盛土的杯中，每杯播種10粒小麥種子，保持土壤濕潤，待發(fā)芽出苗生長至3葉1心時將其帶土移栽到大花盆中，每盆10株， 3次重復。盆栽各處理幼苗生長于溫室中。

1.4 性狀測定

調查小麥種子的發(fā)芽率及發(fā)芽后2、4、7 d的芽長。在播種后的不同時期對小麥生長狀態(tài)拍照觀察記錄，在幼苗1葉期、2葉期、3葉期和植株成熟期進行農藝性狀調查。植株樣品在75 ℃下持續(xù)烘干至恒重測植株干物重。長寬法測葉面積，計算公式為：葉面積=葉長×葉寬×0.85。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)匯總，分析用Excel整理。方差分析使用Spass 16.0軟件分析完成。

2 結果與分析

2.1 種子發(fā)芽率和芽長

如表3所示，與正常小麥種子(S，G，M和N)相比，種子切割并進行胚乳置換后的種子(SG，SS，GS，GG，NM，NN，MN和MM)均可發(fā)芽，但發(fā)芽率有所下降，同一品種和不同品種胚乳置換處理(SS與SG，GG與GS，NN與NM，MM與MN)的發(fā)芽率表現(xiàn)基本相似。置換失活胚乳的種子(SL，GL，NL和ML)發(fā)芽率則顯著低于正常小麥種子。正常小麥種子(S，G，M和N)發(fā)芽后幼芽生長較快于胚乳置換各處理(SG，SS，GS，GG，NM，NN，MN和MM)，但同品種和不同品種胚乳置換處理之間幼芽生長差異并不顯著，且其芽長都顯著高于胚乳失活處理(SL，GL，NL和ML)。

2.2 幼苗株高

發(fā)芽后調查幼苗生長的變化，如表4所示，2組試驗中胚乳置換處理(SG，SS，GS，GG，NM，NN，MN，MM)的幼苗長勢均低于正常種子生長的幼苗(S，G，M，N)，表現(xiàn)在1葉期和2葉期株高顯著低于正常種子的幼苗。但在3葉期，S與SG、SS相比株高差異已不明顯。同一品種和不同品種胚乳置換處理間(SG與SS，GS與GG，NM與NN，MN與MM)比較，幼苗的株高差異很小，但均顯著高于胚乳失活處理(SL，GL，NL，ML)。

表3 不同胚乳置換處理種子發(fā)芽率及芽長Table 3 Germination rate and the bud length of wheat seeds under different treatments

表4 不同胚乳置換處理的幼苗株高Table 4 Plant height of wheat seedlings under different treatments cm

2.3 幼苗葉面積

如表5所示，1葉期正常小麥幼苗(S，G，M，N)葉面積顯著高于胚乳置換處理的小麥幼苗(SG， SS， GS，GG，NM，NN， MN， MM)，但同一品種和不同品種胚乳置換處理之間(SG與SS，GS與GG，NM與NN， MN與MM)葉面積差異很小，且均顯著高于胚乳失活處理(SL，GL，NL，ML)。在正常胚乳置換處理的小麥幼苗達到2葉期時，胚乳失活處理小麥幼苗(SL，GL，NL，ML)尚未進入2葉期，其葉面積顯著小于其他處理。至3葉期時，正常小麥幼苗(S, G, M, N)葉面積雖仍保持較大優(yōu)勢，但胚乳置換處理(SG, SS, GS, GG, NM, NN, MN, MM)小麥幼苗葉面積明顯增加，與正常對照幼苗差異縮小，且仍顯著高于胚乳失活處理的幼苗(SL, GL, NL, ML)。

2.4 苗期干重變化

測定發(fā)芽后胚乳及幼苗干重動態(tài)，如圖2、圖3和表6所示，兩組試驗胚乳置換處理的小麥幼苗(SG, SS, GS, GG, NM, NN, MN, MM)生長遲緩，在2葉期與3葉期的干重均顯著低于正常對照種子(S, G, M, N)生長的幼苗，但同品種和不同品種胚乳置換處理的幼苗干重差異不明顯(SG與SS, GS與GG, NM與NN, MN與MM)，胚乳失活后置換處理(SL，GL，NL，ML)的幼苗干重最低。從胚乳貯藏物質消耗動態(tài)看，正常對照種子和置換正常胚乳的種子均表現(xiàn)出隨幼苗生長，胚乳消耗增加，但置換失活胚乳的種子其胚乳消耗明顯較少。

2.5 植株產量

各處理幼苗在盆栽條件下生長至成熟。經觀測，胚乳置換處理雖幼苗期生長緩慢，但中期生長發(fā)育加快，開花期與正常處理植株相近或比正常植株提前。即使是胚乳失活處理，雖有個別植株生長較弱而中途衰亡，其他成活植株均持續(xù)生長至成熟。成熟期考察產量及其構成因素，如圖4、圖5和表7所示，胚乳置換處理在穗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒重和產量方面，與正常對照植株間的差異不顯著，胚乳失活處理的小麥植株(SL,GL,NL和ML)穗數(shù)較少，但單株產量與其他處理的差距很小或不顯著。

各處理編號參見表1。圖4同。See Table 1 for each treatment abbreviation. The same in Fig.4.圖2 E1各處理間小麥幼苗在萌發(fā)10(a)和20(b) d后的生長差異比較Fig.2 Wheat growth differences in seedling stage after 10 (a) and 20 (b) d of germination between different treatments in E1

各處理代號見表2。圖5同。See Table 2 for each treatment abbreviation. The same in Fig.5.圖3 E2各處理間小麥幼苗在萌發(fā)10(a)和20(b) d后的生長差異比較Fig.3 Wheat growth differences in seedling stage after 10 (a) and 20 (b) d of germination between different treatments in E2

表6 不同胚乳置換處理的幼苗干重Table 6 Dry weight of wheat seedlings under different treatments mg

圖4 E1各處理間小麥植株生長125 d后生長差異比較Fig.4 Wheat growth differences after 125 d of growth between different treatments in E1

圖5 E2各處理間小麥植株生長125 d后生長差異比較Fig.5 Wheat growth differences after 125 d of growth between different treatments in E2

表7 不同胚乳置換處理的小麥成熟期產量及產量構成因素Table 7 Yield of wheat plants at maturity under different treatments

3 討 論

盡管在20世紀50—60年代就有關于種胚嫁接的報道[17]，但其方法一直未被實際應用。在本試驗中，對小麥同一品種和不同品種的種子進行胚乳切割，將一個種子切下的胚部與另一個不同種子切下的胚乳直接對接，利用斷面糊化淀粉粘合，可實現(xiàn)胚乳置換，置換后的新“種子”在土壤中能夠發(fā)芽出苗并正常生長。觀察表明，胚乳置換的種子與正常種子相比，其發(fā)芽率有所下降，且幼芽及幼苗生長速率均較為遲緩，但渡過緩慢的幼苗期后，其生長速率則明顯加快，開花期不會晚于正常種子發(fā)芽的植株，且最終產量與正常植株相近。試驗結果表明，對小麥種子胚乳進行人為切割，只要胚部完整，切割后的胚與從其他種子切割下的胚乳相接合，胚的活性并不受明顯抑制，可以完成正常的發(fā)芽過程和成苗生長。通常認為，胚乳的損傷對種子萌發(fā)、發(fā)芽以及苗期生長具有非常不利影響[20]，但從本結果看，僅僅胚乳損傷，其對種子發(fā)芽生長的影響很小。種子胚乳切割后與同品種種子胚乳置換或與不同品種種子胚乳置換，均能發(fā)芽且其發(fā)芽后幼苗生長基本相似，這表明，種子的萌發(fā)主要由胚調控，胚乳切割-粘合過程并沒有對胚和胚乳的功能及其相互關系造成顯著抑制性影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，失活胚乳置換處理的種子也能發(fā)芽，這是因為小麥種子在胚乳切割后，胚的部分仍存在少量胚乳，能夠起到短時間營養(yǎng)供應的作用，但之后的幼苗生長過程，主要依賴于失活胚乳低效率的物質轉化和供應，進而導致幼苗生長遲滯，而正常胚乳置換的種子胚乳物質不斷被消耗，其耗減速度和同期耗減量雖低于正常未置換處理的種子，差距并不顯著，卻顯著高于失活胚乳置換的種子。說明，正常胚乳切割和置換處理的種子，在發(fā)芽過程中其胚乳組織和細胞能持續(xù)進行生物學代謝活動，胚乳物質被轉化并能被胚生長利用。對比正常小麥幼苗，胚乳置換后的小麥幼苗長勢雖有減弱，但中后期趨于一致。因此，胚乳置換后的小麥種子萌發(fā)、出苗和幼苗生長能夠有效吸收外源胚乳提供的營養(yǎng)，且不影響植株中后期生長和產量形成。

在禾谷類作物種子萌發(fā)過程中，胚和胚乳相互作用，胚感知環(huán)境變化，釋放信號，誘導胚乳物質降解并向胚運轉[21]；胚乳具有保護種胚完整性，并為胚的萌發(fā)提供營養(yǎng)等功能[21]。一些研究顯示，胚乳也能夠通過感知環(huán)境變化而產生信號調控胚的生長發(fā)育[13-14]。在本試驗中，對胚乳進行了切割和置換后，胚和幼苗仍能吸收外源胚乳的營養(yǎng)，其養(yǎng)分吸收和運轉方式與機制并不清楚，需要深入研究。已觀察到胚乳置換處理幼苗生長緩慢而中后期發(fā)育加快的現(xiàn)象，這表明由于胚乳切割造成的幼苗早期生理脅迫和不同品種胚乳置換導致的外源生理物質吸收可能引發(fā)了基因表達的差異性變化[22]，值得關注和探討。