楊冬米立國王切

心肌細胞肥厚與TNNI3K基因表達的相關(guān)性研究

楊冬①米立國②王切②

目的：初步探討AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥厚與TNNI3K基因表達的相關(guān)性。方法：經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞肥大；通過免疫組織化學(xué)染色法檢測模型中TNNI3K基因的蛋白表達情況。結(jié)果：經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞肥大，且實驗組細胞中TNNI3K基因的蛋白表達增強。結(jié)論：TNNI3K基因參與了AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞肥厚機制。

TNNI3K； 心肌細胞原代培養(yǎng)； AngⅡ

First-author’s address：Eastern Hospital of the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China

心肌肥厚是心臟受到各種刺激因素的適應(yīng)性反應(yīng)，例如高血壓、心臟瓣膜病、心肌梗死等[1-2]。然而，心肌肥厚持續(xù)進展將增加心肌重塑和心衰發(fā)生。心衰是高齡人群首要的死亡原因。盡管在過去十幾年多種治療手段已經(jīng)取得很大進展，但是心衰仍然是高發(fā)病率和死亡率的主要公共事件[3-4]。目前仍然缺乏治療心肌重塑和心衰的有效手段。弗明漢心臟病研究顯示經(jīng)心電圖檢查確診的心肌肥厚患者比普通人群的死亡風(fēng)險高6倍。因此，研究通過預(yù)防和治療心肌肥厚以減少死亡風(fēng)險[5]。但心肌肥厚的潛在分子機制很少被了解。為了防止心衰的發(fā)生，明確心肌肥厚的分子機制是十分必要的。

蛋白激酶在心肌生長和肥厚反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。各種激酶能將肥厚信號從細胞膜傳遞到受體并且改變重要功能蛋白的磷酸化過程[6]。TNNI3K （cardiac troponin I-interacting kinase）是心臟特異性表達的激酶基因，心肌肌鈣蛋白Ⅰ和心肌肌動蛋白等一系列肌小節(jié)收縮調(diào)節(jié)蛋白基因為該基因的相關(guān)分子[7]，臨床研究推測在超負荷心肌肥厚的發(fā)生過程中，TNNI3K可能發(fā)揮調(diào)控心肌收縮的重要作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是引發(fā)心肌肥厚的重要神經(jīng)-內(nèi)分泌信號之一，其最終活性物質(zhì)為血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）[8]。體外實驗表明機械應(yīng)力可引起大鼠心肌細胞分泌AngⅡ、ET1和EGF等因子，此外，牽拉和AngⅡ均可使心肌細胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達升高，如TPK、MAPK、PKC和DG等[9]。因此，本研究選用AngⅡ引發(fā)乳鼠心肌細胞肥大模型，觀察心肌細胞的形態(tài)、功能變化與TNNI3K基因表達的關(guān)系，為深入研究心肌肥厚分子機制提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗動物 新生Sprague Dawley（ SD）大鼠16只，對照組和實驗組各8只，1～3 d齡，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2實驗材料 實驗中所應(yīng)用的檢測及顯色試劑盒均由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品生產(chǎn)。主要試劑試劑TNNI3K單克隆抗體（阜外心血管病醫(yī)院孟憲敏教授提供）；血管緊張素Ⅱ、EDTA和胰蛋白酶為Sigma產(chǎn)品；L-DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清購自四季清公司；谷氨酰胺、丙酮酸鈉、BrdU為上海今邁生物科技有限公司。

1.3方法 實驗組大鼠采用AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞肥大，對照組未采用AngⅡ誘導(dǎo)。

1.3.1乳鼠心肌細胞培養(yǎng) （1）配置0.08%胰蛋白酶原代消化液100～200 mL，并通過0.22 μm微孔濾膜除菌。（2）準備3個小培養(yǎng)皿，分別加入30 mL 的PBS液，但在第一個培養(yǎng)皿中加入的是含肝素的PBS液；用DMEM、10%國產(chǎn)血清及雙抗生素配置中和液備用，取3～4個50 mL離心管，每管中都加入中和液15～20 mL以中和胰酶；1根粗頭且光滑的滴管、1根移液管、2把彎剪、2把鑷子（1彎，1直）。（3）選取SD乳鼠，75%酒精浸泡約1 min，然后經(jīng)無菌手套取出，放入大培養(yǎng)皿中，手夾住乳鼠背部皮膚，保持乳鼠胸部向上的體位，同時將其胸腹部皮膚消毒，沿胸骨劍突剪開胸腔，同時用手擠壓乳鼠的背部，使心尖突出胸腔，用彎頭眼科鑷反向取出心臟，將其放入第一個培養(yǎng)皿中；將剪去心房的透明組織放入第二個培養(yǎng)皿中；將血管后分離出的心室放入第三個培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中的組織用PBS液沖洗，沖凈殘血。（4）將半滴管原代消化液加入一干凈小燒杯，并加入1 mm×1 mm×1 mm大小的心室肌組織小塊，棄去上清液后加入0.08%胰蛋白酶原代消化液。用滴管將浸透的小塊心室肌組織移入小錐形瓶內(nèi)，再用原代消化液將其洗入小錐形瓶內(nèi)，在37 ℃恒溫水浴條件下磁力攪拌消化8 min，將第二遍消化液移入含中和液的50 mL的離心管中，再加入15 mL的原代消化液，繼續(xù)于37 ℃恒溫水浴磁力攪拌消化8 min，將混濁消化液移入50 mL離心管中，加滿為止，該步驟重復(fù)多次，直至組織消化完全。（5）用DMEM、10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉及雙抗生素配成心肌培養(yǎng)液備用，同時將收集的心肌細胞以1000rpm的速度離心5 min，棄去上清液后與配好的心肌培養(yǎng)液混勻。（6）細胞懸液用無菌260目濾器過濾至T50培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃ CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，進行差速貼壁法分離成纖維細胞。（7）心肌培養(yǎng)液與0.1 mmol/L BrdU配成心肌細胞原代培養(yǎng)液備用，BrdU在DNA復(fù)制過程中摻入DNA雙鏈而致其斷裂，引起繁殖能力旺盛的細胞死亡，進而抑制成纖維細胞的增生。取出培養(yǎng)瓶，將上清液吸入50 mL離心管中，用PBS洗一次，PBS也吸入離心管中，1000rpm的速度離心2 min，棄去上清液，加適量心肌細胞原代培養(yǎng)液與懸浮細胞混勻，以約1×106/cm3的密度接種于6孔培養(yǎng)板，然后將其置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（8）24 h后換液，之后根據(jù)細胞生長情況，2～3 d更換1次培養(yǎng)基（48 h心內(nèi)肌細胞原代培養(yǎng)液可不加BrdU），倒置顯微鏡下觀察。

1.3.2AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞肥大模型的建立 心肌細胞的分離及原代培養(yǎng)方法同上，將其以約1×106/cm3的密度接種于6孔培養(yǎng)板中，平均分為兩組，每組3孔。用含有10%的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞兩天后換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一天后實驗組中加入AngⅡ（10 μmol/L）。在此期間，每隔48 h換一次液，每隔24 h加入相同劑量的AngⅡ。對照組為空白實驗，即不加AngⅡ。

1.3.3心肌細胞表面積的觀察和測量 體外培養(yǎng)的新生乳鼠心肌細胞AngⅡ處理后4 d，在倒置相差顯微鏡（×400放大）下隨即挑選10個區(qū)域進行拍照，圖像分析軟件 （ImageProPlus 6.0）對挑選的細胞進行表面積的測量，取其均值進行比較。

1.3.4免疫組織化學(xué)法測定心肌細胞TNNI3K基因表達的變化 將6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)放置預(yù)先消毒處理的蓋玻片，接種原代培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞，48 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗兩次，以95%乙醇固定20 min，洗滌固定過程完畢后均由冷風(fēng)吹干，然后進行間接細胞免疫化學(xué)染色。保持室溫恒定，加0.3%H2O2-甲醇15 min，雙蒸水洗滌3次；0.5% Triton X-100-PBS作用5 min，PBS洗滌3次，加小鼠抗人TNNI3K抗體（1∶200稀釋），4 ℃環(huán)境下孵育過夜。PBS洗滌3次；37 ℃環(huán)境下，辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗小鼠Envision工作液孵育45 min，PBS洗滌3次，滴加顯色劑DAB/H2O2，避光顯色5 min，清水沖洗，蘇木素復(fù)染，雙蒸水在沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明透化，最后利用中性樹膠進行封片，整個顯色過程在顯微鏡下實時監(jiān)控，觀察心肌纖維形態(tài)變化并拍照，實驗組所應(yīng)用的光學(xué)顯微鏡有日本Nikon公司生產(chǎn)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t或t′檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

實驗組乳鼠心肌細胞肥大，平均直徑（42.48±1.91）μm，面積（1546.428±633.61）μm2，對照組乳鼠心肌細胞平均直徑（35.81±2.36）μm，面積（1032.672±334.35）μm2。提示AngⅡ誘導(dǎo)乳鼠心肌細胞肥大模型成功。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，光密度分析顯示，模型細胞中TNNI3K基因的蛋白表達增強，其累積光密度（IOD）為（202.86±74.40）OD，見圖1～3、表1。

圖1　對照組心肌細胞TNNI3K表達（免疫組織化學(xué)×200）

圖2　實驗組心肌細胞TNNI3K表達（免疫組織化學(xué)×200）

圖3　心肌細胞測量*與對照組比較，P<0.05

表1　心肌細胞測量（±s）

表1　心肌細胞測量（±s）

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別　平均直徑（μm）　面積（μm2）　平均強度　IOD（OD）對照組（n=8）　35.81±2.36　1032.672±334.35　0.15±0.03　147.41±52.32實驗組（n=8）　42.48±1.91*1546.428±633.61**0.14±0.05　202.86±74.40**

3　討論

心肌細胞受到機械牽拉、神經(jīng)內(nèi)分泌等刺激因素易導(dǎo)致心肌肥厚，其產(chǎn)生機制復(fù)雜，是臨床研究和試驗心肌學(xué)的熱門課題之一[10]。TNNI3K是新近發(fā)現(xiàn)的一類蛋白激酶，推測其可能與一系列收縮有關(guān)的肌小節(jié)蛋白發(fā)生相互作用來調(diào)控心肌收縮能力，從而影響心肌肥厚的發(fā)展[11]。病理性心肌肥厚與間質(zhì)纖維化、細胞死亡、心臟功能障礙密切相關(guān)，并且它是心衰形成的重要危險因素[12]。

筆者之前的研究證實，在壓力超負荷心肌肥厚的動物模型中，除心肌細胞肥厚，肌節(jié)延長，線粒體增加等結(jié)構(gòu)改變外，還可見細胞凋亡及細胞間質(zhì)纖維化[13]。在心肌肥厚早期，未見明顯的細胞凋亡及就、細胞外基質(zhì)纖維化時，TNNI3K的表達無明顯增強，但在心肌肥厚的中、晚期，凋亡細胞增多，間質(zhì)纖維化出現(xiàn)時，TNNI3K的表達則明顯增強[14]。提示TNNI3K可能與心肌細胞的凋亡及纖維化的發(fā)生有關(guān)。此外，有研究證實TNNI3K也參與生理性心肌肥厚[15]。具體的作用途徑尚需研究。

在壓力負荷的持續(xù)作用下，心肌組織發(fā)生一系列變化，首先即刻早期基因（如c-fos，c-myc，c-jun等）被激活，隨之胎兒型基因被沖洗激活，肌球蛋白和肌動蛋白的基因表達增強，致使心肌蛋白合成的增加，細胞體積的增大，心肌細胞的表型改變[16]。同時伴有細胞外基質(zhì)的沉積和反應(yīng)性間質(zhì)纖維化。在心肌細胞感受機械刺激過程中，心肌細胞通過牽拉激活的離子通道的開放或活性增強、受體酪氨酸激酶的激活及整合素等發(fā)揮重要作用。TNNI3K屬整合素連接激酶（ILK）家族，它是否參與了機械信號感受過程尚未見報道[17]。本研究結(jié)果顯示，在超負荷心肌肥厚的早期，TNNI3K基因表達無明顯增強，說明TNNI3K可能不是此過程中的關(guān)鍵因子。

在壓力超負荷心肌肥厚的發(fā)病機制中，神經(jīng)-體液信號同樣發(fā)揮重要作用，它們在cAMP及三磷酸肌醇-二酰甘油系統(tǒng)的作用下，與心肌細胞膜的特異性受體結(jié)合，促進蛋白合成和細胞增生[18]。腎素血管緊張素系統(tǒng)是重要的神經(jīng)-體液信號，其主要的作用因子為血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）。AngⅡ參與心肌增生的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而促進細胞合成蛋白，最終造成心肌細胞肥大[19]。此外AngⅡ還可以增強培養(yǎng)的人心臟成纖維細胞的分裂和增殖，促進其與Ⅰ和Ⅱ型膠原的黏附，加速心肌肥厚和纖維化[20-21]。在AngⅡ影響心肌細胞的過程中，TNNI3K是否參與之？本研究結(jié)果顯示，TNNI3K在AngⅡ誘導(dǎo)的肥厚細胞表達明顯增強，表明TNNI3K可能參與AngⅡ?qū)π募〖毎挠绊憽５ㄟ^何種途徑與AngⅡ發(fā)生聯(lián)系尚需進一步研究。

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Correlation between Cardiac Hypertrophy and TNNI3K Gene Expression

YANG Dong，MI Li-guo，WANG Qie.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：020-023

Objective：To investigate the relationship between Ang induced cardiac hypertrophy and TNNI3K gene expression.Method： The expression of TNNI3K gene was detected in the model by AngⅡ induced cardiac hypertrophy in rats.Result：The expression of TNNI3K gene in the experimental group was enhanced by AngⅡ. Conclusion：TNNI3K gene is involved in the mechanism of Ang induced cardiac hypertrophy in neonatal rats.

TNNI3K； Myocardial cell primary culture； AngⅡ

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.006

①河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院東院 河北 石家莊 050000

②河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

米立國

2016-12-22） （本文編輯：蔡元元）