郭秀秀

安徽省宿州市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽　宿州　234000

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復(fù)方甲苯咪唑乳膏微生物限度檢查方法的研究

郭秀秀

安徽省宿州市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽宿州234000

【摘要】目的：建立復(fù)方甲苯咪唑乳膏的微生物限度檢查方法。方法：按《中國(guó)藥典》2015年版第三部通則非無(wú)菌微生物限度檢查法規(guī)定的常規(guī)法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以常規(guī)法驗(yàn)證回收率均大于70%，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對(duì)照組和試驗(yàn)組生長(zhǎng)良好。結(jié)論：需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)采用常規(guī)的平皿傾注法，控制菌的檢查采用常規(guī)法。

【關(guān)鍵詞】復(fù)方甲苯咪唑乳膏；微生物限度檢驗(yàn)法；藥品檢驗(yàn)

1儀器與材料

1.1試驗(yàn)環(huán)境根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》第三部“9203藥品微生物質(zhì)量管理原則”[3]規(guī)定，試驗(yàn)在環(huán)境潔凈度B級(jí)、局部潔凈度A級(jí)的單向流空氣的無(wú)菌室進(jìn)行，陽(yáng)性菌操作在符合國(guó)家Ⅱ級(jí)生物安全標(biāo)準(zhǔn)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

1.2儀器BHC-1300ⅡA2型生物安全柜(蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司)；GHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海金慧科電子有限公司)；MJX-160B-Z型微電腦霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器(上海市博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；TZQ-Ⅱ型勻質(zhì)器型號(hào)(天津市津德實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)開(kāi)發(fā)中心)。

1.3材料復(fù)方甲苯咪唑乳膏(批號(hào)：160101、160102、160103，宿州億帆藥業(yè)有限公司)，0.1%無(wú)菌吐溫溶液、pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(自配)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號(hào)：20151210-00)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號(hào)：20160111-00)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA，批號(hào)：20151110-00)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20150716-00)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：20151026-00)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB，批號(hào)：20151112-00)等均由杭州微生物試劑有限公司提供。

1.4試驗(yàn)菌種銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10 104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63 501]、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]等由中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心和中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)為3代。

2方法與結(jié)果

2.1菌懸液的制備及菌懸液菌落數(shù)的檢查

2.1.1菌懸液的制備取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的銅綠假單胞菌的TSB培養(yǎng)物1ml，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6備用，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌用同樣方法分別稀釋至10-5和10-8備用，取經(jīng)25℃培養(yǎng)2～3天的白色念珠菌的SDB培養(yǎng)物1ml，用上述方法稀釋至10-5，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加4mlpH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6，備用。

2.1.2菌懸液中菌落數(shù)的檢查取“2.1.1”銅綠假單胞菌10-6級(jí)菌懸液、枯草芽孢桿菌10-5級(jí)菌懸液、金黃色葡萄球菌10-8級(jí)菌懸液各0.1ml，分別用已滅菌的45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測(cè)定兩皿；取2.1.3白色念珠菌10-5級(jí)菌懸液、黑曲霉10-6孢子菌懸液各0.1ml，分別用已滅菌的45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和已滅菌的45℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測(cè)定兩皿，按《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定溫度培養(yǎng)一定時(shí)間，計(jì)數(shù)，均應(yīng)不大于100cfu/ml；實(shí)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，符合要求。

表1　試驗(yàn)用菌液檢查(菌落計(jì)數(shù)結(jié)果平均值、單位：cfu/ml)

2.2供試液制備取本品最小包裝兩支(10g/支)，按微生物限度檢查法規(guī)定稱取10g，加40℃無(wú)菌0.1%吐溫溶液至100ml，勻漿儀2000轉(zhuǎn)/min，3min混勻，即為1∶10的供試品溶液。

?有關(guān)該調(diào)查會(huì)來(lái)寧訪問(wèn)的情況，可參考王楠《尋找證據(jù)——1984年日本調(diào)查團(tuán)的南京之行及其意義》，《江海學(xué)刊》2017年第5期。

2.3需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn)

2.3.1采用常規(guī)法(即平皿傾注法) 進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。

2.3.1.1試驗(yàn)組取5支裝有1∶10供試液的試管，分別加“2.1.1”試驗(yàn)菌液0.1ml，使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu，分別取上述試驗(yàn)液1ml，置直徑90mm的無(wú)菌平皿中，立即注入20ml溫度不超過(guò)45℃熔化的無(wú)菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或無(wú)菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.3.1.2菌液對(duì)照組取pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按試驗(yàn)組操作。

2.3.1.3供試品對(duì)照組取“2.2”制備好的供試液，以無(wú)菌0.1%吐溫溶液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

2.3.1.4陰性對(duì)照取無(wú)菌0.1%吐溫溶液1ml置90mm的無(wú)菌平皿中，立即注入20ml溫度不超過(guò)45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

表2　需氧菌總數(shù)常規(guī)法計(jì)數(shù)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(常規(guī)法)

表3　霉菌和酵母菌總數(shù)常規(guī)法計(jì)數(shù)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(常規(guī)法)

注：表中T3表示菌種代數(shù)，下同。

從表2、表3可知，3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)的比值均在0.5～2范圍內(nèi)。2.4控制菌檢查方法的適用性試驗(yàn)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查方法的適用性試驗(yàn)：按常規(guī)法進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。

2.4.1試驗(yàn)組分別取“2.2”中1∶10供試液10ml及上述不大于100cfu/ml的銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌1ml,分別接種置90ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)18～24h，按相應(yīng)的控制菌的檢查法檢查。

2.4.2菌液對(duì)照組取pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，同試驗(yàn)組操作。

2.4.3供試品對(duì)照組取1∶10供試液10ml，以0.1%無(wú)菌吐溫溶液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

2.4.4陰性對(duì)照組取無(wú)菌0.1%吐溫溶液11ml,接種置90ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)18～24h，按相應(yīng)的控制菌的檢查法檢查。

表4　控制菌檢查方法的結(jié)果

由表4方法驗(yàn)證結(jié)果可以看出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對(duì)照組、試驗(yàn)組生長(zhǎng)良好，說(shuō)明復(fù)方甲苯咪唑乳膏對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌無(wú)抑菌作用或抑菌作用較弱。

3討論

3.1由上述驗(yàn)證結(jié)果可知，三批復(fù)方甲苯咪唑乳膏在需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查的方法適用性試驗(yàn)中，平皿法對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌的回收試驗(yàn)均符合要求；從表4可知，控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查可采用常規(guī)法檢查。3.2培養(yǎng)基影響本次驗(yàn)證所用培養(yǎng)基均由杭州微生物試劑有限公司提供，在驗(yàn)證前每批培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌及性能檢查，符合2015版《中國(guó)藥典》要求方可用于微生物方法驗(yàn)證。

3.3菌種及菌液影響因素《中國(guó)藥典》2015年版要求選用標(biāo)準(zhǔn)菌株，實(shí)驗(yàn)所用黑曲霉菌株由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，其他菌株由中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供，均選用第3代為試驗(yàn)菌，符合《中國(guó)藥典》2015版實(shí)驗(yàn)菌株不得超過(guò)5代的標(biāo)準(zhǔn)。菌懸液制備完成后立即使用，未超過(guò)《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定的“菌液制備后室溫下放置，應(yīng)在2h內(nèi)使用”的要求。

3.4培養(yǎng)條件影響因素《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定需氧菌用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃～35℃，培養(yǎng)時(shí)間不得超過(guò)3d，實(shí)驗(yàn)取33℃，培養(yǎng)3d，符合要求。霉菌和酵母菌采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20℃～25℃培養(yǎng)時(shí)間不超過(guò)5d，本實(shí)驗(yàn)采用25℃培養(yǎng)5d，符合要求。

3.5稀釋劑的影響因乳膏供試品不易混和均勻，故實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用0.1%無(wú)菌吐溫溶液溶解供試品，再用勻漿儀進(jìn)行攪拌混合。然后用pH7.0無(wú)菌氯化鈉未檢出蛋白胨緩沖液(自配)稀釋到合適稀釋級(jí)，符合《中國(guó)藥典》2015年版油脂類供試品處理要求。

3.6菌落計(jì)數(shù)是方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中極為重要的一步，實(shí)驗(yàn)采用含菌量不大于100cfu/ml菌懸液，計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)仔觀察，必要時(shí)可借助放大鏡、兩人復(fù)核等方法，減少操作誤差。

參考文獻(xiàn)

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【中圖分類號(hào)】R286.0

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)11-0012-02

(收稿日期：2016.04.11)