王　寧， 陳騰祥， 劉振華， 王飛清， 潘　婭

(1.貴州省骨科醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽　550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生理教研室， 貴州 貴陽　500004； 3.貴州省人民醫(yī)院 肝膽外科， 貴州 貴陽　550001； 4.貴州省中醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽　550001)

Calpain-1及Calpain-2在不同遷移能力肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)*

王寧1**， 陳騰祥2***， 劉振華3， 王飛清4， 潘婭2***

(1.貴州省骨科醫(yī)院 藥劑科， 貴州 貴陽550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 生理教研室， 貴州 貴陽500004； 3.貴州省人民醫(yī)院 肝膽外科， 貴州 貴陽550001； 4.貴州省中醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽550001)

[摘要]目的： 研究鈣激活中性蛋白酶蛋白-1(Calpain-1)及Calpain-2在不同遷移能力肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)。方法： 常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)高遷移能力的MHCC97-H、低遷移能力的MHCC97-L、無遷移能力的HepG2的人肝癌細(xì)胞及正常人肝HL-7702細(xì)胞，采用western-bolt方法觀察Calpain-1及Calpain-2在3株人肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果： Calpain-1在正常肝細(xì)胞HL-7702、高遷移能力的MHCC97-H、低遷移能力的MHCC97-L及無遷移能力的HepG2細(xì)胞中均有表達(dá)，表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；與正常肝細(xì)胞HL-7702比較，高、低、遷移能力肝癌細(xì)胞系中Calpain-2不同程度表達(dá)，隨著細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)而成遞增趨勢，P<0.01或P<0.05。結(jié)論： Calpain-2隨肝癌細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)表達(dá)增加，表明Calpain-2與肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移可能有密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞]癌，肝細(xì)胞； 鈣激活中性蛋白酶蛋白； 遷移能力

原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)目前在我國的死亡率高居癌癥的第2位，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)查其患病率約占全球癌癥患病率的55%[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，組織中的鈣激活中性蛋白酶(calcium activated neutral protease,Calpain)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞的遷移能力有明顯影響[3]，這在防治肝癌轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)研究中報(bào)道甚少。本研究選擇不同轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常肝細(xì)胞HL-7702作為研究對(duì)象，通過Western Blot研究Calpain家族中Calpain-1和Calpain-2蛋白在肝癌患者發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的表達(dá)情況，為臨床治療肝癌發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點(diǎn)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料試劑與儀器

人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常人肝細(xì)胞HL-7702均由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫提供，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)，原裝引進(jìn)USA Cell Signaling Technology(Calpain-1、2的一抗、羊抗兔二抗血清)，原裝引進(jìn)USA Merck Millipore PVDF轉(zhuǎn)化膜，Thermo Scientific CO2培養(yǎng)箱，實(shí)驗(yàn)通用蛋白定量試劑盒(BCA)、碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)蛋白質(zhì)上樣緩沖液，Beckman Coulter產(chǎn)實(shí)驗(yàn)專用高速冷凍離心機(jī)， Syngene 產(chǎn)GBOX iChemiXR化學(xué)發(fā)光及凝膠成像儀，北京六一公司產(chǎn)垂直型蛋白電泳系統(tǒng)和電泳儀。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)與處理人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和正常肝細(xì)胞HL-7702細(xì)胞為貼壁生長，用DMEM培養(yǎng)基+10% FBS(胎牛血清)，放置在37 ℃，5% CO2孵箱環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)生長的癌細(xì)胞密度為80%左右時(shí)，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將癌細(xì)胞傳代與標(biāo)記皿中繼續(xù)培養(yǎng)，在冰上用RIPA裂解液裂解培養(yǎng)已伸展完全的癌細(xì)胞，低溫高速離心細(xì)胞液取上清液制備蛋白樣品。

1.2.2免疫印記實(shí)驗(yàn) 依據(jù)蛋白定量試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟，對(duì)樣品蛋白進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)樣本化學(xué)發(fā)光顯色，用免疫印記實(shí)驗(yàn)?zāi)z成像儀對(duì)已顯色的樣本成像顯示Calpain-1及Calpain-2 含量和磷酸化情況分析。

2結(jié)果

2.1Calpain-1表達(dá)

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞(MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2)中Calpain-1蛋白表達(dá)，與正常人肝細(xì)胞HL-7702相比，Calpain-1的表達(dá)變化不明顯，P>0.05。見圖1。

2.2Calpian-2表達(dá)

如圖2所示，Calpain-2在3種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞HL-7702 。與正常肝細(xì)胞HL-7702比較，高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-H中 Calpain-2的表達(dá)增高明顯，P<0.01，其低分子量(low molecular weight,LMW)剪切片段形式顯著增多，可見Calpain-2被剪切有至少6種LMW片段；在低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-L中，Calpain-2的表達(dá)異常，P<0.01，Calpain-2也可被剪切2種LWM片段；不轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞(HepG2)Calpain-2的表達(dá)比HL-7702高，P<0.05。

注：A為Western blot結(jié)果，B為A的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(1)P<0.05，(2)P<0.01 vs Control圖2　MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2和HL-7702中Calpain-2的表達(dá)Fig.2　Expressions of Calpain-1 in MHCC97-H,MHCC97-L, HepG2 and, HL-7702

3討論

腫瘤發(fā)生發(fā)展是多因素、多基因、多階段才最終形成的十分復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，具有細(xì)胞黏附、基質(zhì)降解、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)3個(gè)最基本步驟。Calpain是鈣蛋白Cal(Calmoclulin)和木瓜蛋白酶pain(Papain)兩者以非共價(jià)鍵結(jié)合形成。Calpain有多種同工酶，按照其分布特點(diǎn)可將其分為兩大類，一類具有組織特異性，另一類非組織特異性蛋白酶[4]。近年來，非組織特異性蛋白酶的研究比較深入，其已知的2種亞型是Calpain-1(也稱μ-calpain)和Calpain-2(也稱m-calpain)，它們的激活需要不同濃度的鈣離子水平，在不同的生理或病理狀態(tài)下，Calpain-1或Calpain-2的生物學(xué)作用也不同[5]，在很多應(yīng)激的情況下，Calpain家族蛋白的表達(dá)和活性都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，而這些活性的變化與細(xì)胞周期、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞凋亡[6]、細(xì)胞骨架重塑與遷移有著密切的關(guān)系，在癌細(xì)胞中，這種明顯異常的變化，提示Calapin家族蛋白參與了癌細(xì)胞的惡性演變，研究認(rèn)為Calpain與細(xì)胞的遷移浸潤有關(guān)[7-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌或前列腺癌細(xì)胞中，Calpain-2可以直接使細(xì)胞遷移方向的后方細(xì)胞皮質(zhì)的絲狀肌(filamentousactin，F(xiàn)-actin)解體[9]。相關(guān)文獻(xiàn)前期研究報(bào)道，癌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度在惡性腫瘤細(xì)胞中的含量表現(xiàn)明顯的升高，其細(xì)胞的離子內(nèi)環(huán)境平衡狀態(tài)發(fā)生紊亂，實(shí)驗(yàn)研究提示肝癌細(xì)胞中的Calpain 發(fā)揮功能機(jī)制作用可能是在高濃度Ca2+的環(huán)境下[10]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤治療效果不佳和患者最終出現(xiàn)死亡的重要原因之一，也是極為復(fù)雜、多分子水平改變、涉及多基因的過程，大約有細(xì)胞異常的增殖、腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶上脫落、侵犯組織血管或淋巴管、遷移，黏附著于遠(yuǎn)處管腔床、侵入靶器官和遠(yuǎn)處部位形成繼發(fā)腫瘤等表現(xiàn)[11]。而在以人纖維肉瘤細(xì)胞、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等癌細(xì)胞為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道中，認(rèn)為Calpain-2可以作為抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[12-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞MHCC97-H、MHCC97-L、HepG2中Calpain的家族成員Calpain-2的表達(dá)顯著增多，尤其是在高轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞MHCC97-H中，calpain-2的蛋白表達(dá)最高，且隨著肝癌細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)，calipain-2的蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)遞增現(xiàn)象，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Calpain-2在肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力中發(fā)揮作用。

綜上所述，Calpain-2在3種肝癌細(xì)胞(無、低、高遷移能力)中的表達(dá)隨遷移能力的增強(qiáng)而增加，表明Calpain-2可能與肝癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，其可能成為評(píng)價(jià)肝癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)之一。Calpain-2有望成為肝細(xì)胞癌臨床靶向治療的新靶點(diǎn)，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

[1] Jemal A,Bray F,center MM,et al.Global cancer statistics [J].CA:a Cancer Journal for Clinicians, 2011(2):69-90.

[2] Center MM,Jenmal A.International trends in liver cancer incidence rates [J].Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 2011(11):2362-2368.

[3] Storr SJ，Carragher NO，F(xiàn)rame MC，et al． The calpain system and cancer[J]．Nat Rev Cancer， 2011(5):364-374.

[4] Schád E,Farkas A,Jékely G,et al.A novel human small subunit of calpains. Biochem J, 2002(362):383-388.

[5] Goll DE，Thompson VF，Li H，et al．The calpain system[J]．Physiol Rev， 2003 (3):731-801.

[6]Goll DE.The calpain system[J].Physiol Rev, 2003(3):731-801.

[7] Jang HS，Lal S，Greenwood JA．Calpain 2 is required forglioblastoma cell invasion: regulation of matrix metalloproteinase 2[J]．Neurochem Res， 2010 (11):1796-1804.

[8] Wu M，Yu Z，F(xiàn)an J，et al．Functional dissection of human protease mu- calpain in cell migration using RNAi[J]．FEBS Lett， 2006(13):3246-3256.

[9] Storr SJ,Lee KW,Woolston CM,et al.Calpain system protein expression in basal-like and triple-negative invasive breast cancer[J].Ann Oncol, 2012(9):2289-2296.

[10]Tang J, Wu YM, Zhao P, et al. Overexpression of HAb18G/CD147 promotes invasion and metastasis via alpha3beta1 integrinmediated FAK-paxillin and FAK-PI3K-Ca2+pathways [J]. Cell Mol Life Sci, 2008(18):2933-2942.

[11]Nakayama H,Yasui W, Yokozaki H,et al.Reduced expression of nm23 is associated with metastasis of human gastric carcinomas[J].Jpn J Cancer Res, 1993(2)：184-190.

[12]Jang HS，Lal S，Greenwood JA．Calpain 2 is required for glioblastoma cell invasion: regulation of matrix metallopro-teinase 2[J]．Neurochem Res， 2010 (11):1796-1804

[13]Carragher NO，Walker SM，Scott Carragher LA，et al．Calpain 2 and Src dependence distinguishes mesenchymal and amoeboid modes of tumour cell invasion: a link to integrin function[J]．Oncogene， 2006(42):5726-5740．

[14]Mamoune A，Luo JH，Lauffenburger DA，et al．Calpain-2 as a target for limiting prostate cancer invasion[J]．Cancer Res， 2003(15):4632-4640．

[15]Noma H，Kato T，F(xiàn)ujita H，et al．Calpain inhibition induces activation of the distinct signalling pathways and cell migration in human monocytes[J]．Immunology, 2009 (1):e487-e496．

[16]Storr SJ，Carragher NO，F(xiàn)rame MC，et al．The calpain system and cancer[J]．Nat Rev Cancer, 2011(5):364-374．

(2016-03-12收稿，2016-05-28修回)

中文編輯： 潘婭； 英文編輯： 劉華

Expression of Calpain 1 and 2 in Liver Cancer Cells with Different Migration Abilities

WANG Ning1, CHEN Tengxiang2, LIU Zhenhua3, WANG Feiqing4, PAN Ya2

(1.DepartmentofPharmaceuticalPreparation,GuizhouProvinceOstelolgicalHospital,Guiyang550002,Guizhou,China;2.DepartmentofPhysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China; 3.DepatmentofLiverandGallSurgery,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,Guizhou,China; 4.ClinicalLaboratory,GuizhouProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate protein expression of Calpain-1 and Calpain-2 in liver cancer cell line with different migration ability. Methods: MHCC97-H (highly migratory liver cancer cells), MHCC97-L (lowly migratory liver cancer cells), HepG2 (liver cancer cells with no migration ability) and HL-7702 (normal liver cells) were routinely cultured. Western-blot method was used to observe protein expression of Calpain-1 and Calpain-2 in the three human liver cancer cell lines and the normal liver cell. Results: There were protein expressions of Calpain-1 in HL-7702, MHCC97-H, MHCC97-L and HepG2, and the difference was not statistically significant (P<0.05). Compared with normal liver cells HL-7702, Calpain-2 showed the different degrees of protein expression in high, low, migration ability of liver cancer cell line , and the protein expression of Calpain-2 significantly enhanced with increasing cell migration ability (P<0.01 or P<0.05). Conclusions: Calpain-2 shows an increasing protein expression with the enhancement of the migration ability of liver cancer cells, which indicates that calpain-2 may be closely related to the invasion and metastasis of liver cancer cells.

[Key words]carcinoma,hepatocellular; Calpain; migration ability

*[基金項(xiàng)目]貴州省科技廳科研基金[黔科合LG字(2011)008]; 貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目[黔教科(2008)022]

[中圖分類號(hào)]R735.7

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)06-0649-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.007

**貴州醫(yī)科大學(xué)2014屆碩士研究生

***通信作者 E-mail:710232517@qq.com；371251826@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1742.058.html