張肄鵬, 張惠玲, 張　青, 黃　珍, 劉衛(wèi)東, 周麗英

(深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院， 深圳 廣東　518110)

一管法MLPA熒光探針溶解曲線分析技術(shù)檢測15種高危型HPV方法的建立*

張肄鵬, 張惠玲, 張青, 黃珍, 劉衛(wèi)東, 周麗英

(深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院， 深圳 廣東518110)

[摘要]目的： 結(jié)合多重連接依賴探針擴增(MLPA)和熒光探針溶解曲線分析技術(shù)，建立一種一管法同時檢測并分辨15種高危型HPV的方法。方法： 根據(jù)各HPV亞型的特異性序列設計MLPA探針，并在各亞型的MLPA探針中加入溶解溫度(Tm)不同的人工核酸序列作為識別標志；使用特殊的耐高溫連接酶和熱啟動Taq酶，通過溫度控制使探針雜交、連接、PCR在一管反應中順序進行；以各HPV亞型102拷貝至106拷貝的標準品質(zhì)粒作為模版進行敏感度實驗；將102～106拷貝的HPV亞型標準品進行兩兩混合作為模版，檢測本方法對混合樣本的檢測能力；使用本方法和HPV分型試劑盒(導流雜交法)對臨床樣本進行平行檢測，比較2種方法的差異。結(jié)果： 本方法可在一次反應內(nèi)順序完成MLPA探針雜交、連接、擴增3個步驟，擴增結(jié)果可通過不同熒光通道不同Tm值的溶解峰分辨不同的HPV亞型；本方法對標準品的檢測靈敏度比經(jīng)典的MLPA 3步法反應下降約一個數(shù)量級；本方法可同時檢測至少2種HPV亞型的混合感染；對臨床陽性標本的檢出率與導流雜交法結(jié)果基本一致。結(jié)論： 本研究成功建立了一種利用一管法MLPA熒光探針溶解曲線技術(shù)檢測15種高危型HPV的方法。

[關鍵詞]乳頭狀瘤病毒，人； DNA探針，HPV； 溶解曲線分析； 多重連接依賴探針擴增

人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses, HPV)高危亞型的持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變的主要病因[1]。宮頸癌患者、高度病變(CIN2或CIN3)患者及低度病變(CIN1)中的高危型HPV感染率分別為100%、97%與61.4%[2]。目前臨床主要使用RNA探針雜交+化學發(fā)光【HC2，德國Qiagen)、PCR擴增+膜雜交(潮州凱普等)】、或定量PCR(廣州達安等)技術(shù)對高危型HPV感染進行檢測，但這些方法難以同時實現(xiàn)高通量閉管操作和多靶點同時檢測的要求。多重連接依賴探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification ，MLPA)是一種DNA定性和半定量分析技術(shù)，可同時檢測40～50個核苷酸序列，通過毛細管電泳分離特定長度的擴增片段來判斷目標基因的有無及相對含量[3]，包括染色體非整倍體改變，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和病原體檢測等[4-5]。但傳統(tǒng)的MLPA產(chǎn)物分析需要進行毛細管電泳或瓊脂糖電泳，不僅費時且有PCR產(chǎn)物氣溶膠污染的風險。本課題組前期在傳統(tǒng)MLPA技術(shù)基礎上建立了一種簡單方便、能通過熒光探針溶解曲線分析來進行HPV分型的方法[6]，本研究在此基礎上加以改進，通過使用特殊的耐高溫連接酶和熱啟動Taq酶，使一步閉管法檢測得以實現(xiàn)，同時將檢測位點擴充至15個HPV亞型，并以此方法對深圳地區(qū)收集的宮頸拭子標本中常見的15種高危型HPV進行篩查。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要儀器和試劑MLPA探針及熒光探針由上海生工合成，質(zhì)粒標準品由上海生工合成或本實驗室自制，其它試劑主要由HPV分型檢測試劑盒(潮州凱普)、細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根)、9N Taq連接酶(北京NEB)、熱啟動Taq酶(北京康為)及熒光定量PCR儀(德國Qiagen Rotorgene Q)等。

1.1.2臨床標本人宮頸拭子脫落細胞臨床標本由深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院檢驗科收集，經(jīng)生理鹽水洗脫后置-20 ℃保存。

1.2方法

1.2.1探針及引物設計從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得各HPV亞型的基因組序列，在HPV病毒E6、E7基因區(qū)域選取各亞型的特異性識別序列，使用AlleleID 6.0軟件設計對應的MLPA探針對，并在各條MLPA右探針的尾部上加入一段不同Tm值的人工序列作為識別序列，該識別序列在PCR擴增完成后可與反向互補的熒光探針結(jié)合，在溶解曲線分析中形成不同熒光通道和Tm值的溶解峰用以分辨不同HPV亞型(表1)。

1.2.2樣本提取用細菌基因組DNA提取試劑盒提取陰道拭子標本中的脫落核酸，按照試劑盒說明進行操作。洗脫的核酸在PCR儀上先進行98 ℃裂解5 min，置-20 ℃保存。

1.2.3一管法MLPA實驗流程取5 μL高溫裂解后的DNA作為模版，反應體系為每對MLPA探針10 fmol/L，每條熒光探針5 nmol/L，正向通用引物 1 nmol/L，反向通用引物10 nmol/L，10×反應緩沖液2.5 μL，連接酶 5 IU，PCR酶2.5 IU，去離子水補齊至25 μL。反應條件為：95 ℃ 1 min 模版變性，56 ℃ 30 min MLPA探針雜交并連接，95 ℃ 10 min激活熱啟動酶，然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s 共35個循環(huán)，最后75 ℃延伸10 min。溶解曲線分析條件為：95 ℃變性3 min，45℃～85 ℃溶解曲線分析，檢測FAM、ROX、Cy5 等3個通道(圖1)。

1.2.4敏感度實驗將各HPV亞型的探針結(jié)合序列插入到PET-19載體中制備質(zhì)粒，定量后取各亞型102拷貝至106拷貝的標準品質(zhì)粒作為模版進行敏感度實驗，實驗條件同1.2.3項。

1.2.5混合樣本檢測將102拷貝至106拷貝的亞型標準品進行兩兩混合作為模版，檢測本方法對混合樣本的檢測能力，實驗條件同1.2.3項。

1.2.6HPV分型對照實驗用HPV分型試劑盒(導流雜交法)對提取的樣本核酸進行平行檢測，操作方法及判讀標準均按照試劑盒說明書。

1.3統(tǒng)計學分析

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析MLPA方法和導流雜交法的結(jié)果差異，使用交叉表檢驗計算Kappa值。

表1　MLPA探針雜交序列和熒光探針溶解溫度

注：大寫字母部分為MLPA探針雜交序列，小寫斜體部分為人工識別序列

圖1　MLPA溶解曲線分析流程Fig.1　Procedure of MLPA melting curve analysis

2結(jié)果

2.1一管法MLPA實驗

取106拷貝各HPV亞型質(zhì)粒標準品作為模板進行一管法MLPA實驗，實驗方法同1.2.3項，在溶解曲線分析中可得到與各MLPA探針上標記序列相對應的不同Tm值的溶解峰，不同HPV亞型的陽性結(jié)果可根據(jù)熒光通道和Tm值進行判讀(圖2)。

注：從左到右55 ℃、61 ℃、67 ℃、72 ℃、78 ℃處溶解峰分別對應51、59、72、83、68亞型HPV標準品模板圖2　一管法MLPA實驗FAM通道溶解曲線Fig.2　Melting curve result in FAM channel of one tube MLPA experiment

2.2敏感度實驗

取102～106拷貝數(shù)各亞型的標準品質(zhì)粒為模版進行敏感度實驗，當模版拷貝量≥104拷貝數(shù)時可見明顯的溶解峰，當模版拷貝量≤103拷貝數(shù)時溶解峰不明顯或無溶解峰，說明該方法的檢測下限為≥104拷貝(圖3)。

注：75℃處的3個溶解峰從高到低為106～104拷貝模板反應形成溶解峰，102和103拷貝模板的反應無溶解峰圖3　HPV35亞型質(zhì)粒標準品102～106拷貝作為模版溶解曲線Fig.3　Melting curve of qPCR of HPV-35 template in plasmid with 102～106 copies

2.3混合樣本實驗

將102拷貝至106拷貝的亞型標準品兩兩混合作為模版，當兩種亞型模版量均≥104拷貝時可見兩個獨立的溶解峰，但峰的高度較單一模版時有所降低，說明混合模版之間存在競爭性抑制的關系，對臨界值的判讀有一定影響。其中部分亞型如HPV73受競爭性抑制影響較大，峰高度較單獨模版時明顯降低(圖4)。

注：淺紫色線為106拷貝數(shù)模板，深紫色線為105拷貝數(shù)模板，深藍色線為104拷貝數(shù)模板，淺藍色線為103拷貝數(shù)模板，藍綠色線為102拷貝數(shù)模板圖4　HPV51 和HPV73(拷貝數(shù)102～106)混合質(zhì)粒作為模版的qPCR溶解曲線Fig.4　Melting curve of qPCR of HPV-51 and -73 templatesin plasmid with 102～106 copies respectively

2.4不同檢測方法的HPV分型結(jié)果

使用導流雜交法與溶解曲線分析法同時檢測250例臨床標本，見表2。

表2　MLPA溶解曲線分析法與導流雜交法檢測250例臨床標本結(jié)果

3討論

MLPA技術(shù)已在遺傳學、腫瘤檢測中得到廣泛應用，但該技術(shù)操作需要雜交、連接、擴增、電泳多個步驟，不僅繁瑣耗時，而且反復開蓋操作增加了核酸樣本氣溶膠交叉污染的風險。溶解曲線分析技術(shù)可通過不同熒光探針Tm值來分辨不同產(chǎn)物，當溶解曲線分析過程中溫度升至熒光探針的Tm值時，熒光探針從結(jié)合的PCR產(chǎn)物上脫落速度達到最大值，熒光值降低，形成一個溶解峰，可通過溶解峰出現(xiàn)的溫度值來區(qū)分不同Tm值的熒光探針，就對相應的病原體DNA進行定性[6-7]。本研究組前期工作通過在MLPA探針上加入熒光探針結(jié)合序列標簽，使在定量PCR儀器上直接讀取MLPA定性結(jié)果得以實現(xiàn)，并成功建立能檢測10種HPV亞型的實驗方法，但當時該方法尚不能實現(xiàn)如普通定量PCR一樣的閉管操作，而需要前期的雜交、連接步驟，增加了實驗的復雜性和污染風險。Qiu等[8]人使用先連接酶鏈式反應(ligation chain reactin，LCR)再PCR擴增的方法檢測HPV，該方法同樣需要先進行連接然后開蓋取連接產(chǎn)物進行PCR，且前期的LCR對模版有指數(shù)擴增作用，進一步增加了氣溶膠污染的風險。

傳統(tǒng)MLPA需要進行多個步驟分步實驗的原因在于探針雜交和PCR擴增不能同步進行，一是兩者所需的緩沖液不同，Taq連接酶需要高Mg2+(10 mM左右)濃度，低pH值(7.4左右)的緩沖液，而Taq DNA聚合酶酶需要低Mg離子(2 mM左右)濃度，高pH值(9.0左右)的緩沖液；二是Taq DNA聚合酶在延伸過程中會使未連接的MLPA左側(cè)探針延伸而切割掉MLPA右側(cè)探針，使MLPA探針連接失敗。9N連接酶是NEB公司推出的耐高溫連接酶，其反應緩沖液與傳統(tǒng)的Taq連接酶相比，對Mg2+和pH值的要求與普通Taq DNA聚合酶接近[9]。本實驗通過引入9N連接酶取代傳統(tǒng)的Taq連接酶使連接反應能與PCR緩沖液兼容，同時使用化學修飾(95 ℃激活時間>10 min)的熱啟動Taq酶，使MLPA探針連接時Taq酶不發(fā)揮作用，通過溫度變化調(diào)控不同酶的反應次序來實現(xiàn)連接反應和PCR反應在同一個反應管中分步完成。實驗證明，雖然一步法由于雜交時K+離子濃度較低使雜交效率下降導致檢測靈敏度低于分步法約一個數(shù)量級，但靈敏度仍可達到104拷貝/反應左右，與HPV檢測金標準之一的HC2閾值(5 000拷貝/反應)相當，可滿足臨床HPV檢測對靈敏度的要求。

本研究使用臨床常用的導流雜交法對250例臨床標本進行了平行試驗對比，發(fā)現(xiàn)兩種方法匹配度比較一致，7例溶解曲線法陽性而導流雜交法陰性標本中經(jīng)測序驗證有5例為假陽性，可能為雜交探針誤擴增導致；5例溶解曲線法陰性而導流雜交法陽性標本中有3例為假陰性，其中2例為混合感染，可能由于檢測靈敏度不足或混合感染造成的競爭性抑制有關。

綜上所述，本研究成功建立了一種可同時檢測15種不同HPV亞型的實驗方法，該方法可在目前臨床常見的熒光定量PCR儀上進行閉管操作，減少了過去MLPA檢測方法開蓋操作造成的污染風險，檢測結(jié)果與導流雜交方法基本一致，可用于臨床HPV檢測，該方法并可推廣到對其它多重病原體的檢測中，顯示出廣闊的應用前景。

4參考文獻

Jemal A, Bray F, Center MM,et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011(2): 69-90.

Li LK, Dai M, Clifford GM, et al. Human papillomavirus infection in Shenyang city, People’s Republic of China: A population-based study[J]. Br J Cancer, 2006(11): 1593-1597.

Piotr K, Anna JJ, David JK. New applications and developments in the use of multiplex ligation-dependent probe amplification[J]. Electrophoresis, 2008(23): 4627-4636.

Lijuan W, Xiao MY, Lei Z, et al. Practical prediction of ten common streptococcus pneumoniae serotypes/serogroups in one PCR reaction by multiplex ligation-dependent probe amplification and melting curve (MLPA-MC) assay in shenzhen, China[J]. Plos One, 2015(7): e0130664.

Donahue AC, Abdool AK, Gaur R, et al. Multiplex ligation-dependent probe amplification for detection of chromosomal abnormalities in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia[J].Leuk Res, 2011(11):1477-83.

張肄鵬, 張惠玲, 張青,等. 一種結(jié)合MLPA和熒光探針溶解曲線分析的HPV分型檢測方法的建立[C]. 中國轉(zhuǎn)化醫(yī)學和整合醫(yī)學研討會(廣州站)論文綜合刊, 2015.

Yi QL, Xiao BW, Chao S, et al. Combination of fluorescence color and melting temperature as a two-dimensional label for homogeneous multiplex PCR detection[J]. Nucleic Acids Res, 2013(7): e76.

Qiu YH, Zan ZL, Yi QL, et al. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes[J]. Plos One, 2011(4): e19206.

Lohman GJ, Bauer RJ, Nichols NM, et al. A high-throughput assay for the comprehensive profiling of DNA ligase fidelity[J].Nucleic Acids Res, 2016(2):e14.

(2016-03-06收稿，2016-05-27修回)

中文編輯： 潘婭； 英文編輯： 趙毅

Establishment of A Method to Detect 15 High Risk HPV Based on One Tube MLPA Melting Curve Analysis Technique

ZHANG Yipeng, ZHANG Huiling, ZHANG Qing, HUANG Zhen, LIU Weidong, ZHOU Liying

(CenterHospitalofLonghuaNewDistrictofShenzhen,Shenzhen518110,Guangdong,China)

[Abstract]Objective: To establish an one-tube method to detect and distinguish 15 high risk HPV based on multiplex ligation dependent probe amplification and fluorescent probe melting curve analysis technique. Methods: Design MLPA probes targeting specific sequences of 15 high risk HPV subtypes and adding artificial nucleic sequences with different melting temperatures to each MLPA probes as identification. Special high temperature tolerant ligase and hot-start PCR enzyme were used to hold hybridization, ligation and PCR process to run sequentially in one tube. Coping HPV subtype 102 to 106 copies standard plasmids as templates to detect the sensitivity of this method. Using 102 to 106 copies mixed standard plasmids to find the detection capability of mixed samples. Parallel detection of clinical samples was used to compare the difference of these two methods. Results: This method could detect at least 3 MLPA subtypes simultaneously. Different HPV subtypes can be distinguished by melting curves of fluorescent probes. The sensitivity of this method is lower an order of magnitude than classical 3 step method. This method had similar accuracy of flow-through hybridization method. Conclusions: Successfully established a 15-high risk HPV detecting method based on one tube MLPA fluorescent probe melting curve analysis technique.

[Key words]human papillomaviruses; multiplex ligation-dependent probe amplification; melting curve analysis

[中圖分類號]R446.52

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0675-06

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.013

網(wǎng)絡出版時間：2016-06-16網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1700.028.html