梁　茜　楊希立　張健瑜　楊　光　崔金環(huán)　肖　平

(佛山市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東　佛山　528000)

CYP2C19基因多態(tài)性對老年冠心病PCI術(shù)后抗血小板治療的影響

梁茜楊希立張健瑜楊光1崔金環(huán)1肖平1

(佛山市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,廣東佛山528000)

〔摘要〕目的探討中國南方漢族人中CYP2C19基因多態(tài)性與冠心病(CHD)氯吡格雷治療后血小板活性的關(guān)系。方法選取擬行冠脈介入術(shù)治療的中國南方漢族老年CHD患者193例，均給予氯吡格雷300 mg負荷劑量，75 mg qd維持劑量。通過流式細胞儀檢測血小板聚集率，采用聚PCR RFLP法基因型進行CYP2C19基因型檢測。根據(jù)不同的基因型人群間氯吡格雷的藥物代謝動力學(xué)特征把攜帶野生型基因(*1/*1)歸為快代謝型，突變雜合型(*1/*2、*1/*3)為中間代謝型、突變純合型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)為慢代謝型。觀察患者在服用氯吡格雷等藥物治療后7 d及14 d血小板聚集率的情況。結(jié)果野生型與中間代謝型、慢代謝型組間血小板聚集程度比較 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中間代謝型、慢代謝型>7 d組血小板活性降低程度顯著優(yōu)于<7 d組，患者CYP2C19基因慢代謝型的比例為9.84%；心血管事件占8.08%，與野生型基因患者相比有差異(P<0.05)。結(jié)論CYP2C19基因突變與CHD PCI術(shù)后氯吡格雷治療血小板活性有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕氯吡格雷；CYP2C19；基因多態(tài)性；心血管事件；血小板聚集率

冠心病(CHD)是發(fā)病率、死亡率和致殘率很高的疾病之一，血小板聚集在其發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。氯吡格雷已被證實能夠抑制血小板功能，并且廣泛應(yīng)用于臨床以防止缺血性事件的發(fā)生并改善疾病的后果。但目前許多研究表明在服用氯吡格雷的過程中部分患者存在氯吡格雷抵抗現(xiàn)象，使心血管不良事件的發(fā)生率增高，氯吡格雷反應(yīng)性的個體差異很大程度取決于其活性代謝產(chǎn)物的形成〔1〕。CYP2C19是氯吡格雷在體內(nèi)生物代謝的重要酶，經(jīng)CYP450代謝轉(zhuǎn)化活性代謝產(chǎn)物，通過抑制ADP受體依賴性的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物的形成而抑制血小板的聚集， CYP2C19基因多態(tài)性的存在與該酶活性密切相關(guān)〔2〕。本實驗旨在探討CYP2C19基因在中國南方漢族人群中的分布及其與CHD患者PCI術(shù)后氯吡格雷治療血小板活性的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對象選取2010年2月至2012年6月在我院心內(nèi)科住院的CHD患者193例，均為廣東佛山地區(qū)居住漢族人；經(jīng)冠狀動脈造影檢查確診CHD(至少一支心外膜下冠狀動脈或其主要分支直徑狹窄≥50%)，并行PCI術(shù)后；年齡60～72歲、相互無親緣關(guān)系；排除肝腎疾病。

1.2氯吡格雷服用所有患者在入院前未服用過氯吡格雷藥物，入院后服用氯吡格雷(商品名：波立維；杭州賽諾菲有限公司) ，服用方法為：第1天予以負荷劑量300 mg；繼之75 mg，每天早上1次，至少連續(xù)服用12個月。服用氯吡格雷前、服用1 w及2 w時分別抽取靜脈血檢測血小板聚集率。

1.3CYP2C19基因型測定

1.3.1全血基因組DNA的提取取100 μl EDTA抗凝血，按全血DNA提取試劑盒的操作方法進行DNA提取，DNA置于-20℃冰箱備用。

1.3.2CYP2C19*2和CYP2C19*3基因片段的擴增采用PCR方法分別擴增CYP2C19*2和CYP2C19*3基因的目的片段，引物的序列分別為CYP2C19*2：正義鏈5′-GCAGGTATAAGTCTAGGAAATG-3′，反義鏈5′-TAAAGTCCCGAGGGTTGTTG-3′， CYP2C19 *3正義鏈：5′-AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3′，反義鏈：5′-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3′由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積25 μl，包括DNA模板2 μl，上下游引物各1 μl (10 nmol/μl)，PCR Mix 12.5 μl，去離子水8.5 μl；反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延長45 s，循環(huán)35次，72℃再延伸5 min，CYP2C19*2和CYP2C19*3目的片段長度分別為381 bp和271 bp。

1.3.3限制性內(nèi)切酶反應(yīng)CYP2C19*2酶切體系：總體積30 μl，其中包含10×QuickCut Green緩沖液3 μl，CYP2C19*2 PCR產(chǎn)物10 μl， QuickCut SamⅠ1 μl，去離子水7.3 μl，30℃保溫30 min。CYP2C19*3酶切體系：總體積30 μl，其中包含10×QuickCut Green緩沖液3 μl，CYP2C19*3 PCR產(chǎn)物10 μl， QuickCut BamHⅠ1 μl，去離子水16 μl，30℃保溫30 min。

1.3.4結(jié)果判定分別取酶切產(chǎn)物10 μl上樣電泳，電泳條件：3.5%瓊脂糖凝膠，電泳電壓90 V，電流70 mA，60 min后于凝膠成像系統(tǒng)中拍照，以DNA分子量標準物為參考判定基因型。CYP2C19*2基因型的判定：產(chǎn)物為381 bp， 經(jīng)限制性內(nèi)切酶SamⅠ酶切后有3種基因型：野生型(G/G) 有271 bp 和110 bp 2條帶，雜合型(G/A) 有381 bp、271 bp和110 bp 3條帶，突變型(A/A)僅有381 bp 1條帶。CYP2C19*3產(chǎn)物為271 bp， 經(jīng)BamHⅠ酶切后有三種基因型：野生型(G/G)有175 bp、96 bp 2條帶，雜合突變型(G/A)有271 bp、175 bp、96 bp 3條帶，而純合突變型僅有271 bp 1條帶。因此，CYP2C19*2和CYP2C19*3型均未突變，則為CYP2C19 *1/*1型；CYP2C19*2雜合突變而CYP2C19*3未突變則為CYP2C19 *1/*2型；CYP2C19*3雜合突變而CYP2C19*2未突變則為CYP2C19 *1/*3型；CYP2C19*2純合突變則為CYP2C19 *2/*2型；CYP2C19*2和CYP2C19*3均是雜合突變則為CYP2C19 *2/*3型；未見CYP2C19*3純合突變(CYP2C19 *3/*3)型。

1.4試劑和儀器基因組提取試劑盒，Omega公司；ExTaq酶， dNTP來自Takara公司；PCR擴增儀，Bio-Rad公司。引物由英俊生物有限公司合成。DNA 測序由我院臨床研究所協(xié)助完成。

1.5基因型分組分組觀察臨床心血管事件：根據(jù)不同的基因型人群間氯吡格雷的藥物代謝動力學(xué)特征把攜帶野生型基因(*1/*1)歸為快代謝型(EM)、突變雜合型(*1/*2、*1/*3)為中間代謝型(IM)、突變純合型(*2/*2、*2/*3、*3/*3)為慢代謝型(PM)。

1.6流式細胞術(shù)測定血小板聚集率所有入選病例均于服藥前采集靜脈血，以測定血小板聚集率并于7 d后再次抽血以測定ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集率。檢測方法：①標本采集：采用1∶9枸櫞酸鈉抗凝真空采血管，抽取靜脈血2 ml，輕輕混勻后2 h內(nèi)進行試驗；②血小板活化：取450 μl 全血加入激活劑50 μl ADP(終濃度為20 μmol/L)輕輕混勻，室溫孵育5 min；③血小板免疫熒光標記：取未加ADP及ADP 活化的全血標本5 μl ， 加入10 μl CD61-PE抗體，輕輕混勻，室溫避光染色15 min后 ，加入0.5 ml 冷的(2℃～8℃) 1%多聚甲醛固定液，充分混勻，置4℃固定30 min 后，2 h內(nèi)進行流式細胞術(shù)分析；④流式細胞術(shù)測定血小板聚集率：在CD61-PE vs SSC 圖上設(shè)門計數(shù)血小板，以未加ADP 標本為血小板零聚集對照，ADP 活化后標本以單個血小板數(shù)量的減少反映血小板聚集率的大小。FACSCalibur，美國Becton-Dickinson公司產(chǎn)品。

1.7隨訪記錄患者治療18個月內(nèi)各種心腦血管事件(包括心源性死亡、再發(fā)心肌梗死、支架內(nèi)血栓形成、靶病變血管的再次重建、腦卒中)和出血事件的發(fā)生情況。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進行t及χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1患者CYP2C19基因型的分布入選患者中檢出快代謝型(EM型)為94例，中間代謝型(IM型)為80例，慢代謝型(PM型)為19例，PM型的比例為9.84%。見表1。

2.2三組患者間的基本資料比較共入選患者193例，其中男124例，女69例，年齡60～75歲，三組患者在性別、年齡、吸煙、高血壓、糖尿病等方面未見明顯差異(P>0.05)。見表2。

表1　患者CYP2C19等位基因及基因型的分布

表2　患者的臨床資料〔n(%)〕

2.3治療前后CHD患者PCI不同治療組血小板聚集率的比較氯吡格雷治療2 w后所有組別的血小板聚集率均有明顯下降(P<0.05)；EM與IM、PM組間血小板聚集程度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IM、PM治療2 w組血小板活性降低程度顯著優(yōu)于治療1 w組。見表3。

表3　各組CHD患者血小板聚集率比較

與治療前相比：1)P<0.05，2)P<0.01；與*1/*1組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與治療后1 w比較：5)P<0.05，6)P<0.01

2.4隨訪結(jié)果所有入選患者中未發(fā)生出血事件發(fā)生，共有8例發(fā)生心血管事件，其中IM型5例(1例再發(fā)心肌梗死，1例支架內(nèi)血栓形成，3例靶病變血管再次重建)，PM型3例(1例再發(fā)心肌梗死，2例靶病變血管再次重建)，在CYP2C19基因突變型患者中占8.08%，與EM患者相比有差異(P<0.05)。

3討論

許多研究表明氯吡格雷對血小板聚集的抑制作用有顯著的個體差異性。部分冠心病支架術(shù)后患者使用氯吡格雷后仍存在有血小板的高反應(yīng)性，發(fā)生不良心血管事件的概率增高。Sofi等〔3〕在一項薈萃分析提出8 043名冠心病使用氯吡格雷患者隨訪6個月到8.3年，CYP2C19(*)2基因多態(tài)性與不良心血管事件和支架內(nèi)血栓形成相關(guān)。氯吡格雷抵抗發(fā)生機制尚未完全清楚，Nguyen等〔4〕將其大致分為外部因素和內(nèi)部因素， 外部因素包括某些患者依從性差，氯吡格雷的生物利用度低， 使用劑量不足， 藥物間相互作用使CYP450 對氯吡格雷的代謝效率降低等，而內(nèi)部因素包括基因的多態(tài)性、血小板激活途徑的變異導(dǎo)致血小板高反應(yīng)性等。氯吡格雷體內(nèi)代謝環(huán)節(jié)酶類基因多態(tài)性導(dǎo)致的功能異常在氯吡格雷抵抗中起主要作用，CYP2C19的基因多態(tài)性是近年研究的熱點之一。

在中國漢族人群中，CYP2C19基 因 突 變 的 類 型主要是CYP2C19*2和CYP2C19*3。與亞洲人群的結(jié)果相符〔5〕。本研究的患者均為南方漢族人，CYP2C19野生型基因患者僅有48.45%，大部分患者攜帶*2或者*3等位基因，此比例高于歐洲的研究，提示我國南方地區(qū)漢族人CYP2C19基因可能有更高的比例發(fā)生突變，這有待日后擴大樣本量進一步研究。

Yamamoto等〔6〕研究提示雙聯(lián)抗血小板治療 (氯吡格雷+阿司匹林)殘余血小板活性弱于單用阿司匹林組，雙聯(lián)組、野生型CYP2C19純合子的血小板活性顯著降低，之后為雜合子*1*2和*1*3，而*2*3、*2*2及*3*3純合子抑制不充分。然而當雙聯(lián)療法再分為兩組，<7 d組及>7 d組，>7 d組血小板活性降低顯著優(yōu)于<7 d組，而且突變型心血管事件發(fā)生率高于野生型純合子。即使是雙聯(lián)療法，不同臨床因素及基因多態(tài)性，可持續(xù)影響血小板的高反應(yīng)性。

本研究治療后血小板活性降低程度野生型>雜合子>突變純合子， >7 d組雜合子血小板活性降低程度顯著優(yōu)于<7 d組，與Yamamoto等〔6〕報道相符， 提示延長抗血小板時間可能進一步改善血小板聚集程度。

本研究隨訪18個月，再發(fā)心肌梗死、支架內(nèi)血栓形成、靶病變血管的再次重建事件均發(fā)生在攜帶*2或者*3等位基因的患者，快代謝基因型患者中無一例發(fā)生心腦血管事件，這與國外研究一致，提示在中國南方漢族人中CYP2C19基因多態(tài)性與主要不良心血管事件相關(guān)，并可能用血小板聚集程度差異來解釋，但由于病例數(shù)及心血管事件數(shù)少，事件發(fā)生時未檢測血小板聚集程度，有待增加樣本量進一步研究。在支架植入術(shù)后合并氯吡格雷低反應(yīng)性臨床表現(xiàn)的患者群(如高齡、反復(fù)支架血栓、超重以及糖尿病等)可能需要檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3基因。

4參考文獻

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4Nguyen TA， Diodati JG， Pharand C. Resistance to clopidogrel：a review of the evidence〔J〕.J Am Coll Cardiol，2005;45(8)：1157-64.

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〔2014-12-31修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：2010年佛山市科技發(fā)展資金項目(201008091)

通訊作者：楊希立(1963-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事冠心病臨床研究。

〔中圖分類號〕R541.4；R446.11

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2664-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.043

1佛山市第一人民醫(yī)院臨床研究所

第一作者：梁茜(1966-)，女，碩士，主任醫(yī)師，主要從事冠心病臨床研究。