郭　鶴　孟慶慧

(菏澤醫(yī)學?？茖W校護理系基礎護理學教研室，山東　菏澤　274000)

殼聚糖磷脂酰膽堿對癡呆大鼠學習能力和海馬區(qū)白細胞介素-1β表達的影響

郭鶴孟慶慧

(菏澤醫(yī)學?？茖W校護理系基礎護理學教研室，山東菏澤274000)

〔摘要〕目的觀察殼聚糖磷脂酰膽堿對治療經(jīng)海馬內(nèi)注射Aβ25～35的健康Wistar大鼠所誘導的阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬內(nèi)白細胞介素(IL)-1β的表達數(shù)量以及該藥物對AD大鼠學習記憶能力的干預療效。方法對健康Wistar大鼠經(jīng)兩側海馬內(nèi)注射Aβ25～35誘導建立AD大鼠炎性癡呆模型，Morris水迷宮以及免疫組織化學方法分別觀察AD模型大鼠經(jīng)藥物治療前后學習記憶能力以及海馬內(nèi)炎性表達因子IL-1β的表達狀況。結果對照組和藥物組大鼠的平均逃避潛伏期(AEL)比AD模型組顯著縮短、2 min內(nèi)跨越原平臺次數(shù)和在靶象限時間比模型組明顯延長(P<0.05)。模型組大鼠海馬區(qū)IL-1β陽性量高于對照組(P<0.01)，藥物組IL-1β陽性表達較模型組顯著下降(P<0.05)。 結論殼聚糖磷脂酰膽堿對改善AD大鼠學習記憶能力和注射Aβ25～35后誘導的炎性反應均有一定的治療作用。

〔關鍵詞〕殼聚糖磷脂酰膽堿；阿爾茨海默??；白細胞介素-1β；炎性反應

阿爾茨海默病(AD)病因較為復雜，特征性的病理學改變是發(fā)生神經(jīng)原纖維纏結(NFT)、大量老年斑(SP)形成以及神經(jīng)元的丟失〔1〕。然而，現(xiàn)今仍缺乏有效的防治藥物以及有效的治療手段。近些年來，有研究表明，大腦內(nèi)部的炎癥反應在AD的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用〔2,3〕。因此，抑制腦內(nèi)炎性因子的產(chǎn)生成為當前防治AD藥物研究的熱點之一。Aβ25～35的凝聚狀態(tài)具有毒性作用，它能引起神經(jīng)元損傷、學習記憶能力損害。本研究采用大鼠左右兩側海馬立體定位定向注射Aβ25～35的方法建立AD大鼠動物模型，研究殼聚糖磷脂酰膽堿對AD大鼠的抗感染治療作用，為臨床應用殼聚糖磷脂膽堿治療AD提供一定的實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物與分組購買山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物部的Wistar大鼠30只，SPF級，6～8月齡，體重(350±30)g，標準條件下飼養(yǎng)〔(20±2)℃，濕度50%～60%〕，隨機分為對照組、模型組和藥物組(n=10)。

1.2主要藥品、試劑及儀器Aβ25～35(美國 Sigma公司)；IL-1β抗體(美國Biowoild公司)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)。DMS-2Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)；江灣Ⅰ型C腦立體定向儀(第二軍醫(yī)大學)；超薄組織切片機和DME型光學顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3方法

1.3.1Aβ25～35孵育無菌條件下，用生理鹽水將Aβ25～35稀釋。37℃條件下連續(xù)孵育7 d，變?yōu)橛卸拘缘哪蹜B(tài)Aβ25～35。

1.3.2模型制備及處理方法參照大鼠腦立體定位圖譜，將模型組和藥物組大鼠用10%水合氯醛3.5 ml/kg麻醉后，固定頭部于腦立體定位儀，按照常規(guī)先備皮消毒切開表層皮膚，暴露大鼠的前囟部位，再用牙科鉆鉆孔后將10 μl注入兩側海馬內(nèi)，每一側各注入藥物Aβ25～355 μl，前囟后(AP)=-3.5 mm,左右旁開(ML)=2.5 mm,進針深度(DV)=3.0 mm。對照組經(jīng)以上同樣操作注射5 μl 0.9%生理鹽水。造模完成后，給予藥物組150 mg·kg-1·d-1的殼聚糖磷脂酰膽堿灌胃，其他兩組給予2 ml 0.9%生理鹽水灌胃，實驗時間為4 w。

1.3.3行為學觀察本實驗目的為檢測大鼠的學習記憶能力情況。實驗分為3個階段，每一次實驗時間為6 d(定位航行試驗為期5 d，空間探索實驗為期1 d)。前者實驗目的是記錄各組大鼠尋找平臺用的時間，稱為大鼠的逃避潛伏期。后者的實驗目的是檢測大鼠在2 min內(nèi)跨原平臺位置的次數(shù)以及在靶象限的停留時間。

1.3.4免疫組織化學法染色根據(jù)大鼠體重用10%水合氯醛3.5 ml/kg通過腹腔注射將其麻醉后固定，心臟取血2 ml后,先用200～300 ml的0.9%生理鹽水灌注，再用300～400 ml的4℃冰4%多聚甲醛進行大鼠心臟灌注，待大鼠四肢變僵硬后，剪斷頭部剖開取腦，置于4%多聚甲醛中固定。固定后采用冠狀面切取海馬部位標本，緩慢流水沖洗過夜，經(jīng)75%～85%～90%～100%梯度酒精脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，浸蠟，包埋，切片(4 μm)，免疫組化PV法染色檢測，一抗IL-1β濃度1∶100。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1水迷宮實驗結果隨著訓練次數(shù)的增加，各組大鼠對平臺位置產(chǎn)生了記憶，各組大鼠的平均逃避潛伏期(AEL)逐漸縮短。造模之前水迷宮實驗結果顯示，第1～2天各組大鼠尋找平臺所用時間逐漸縮短，第3～5天各組趨于穩(wěn)定，各組所用時間相比并沒有顯著差異(P>0.05)，空間探索實驗結果亦無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)。造模7 d后，定位航行實驗結果顯示，AD模型組和藥物組大鼠AEL較造模前比明顯延長，與對照組有顯著差異(P<0.05)?？臻g探索實驗結果顯示模型組和藥物組大鼠在單位時間內(nèi)跨越原平臺次數(shù)以及在靶象限停留時間明顯減少(P<0.05)。藥物治療4 w后，藥物組大鼠AEL時間較模型組明顯減少(P<0.05)，見表1、表2。

2.2免疫組織化學染色結果模型組大鼠海馬區(qū)細胞排列紊亂，細胞數(shù)目和層數(shù)減少，胞核固縮，細胞核染色加深，炎性因子IL-1β大量表達(46.40±4.62)，細胞染色深，棕黃色，胞質(zhì)表達。對照組陽(10.70±2.91)性表達量明顯少于模型組，藥物干預治療后藥物組(28.70±3.56)IL-1β表達量較模型組明顯減少(P<0.05)，見圖1。

表1　各組空間探索實驗成績

表2　各組水迷宮逃避潛伏期成績

圖1　各組海馬CA1區(qū)IL-β表達(DAB，×200)

3討論

Aβ是AD形成和發(fā)展的重要因素〔4,5〕。 也有學者認為，NFT和軸索缺乏營養(yǎng)等病理性變化以及相應臨床癥狀的出現(xiàn)均晚于Aβ的形成，而且較高濃度的Aβ能引起神經(jīng)元變性和死亡，發(fā)生炎性反應。近年研究表明，腦內(nèi)的炎性反應貫穿于AD慢性病程的整個過程，膠質(zhì)細胞激活活化是腦內(nèi)炎癥反應較為顯著的特征，它具有誘導一系列炎性細胞活化，增殖的功能〔6,7〕。White等〔8〕實驗研究表明，膠質(zhì)細胞活化后釋放的IL-1β引發(fā)炎癥反應是 AD 早期發(fā)展變化和進展的關鍵病理炎性因子。在Aβ刺激下，小膠質(zhì)細胞被激活產(chǎn)生的IL-1β能上調(diào)小膠質(zhì)細胞表達釋放其他細胞因子，還可誘導產(chǎn)生前列腺素、NO、APP等的生成增加，進一步造成Aβ堆積。Goshen等〔9〕研究證實海馬區(qū)內(nèi)出現(xiàn)大量IL-1β，是出現(xiàn)炎癥反應的重要標志。IL-1β是細胞內(nèi)發(fā)揮重要作用的免疫調(diào)節(jié)因子，在異常沉積的老年斑周圍積聚了大量的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，激活的膠質(zhì)細胞能夠釋一氧化氮(NO)，TNFα,IL-1β等炎癥因子〔10～12〕。在AD患者大腦中IL-1β主要由激活的小膠質(zhì)細胞釋放產(chǎn)生〔13,14〕,炎性分子作用于小膠質(zhì)細胞又可促進其他炎性分子的產(chǎn)生，所以這種現(xiàn)象稱為交互作用。因為交互作用持續(xù)存在因此促進了AD腦內(nèi)慢性炎癥反應的形成和炎性因子產(chǎn)物水平會持續(xù)升高，高水平的炎性因子產(chǎn)物對AD腦損傷與淀粉蛋白變性產(chǎn)生廣泛的影響。有實驗研究證明AD老年斑中發(fā)現(xiàn)存在的大量IL-1β蛋白及其mRNA等。閆恩志等〔15，16〕研究報道，IL-1β表達增加后可通過激活的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞使iNOS 和環(huán)氧化酶的表達增加。所以，IL-1β是炎性反應中的一個重要因子。本實驗之前的研究結果提示殼聚糖磷脂酰膽堿可能具有抑制或延遲IKKβ/NF-κB通路激活，降低炎癥因子激活增生，起到保護神經(jīng)膠質(zhì)細胞作用〔17〕。本次實驗研究的結果顯示殼聚糖磷脂酰膽堿藥物組海馬內(nèi)炎性因子IL-1β表達降低，同時Morris水迷宮測試成績有明顯改善，提示殼聚糖磷脂酰膽堿藥物組對AD大鼠空間學習記憶能力有改善作用。

綜上，在體條件下Aβ25～35誘導AD大鼠腦組織小膠質(zhì)細胞增生、活化后，IL-1β大量表達，實驗結果表明，殼聚糖磷脂膽堿能夠減少炎性因子IL-1β的表達，可改善AD大鼠學習記憶能力，這說明殼聚糖磷脂膽堿能夠抑制AD大鼠的腦部炎性反應，可能是防治AD的有效途徑之一，但由于本實驗屬于小樣本研究，具體的臨床應用還需要進行更進一步的探討。

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〔2014-12-11修回〕

(編輯曹夢園)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2348-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.015

第一作者：郭鶴(1985-)，女，助教，碩士,主要從事老年性癡呆研究。