黃毅昌，雷 燕，楊玉滔，閆秀英*，簡(jiǎn)紀(jì)常，吳灶和

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088；2.廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東廣州 510515)

草魚(yú)出血病分子流行病學(xué)及GCRV多樣性研究

黃毅昌1，雷 燕2，楊玉滔1，閆秀英1*，簡(jiǎn)紀(jì)常1，吳灶和1

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088；2.廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司，廣東廣州 510515)

摘要[目的]分析不同基因型GCRV分離株與患草魚(yú)出血病草魚(yú)癥狀的相關(guān)性。[方法]采用RT-PCR檢測(cè)患病草魚(yú)，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析基因型內(nèi)和基因型間不同分離株間的差異。[結(jié)果]對(duì)近3年來(lái)草魚(yú)出血病分子流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，患草魚(yú)出血病病魚(yú)多為“腸炎型”癥狀，且檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其病原多屬于GCRV基因型Ⅲ型。對(duì)GCRV的多樣性分析表明，不同分離株同源蛋白的同源率高達(dá)93%以上，卻被給予完全不同的名稱(chēng)，給GCRV多樣性研究帶來(lái)一定的困難；同一基因型不同分離株同源蛋白間的變異位點(diǎn)較少，且功能位點(diǎn)發(fā)生變異的更少；不同基因型不同分離株同源蛋白間的保守位點(diǎn)較少，且這些保守位點(diǎn)中只有極少數(shù)位點(diǎn)為功能位點(diǎn)；不同基因型分離株同源結(jié)構(gòu)蛋白間存在較大的差異，且同源非結(jié)構(gòu)蛋白間的差異更為顯著。[結(jié)論]草魚(yú)出血病不同臨床癥狀可能與其病原基因型不同有關(guān)。

關(guān)鍵詞草魚(yú)呼腸孤病毒；草魚(yú)出血??；分子流行病學(xué)；多樣性

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidellus)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一，但草魚(yú)出血病給草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。根據(jù)患病草魚(yú)出血部位的不同，草魚(yú)出血病的癥狀可分為3大類(lèi)型：“紅肌肉型”、“紅鰭紅鰓蓋型”和“腸炎型”[2]。迄今為止，對(duì)草魚(yú)出血病及其病原草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus)的研究已取得很多突破性進(jìn)展[3-6]。草魚(yú)呼腸孤病毒是分節(jié)的dsRNA病毒，具有11個(gè)基因節(jié)段，且有些分離株間存在較大的差異[4]。不同的選擇壓影響著病毒的演化[7]，目前已分離到多株GCRV分離株，發(fā)現(xiàn)已有的GCRV分為4種基因型，在我國(guó)分布有3種基因型[8-10]。

控制草魚(yú)出血病的發(fā)生、減少草魚(yú)出血病發(fā)生率、降低患草魚(yú)出血病草魚(yú)死亡率以及提高草魚(yú)出血病疫苗的免疫效果是目前從事水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者關(guān)心的主要問(wèn)題。對(duì)草魚(yú)出血病及其病原的研究可為降低草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的損失奠定基礎(chǔ)，但因?yàn)椴蒴~(yú)出血病引起的草魚(yú)死亡率仍然較高，病原多樣性是影響因素之一[5，11]。根據(jù)已有的研究和提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的基因序列及近年來(lái)草魚(yú)出血病的癥狀分析表明，近幾年發(fā)現(xiàn)的分離株多為以GCRV HZ08為代表的基因型Ⅲ型分離株，且草魚(yú)出血病的癥狀多為“腸炎型”。因此，推測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒的多樣性可能與其引起的疾病癥狀相關(guān)，深入研究草魚(yú)呼腸孤病毒的多樣性對(duì)草魚(yú)出血病的流行及防控治療有著重要意義。廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司于2012～2015年對(duì)草魚(yú)出血病分子流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查，筆者通過(guò)對(duì)GCRV基因組和蛋白多樣性及蛋白特性進(jìn)行分析，探討GCRV多樣性與草魚(yú)出血病臨床癥狀及GCRV致病機(jī)理的相關(guān)性，旨在為深入研究GCRV的致病機(jī)理、蛋白功能及草魚(yú)出血病的防控等奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1草魚(yú)出血病分子流行病學(xué)調(diào)查2012年4月至2015年6月，在我國(guó)各地草魚(yú)養(yǎng)殖區(qū)采集患出血病的草魚(yú)，檢查并記錄出血病的臨床癥狀，同時(shí)應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)其病原GCRV進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)獲得的目的片段進(jìn)行測(cè)序。RT-PCR檢測(cè)的GCRV目的基因?yàn)関p2基因，目的片段長(zhǎng)度為413 bp，PCR所用引物為UP1(5′-GTTCCTGTCGTGGCTGGTATC-3′)和DW1(5′-GGTAGCTTAGAGTTCCTATCA-3′)、UP2(5′-GTCCCACTCACTGCCGGTATG-3′)和DW2(5′-GGGATTTTCGTGAAGGTTGTCT-3′)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)如下：ddH2O 16.5 μL、cDNA(約25 ng)2 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL、10×ExTaqBuffer 2.5 μL、ExTaq酶(1 U/μL)0.125 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。將電泳產(chǎn)物純化回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α菌株，篩選陽(yáng)性克隆并送至上海生工生物有限公司測(cè)序鑒定。

所獲得的檢測(cè)毒株序列與已知的GCRV序列進(jìn)行比對(duì)，然后使用MEGA軟件構(gòu)建最大簡(jiǎn)約樹(shù)(MP)、最大似然樹(shù)(ML)和鄰接樹(shù)(NJ)，Bootstrip值設(shè)為1 000。

1.2GCRV基因組多樣性分析從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已知的GCRV分離株基因組序列，應(yīng)用DNAStar軟件分析各分離株的同源性，進(jìn)而分析GCRV基因組多樣性。

1.3GCRV Ⅲ型基因型分離株蛋白的變異特性目前已知GCRV Ⅲ型基因型分離株基因組和基因序列最多，在已知的GCRV基因組中有9株GCRV分離株屬于Ⅲ型基因型，1株分離株(GCRV-873)屬于Ⅰ型基因型，1株分離株(GCRV 104)屬于Ⅳ型基因型。為探討GCRV的多樣性與GCRV的進(jìn)化，多樣性包括基因型間的多樣性和基因型內(nèi)的多樣性，同時(shí)為了深入探討GCRV基因型和GCRV蛋白作用位點(diǎn)與疾病癥狀的關(guān)聯(lián)，對(duì)已知的GCRV Ⅲ型基因型分離株(GCRV 106、GCRV JX02、GCRV 918、GCRV 794、GCRV 109、GCRV Henan988、GCRV HZ08和GCRV GD108)蛋白變異特性進(jìn)行分析。使用DNAStar排列相關(guān)氨基酸序列，并統(tǒng)計(jì)相應(yīng)同源蛋白的變異位點(diǎn)。

1.4GCRV HZ08蛋白相互作用基序分析使用iLIR軟件(http：//repeat.biol.ucy.ac.cy/iLIR/)對(duì)HZ08分離株的蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行相互作用基序分析。

1.5GCRV HZ08蛋白糖基化位點(diǎn)、金屬及二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)分析使用NetOGlyc軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)分別對(duì)HZ08的各個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行O-連接糖鏈的連接位點(diǎn)預(yù)測(cè)，得到上述蛋白質(zhì)潛在的糖基化位點(diǎn)。使用METALDETECTER軟件對(duì)上述蛋白質(zhì)進(jìn)行金屬結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，得出其金屬結(jié)合位點(diǎn)與二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)。

1.6GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白相互作用位點(diǎn)分析利用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)Protein Data Base獲取GCRV-873的VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，并結(jié)合基于序列特征的不同殘基溶劑可及性的SPPIDER方法，使用SPPIDER在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//sppider.cchmc.org/)對(duì)上述蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白互作位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.7不同基因型代表株VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的保守位點(diǎn)分析以GCRV 873、GCRV HZ08和GCRV 104分別為基因型Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型的代表株，使用DNAStar排列相關(guān)的氨基酸序列，分析此3株分離株蛋白的保守位點(diǎn)。

1.8GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank)查詢(xún)到的GCRV 873分離株的VP1、VP3、VP5和VP6蛋白的PDB文件[12]，預(yù)測(cè)其3D結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果與分析

2.1草魚(yú)出血病分子流行病學(xué)調(diào)查情況廣州利洋水產(chǎn)科技股份有限公司水產(chǎn)動(dòng)物疾病研究所于2012年4月至2015年6月從我國(guó)各地草魚(yú)養(yǎng)殖區(qū)采集疑似患出血病的草魚(yú)440例，檢測(cè)結(jié)果表明其中288例草魚(yú)出血病病毒呈陽(yáng)性，此288例分布于山東、河南、湖北、湖南、天津、河北、廣東、福建、山西等省份。檢測(cè)出草魚(yú)出血病病毒陽(yáng)性的草魚(yú)都具有腸道發(fā)紅的癥狀，偶爾具有紅肌肉的癥狀，未見(jiàn)到紅鰭紅鰓蓋的癥狀。利用PCR方法檢測(cè)到目的片段并進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果表明患出血病草魚(yú)均檢測(cè)出GCRV。同時(shí)，對(duì)檢測(cè)到的毒株進(jìn)行親緣關(guān)系分析，使用MEGA所構(gòu)建多種系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致。從圖1可以看出，所檢測(cè)的毒株(GCRV-Tianjin、GCRV-Guangdong、GCRV-Hubei、GCRV-Qingyu)與GCRV HZ08親緣關(guān)系最近。

注：括號(hào)內(nèi)為已知GCRV分離株vp2基因的GenBank編碼。數(shù)字為置信度。Note：GenBank codes of the vp2 genes in GCRV isolates are in brackets.Numbers are the confidence.圖1　部分檢測(cè)GCRV分離株的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.1　Analysis on the phylogency of some detected GCRV isolates

2.2GCRV基因組多樣性分析從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了GCRV 873、AGCRV、GCRV 106、GCRV Henan988、GCRV Hunan794、GCRV JX02、GCRV HZ08、GCRV 918、GCRV GD108、GCRV 109和GCRV 104基因組序列(表1)，基因組序列GenBank編碼分別為KC201166～KC201187、AF403390～AF40 3397、GQ896334～GQ896337、GU350742～GU350748、HQ231198～HQ231208、KC238676～KC238686、KC847320～KC847330、KF712475～KF712485、KM880065～KM 880073、NC_010584～NC_010594、JQ042805～JQ042808、AF260511～AF2605113、HQ018818和JN967629～JN967639。Ⅰ型基因型代表株GCRV 873、Ⅲ型基因型代表株GCRV HZ08和Ⅳ型基因型代表株GCRV 104相應(yīng)蛋白相似性分析見(jiàn)表2。

2.3GCRV Ⅲ型基因型分離株蛋白的變異特性分析GCRV 106、GCRV JX02、GCRV 918、GCRV 794、GCRV 109、GCRV Henan988、GCRV HZ08和GCRV GD108編碼的蛋白變異特性。從圖2可以看出，GCRV基因組片段1編碼的VP1間的同源率為99.1%～99.8%，變異位點(diǎn)有39個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段2編碼的VP2間的同源率為98.0%～99.8%，變異位點(diǎn)有60個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段3編碼的VP3間的同源率為97.2%～99.0%，變異位點(diǎn)55個(gè)個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段4編碼的NS1或NS79間的同源率為97.9%～99.7%，變異位點(diǎn)有21個(gè)個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段5編碼的VP5間的同源率為97.8%～99.4%，變異位點(diǎn)有31個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段6編碼的VP4間的同源率為98.2%～100%，變異位點(diǎn)有22個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段7編碼的NS4或VP56的同源率為93.4%～99.8%，變異位點(diǎn)有44個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段8編碼的VP6間的同源率為97.1%～100%，變異位點(diǎn)有28個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段9編碼的NS2間的同源率為97.5%～99.4%，變異位點(diǎn)有25個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段10編碼的VP38或NS38間的同源率為99.1%～100%，變異位點(diǎn)有5個(gè)氨基酸位點(diǎn)；片段11編碼的VP35或VP11間的同源率為97.4%～100%，變異位點(diǎn)有11個(gè)氨基酸位點(diǎn)。

注：*表示此行數(shù)據(jù)為該片段長(zhǎng)度(bp)/基因長(zhǎng)度(bp)/編碼蛋白及其長(zhǎng)度(aa)。

Note：* stands for that data in the line is the segment length(bp)/the gene length(bp)/the encoded proteins and their length(aa).

表2Ⅰ型基因型GCRV 873、Ⅲ型基因型GCRV HZ08和Ⅳ型基因型GCRV 104相應(yīng)蛋白的相似性分析

Table 2Similarity analysis of homologous proteins in GCRV 873 attibuted to genotype Ⅰ，in GCRV HZ08 attibuted to genotype Ⅲ and in GCRV 104 attibuted to genotype Ⅳ

GCRV873與GCRVHZ08GCRV873GCRVHZ08同源率Homologousrate∥%GCRV873與GCRV104GCRV873GCRV104同源率Homologousrate∥%GCRVHZ08與GCRV104GCRVHZ08GCRV104同源率Homologousrate∥%VP1VP128.3VP1VP128.7VP1VP126.7VP2VP245.4VP2VP242.1VP2VP243.0VP3VP335.3VP3VP334.8VP3VP335.3NS1NS7915.2NS1VP6616.7NS79VP6615.6VP5VP523.1VP5VP520.6VP5VP518.0VP4VP430.6VP4VP425.7VP4VP423.7VP6VP619.4VP6VP619.2VP6VP616.5NS2NS3813.3NS2VP1515.0NS38VP1512.9VP7VP4112.7VP7VP3912.0VP41VP3911.9NS4/NS5VP5615.0NS4/NS5VP5512.8VP56VP5512.9NS3VP3512.3NS3VP3811.1VP35VP3811.3

圖2　GCRV蛋白特性分析Fig.2　Analysis on the characterizations of GCRV proteins

2.4GCRV HZ08蛋白互作基序分析以GCRV HZ08為代表，分析其蛋白互作基序。從圖2可以看出，VP1、VP2、VP3、NS79、VP5、VP4、VP56、VP41、VP6、NS38和VP35分別有168、156、120、66、90、60、42、36、78、24和30個(gè)氨基酸位點(diǎn)位于蛋白互作基序。

2.5GCRV HZ08蛋白糖基化位點(diǎn)、金屬及二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)分析通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、NS79、VP35、NS38、VP41和VP56潛在的糖基化位點(diǎn)為分別有15、21、37、11、6、7、36、6、6、14、4個(gè)氨基酸位點(diǎn)(圖2)。VP1、VP2、VP3、VP4、VP5、VP6、VP35、NS38、VP56、NS79和VP41分別含有39、49、40、10、30、16、21、16、13、37和23個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)(圖1)，其中VP1、VP2、VP3、VP6、VP35和NS38還分別含有2個(gè)二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。

2.6GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6相互作用位點(diǎn)分析因?yàn)樵赑DB數(shù)據(jù)庫(kù)中只登錄有GCRV 873 VP1、VP3、VP5和VP6的PDB文件，因此只對(duì)此4個(gè)蛋白進(jìn)行了蛋白互作位點(diǎn)分析。VP1、VP3、VP5和VP6的蛋白互作位點(diǎn)分別有243、273、136和114個(gè)氨基酸位點(diǎn)(圖2)。

2.7不同基因型代表株VP1、VP3、VP5和VP6蛋白的保守位點(diǎn)分析基因型Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型基因型代表株GCRV 873、GCRV HZ08和GCRV 104分離株蛋白的保守位點(diǎn)如下：VP1、VP3、VP5和VP6間的保守位點(diǎn)分別有227、269、77和18個(gè)氨基酸位點(diǎn)(圖2)。

2.8GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用DeepView預(yù)測(cè)GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的3D結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3　GCRV 873 VP1、VP3、VP5、VP6蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3　Tertiary structures of the proteins VP1，VP3，VP5 and VP6 in GCRV 873

3討論與結(jié)論

對(duì)草魚(yú)出血病分子流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查及對(duì)GCRV多樣性進(jìn)行分析，有助于草魚(yú)出血病的防治及GCRV致病機(jī)理的闡釋。該試驗(yàn)結(jié)果表明在不同基因型分離株間片段1、2、3、5、6、9編碼的結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、VP5和VP6比較保守，但有些編碼蛋白的基因所在片段不同。GCRV 873和AGCRV片段8編碼VP6蛋白，而GCRV 106、GCRV Henan988、GCRV Hunan794、GCRV JX02、GCRV HZ08、GCRV 918、GCRV GD108、GCRV 109片段9編碼VP6蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白相比變異較大，但同一基因型分離株間蛋白的同源性很高[13]。此外，即使上述蛋白同源性高達(dá)93%以上，不同分離株同源蛋白卻給予不同的名稱(chēng)，如NS1與NS79、VP7與VP41、NS2與NS38、VP38、NS3與VP35等，這給GCRV多樣性分析帶來(lái)了一定的困難，由此建議同源性高的蛋白采用相同的名稱(chēng)給予命名。

在基因型Ⅲ型分離株間，蛋白間的變異位點(diǎn)分析表明，VP1蛋白39個(gè)變異位點(diǎn)中有9個(gè)氨基酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)為蛋白互作位點(diǎn)，即73、130、378、379、445、654、905、1 088和1 120 aa。VP1的糖基化位點(diǎn)未發(fā)生變異，在金屬結(jié)合位點(diǎn)中只有378 aa發(fā)生變異。在預(yù)測(cè)的VP1蛋白互作基序中，25、290、1 153、1 165和1 212 aa發(fā)生變異。VP2的50個(gè)變異位點(diǎn)中，2、279、315、564、765、946、1 062和1 250 aa位于VP2的互作基序，177和1 028 aa為糖基化位點(diǎn)，563 aa為金屬結(jié)合位點(diǎn)。VP3的55個(gè)變異位點(diǎn)中，142、147、291、295和299 aa位于互作基序，57和103 aa為潛在的糖基化位點(diǎn)，4和884 aa為金屬結(jié)合位點(diǎn)，還有17個(gè)位點(diǎn)為互作位點(diǎn)。NS1/NS79的21個(gè)變異位點(diǎn)中，401 aa位于互作基序，418 aa為潛在的糖基化位點(diǎn)。NS38/VP38的糖基化位點(diǎn)、金屬結(jié)合位點(diǎn)、互作基序和蛋白互作位點(diǎn)未發(fā)生變異。VP4的22個(gè)變異位點(diǎn)中，70和418 aa位于互作基序，349 aa為金屬結(jié)合位點(diǎn)。NS4/VP35的44個(gè)變異位點(diǎn)中，152、275、287、290和291 aa位于互作基序。VP5的31個(gè)變異位點(diǎn)中，554、699和715 aa位于互作基序，608 aa為糖基化位點(diǎn)，512 aa為金屬結(jié)合位點(diǎn)，且41、238、421、554和618 aa為蛋白互作位點(diǎn)。VP6的28個(gè)變異位點(diǎn)中，111和302 aa位于互作基序，101和318 aa為潛在的糖基化位點(diǎn)，48、75、116和178 aa為金屬結(jié)合位點(diǎn)，116 aa為二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)。VP7/VP41的20個(gè)變異位點(diǎn)中，9、336和337 aa位于互作基序，69 aa為糖基化位點(diǎn)，155和

199 aa為金屬結(jié)合位點(diǎn)。VP35/VP11/NS3/NS26的11個(gè)變異位點(diǎn)中，195 aa位于互作基序，167 aa為金屬結(jié)合位點(diǎn)。由此可見(jiàn)，同一基因型分離株蛋白間的變異位點(diǎn)較少，且功能位點(diǎn)發(fā)生變異的更少。

Ⅰ型基因型GCRV 873、Ⅲ型基因型GCRV HZ08和Ⅳ型基因型GCRV 104比較保守的相應(yīng)蛋白保守位點(diǎn)分析表明(以GCRV 873蛋白序列為模式序列進(jìn)行相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)分析)，VP1的227個(gè)保守位點(diǎn)中70、531、574、581和831氨基酸位點(diǎn)為潛在的糖基化位點(diǎn)，197、229、238和525氨基酸位點(diǎn)為金屬結(jié)合位點(diǎn)，還有29個(gè)氨基酸位點(diǎn)同為預(yù)測(cè)的蛋白互作位點(diǎn)。VP3的269個(gè)保守位點(diǎn)中有29個(gè)氨基酸位點(diǎn)位于蛋白互作基序，609氨基酸位點(diǎn)為糖基化位點(diǎn)，119、122、135、140、410、617、836和874氨基酸位點(diǎn)為金屬結(jié)合位點(diǎn)，119和122氨基酸位點(diǎn)同為二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)，此外還有31個(gè)位點(diǎn)為蛋白互作位點(diǎn)。VP577個(gè)保守位點(diǎn)中有8個(gè)氨基酸位點(diǎn)位于互作基序，522氨基酸位點(diǎn)為金屬結(jié)合位點(diǎn)，還有13個(gè)位點(diǎn)為蛋白互作位點(diǎn)。VP6的18個(gè)保守位點(diǎn)中，280氨基酸位點(diǎn)位于互作基序，111、165、169和179氨基酸位點(diǎn)為蛋白互作位點(diǎn)。由此可見(jiàn)，不同基因型分離株蛋白間的保守位點(diǎn)較少，且其中少數(shù)保守位點(diǎn)為功能位點(diǎn)，多數(shù)功能位點(diǎn)發(fā)生了變異。

結(jié)構(gòu)蛋白是病毒顆粒的組成部分，非結(jié)構(gòu)蛋白雖然不是病毒顆粒的組成部分，但在病毒感染和復(fù)制等過(guò)程中對(duì)病毒增殖起著極其重要的作用。目前的研究已表明病毒非結(jié)構(gòu)蛋白參與調(diào)控病毒增殖、復(fù)制、感染致病等生命過(guò)程[14-15]。例如，禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)的非結(jié)構(gòu)蛋白δNS在A(yíng)RV復(fù)制的起始階段起著重要作用，非結(jié)構(gòu)蛋白μN(yùn)S在病毒裝配中起著關(guān)鍵作用，且δNS還可提高或補(bǔ)充μN(yùn)S的活性[13，16]。

不僅草魚(yú)呼腸孤病毒不同基因型分離株結(jié)構(gòu)蛋白間存在著比較大的差異，而且非結(jié)構(gòu)蛋白間的變異更加顯著，據(jù)此推測(cè)草魚(yú)出血病不同癥狀可能與其病原分屬不同基因型有關(guān)。GCRV病毒蛋白及宿主蛋白參與病毒復(fù)制的作用機(jī)制及GCRV致病機(jī)制仍未闡釋清楚，草魚(yú)出血病的癥狀到底與GCRV的基因型間的關(guān)系仍有待深入調(diào)查和研究。

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Molecular Epidemiology of Hemorrhage Disease of Grass Carp and the Diversity Research of GCRV

HUANG Yi-chang1, LEI Yan2, YANG Yu-tao1, YAN Xiu-ying1*et al

(1. Guangdong Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals, and Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institues, Fisheries College of Guangdong Ocean University, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088; 2. Guangzhou Liyang Aqua-Technology Co. Ltd, Guangzhou, Guangdong 510515)

Abstract[Objective] The aim was to analyze the correlation between different genotypes GCRV isolates and symptoms of grass carp with hemorrhage disease. [Method] Using RT-PCR detection, the bioinformatics method was adopted to analyze differences of isolates within and between various genotypes. [Result] The molecular epidemiology of hemorrhage disease of grass carp in recent three years was analyzed. It was found that the symptom of grass carp with hemorrhage disease was “the enteritis type”, with the GCRV mostly attributed to genotype Ⅲ. It was indicated that the homologous rates of homologous proteins in diferrent isolates were more than 93%, but those proteins were named with the completely different names. It (highly homologous proteins with different names) brought some difficulties to the research of GCRV diversity. Variable sites were few among homologous proteins in different isolates attributed to the same genotype, and variable function sites were fewer in these variable sites. Conserved sites among homologous proteins in different isolates attributed to different genotypes were few, and the fewer sites among them were functional sites. There were great differences among homologously structural proteins in different isolates attributed to different genotype, and the variation of homologous non-structural proteins was more significant. [Conclusion] It is suggested that different clinical symptoms of hemorrhage disease of grass carp could be related to different pathogen genotypes.

Key wordsGrass carp reovirus (GCRV); Hemorrhage disease of grass carp; Molecular epidemiology; Diversity

基金項(xiàng)目國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2009CB118704)。

作者簡(jiǎn)介黃毅昌(1993- )，男，廣東佛山人，本科生，專(zhuān)業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)。* 通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事水產(chǎn)動(dòng)物病害防控。

收稿日期2016-03-12

中圖分類(lèi)號(hào)S 941

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)11-120-06