張金衛(wèi)　盧　月　鐘曉琴　何鈺華　韓　凌

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣州510006)

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羧甲基茯苓多糖對腫瘤壞死因子-α調(diào)控體外Caco-2細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響①

張金衛(wèi)盧月鐘曉琴何鈺華②韓凌

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣州510006)

[摘要]目的：體外實(shí)驗(yàn)研究羧甲基茯苓多糖(Carboxytmethylpachymaran, CMP)對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)調(diào)控體外Caco-2細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響，并初步探討其機(jī)理。方法：TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞建立損傷模型，100 μg/ml CMP干預(yù)上述模型，分別從細(xì)胞單層跨膜電阻(TER)、酚紅透過率、緊密連接蛋白Claudin-1表達(dá)量以及分布方面評價(jià)造模情況和CMP干預(yù)情況。結(jié)果：TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞TER明顯下降(P<0.01)，酚紅透過率明顯升高(P<0.01)，Claudin-1蛋白表達(dá)降低、Claudin-1蛋白分布毛糙、鋸齒樣改變、熒光強(qiáng)度變?nèi)?，提示造模成功?CMP干預(yù)后，TER明顯升高(P<0.01)，酚紅透過率明顯降低(P<0.01)，Claudin-1蛋白的表達(dá)量升高，Caudin蛋白的分布變得光滑、熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。結(jié)論：CMP能夠有效的逆轉(zhuǎn)TNF-α調(diào)控的體外Caco-2細(xì)胞系生物學(xué)特性，可能與恢復(fù)Claudin-1蛋白表達(dá)和分布有關(guān)， CMP可能是治療炎癥性腸病的潛在有效藥物。

[關(guān)鍵詞]羧甲基茯苓多糖；腸道黏膜屏障；炎癥性腸病；緊密連接

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是由腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)紊亂、腸道黏膜屏障異常、腸道持續(xù)感染、環(huán)境與遺傳等因素共同參與的病因、病機(jī)未完全闡明的非特異性反復(fù)發(fā)作性慢性腸道炎癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn′s disease,CD)[1-5]。目前，仍沒有徹底治愈IBD的有效方法，尋找治療IBD的特效藥物一直是醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)。茯苓，是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，具有健脾除濕的功效，是“四君八珍”之一，臨床常用治療胃腸疾病，但其作用機(jī)理仍缺乏深入研究。茯苓的主要成分為茯苓多糖，包括β-茯苓聚糖、葡萄糖、蔗糖和果糖等。β-茯苓聚糖占茯苓菌核干重的93%，其在堿性條件下與氯乙酸反應(yīng)生成水溶性的羧甲基茯苓多糖(Carboxytmethy-lpachymaran, CMP)(圖 1)。大量臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明，茯苓和茯苓多糖對胃腸疾病具有良好的治療、預(yù)防作用，但是，對水溶性良好的 CMP研究較少，基于此，本研究以腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha TNF-α)誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞建立損傷模型，觀察CMP對TNF-α調(diào)控的體外Caco-2細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響，并探討其分子機(jī)制以及用于治療炎癥性腸病的潛在能力。

圖1　羧甲基茯苓多糖結(jié)構(gòu)(CMP)Fig.1　Structure of CMP

1材料與方法

1.1細(xì)胞株和主要試劑人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株Caco-2購自武漢大學(xué)細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，非必須氨基酸，雙抗等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自GIBCO公司；TNF-α購自Pepro Tech公司；CMP購自恒綠源科技有限公司；酚紅購自源葉公司；MILLIcell ERS-2購自millipore公司；Claudin-1抗體、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG等購自Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株Caco-2用含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合70%～80%時(shí)，用0.25%EDTA將其消化，用于傳代或種板。

1.2.2細(xì)胞分組將細(xì)胞隨機(jī)分為3組，即正常組(C)、模型組(M)和給藥組(D)。當(dāng)細(xì)胞適合造模和給藥時(shí)，C組用常規(guī)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，M組和D組用含有100 ng/ml TNF-α的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后C組和M組更換常規(guī)培養(yǎng)基，D組更換為含有100 μg/ml CMP的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。

1.2.3單層跨膜電阻實(shí)驗(yàn)(TER)Caco-2細(xì)胞接種在Transwell板中，隔天更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞生長到10天電阻值穩(wěn)定時(shí)，按照細(xì)胞分組的方法分組和給藥，并用細(xì)胞電阻儀檢測電阻值。

1.2.4酚紅透過率實(shí)驗(yàn)檢測Transwell板中細(xì)胞電阻后，移除培養(yǎng)液，用PBS(1×)清洗兩次，向外孔加入600 μl純水，內(nèi)孔加入100 μl 20 mg/L的酚紅，放置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取外孔溶液150 μl與50 μl 600 μmol/L NaOH溶液混合，用酶標(biāo)儀檢測波長570 nm的OD值。

1.2.5免疫印跡實(shí)驗(yàn)Caco-2細(xì)胞接種在6孔板中，隔天更換新鮮培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞長成單層屏障時(shí)，按照細(xì)胞分組的方法分組和給藥，并移除培養(yǎng)基，用PBS(1×)清洗3次，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心10 min取上清，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，Claudin-1抗體(1∶2 500)孵育4℃過夜，TBST(1×)洗滌，10 min/次，3次，羊抗兔IgG二抗孵育1 h，TBST(1×)洗滌，10 min/次，3次，化學(xué)顯影，檢測蛋白表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)參照計(jì)算相對灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6免疫熒光實(shí)驗(yàn)Caco-2細(xì)胞接種在24孔板中，隔天更換新鮮培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞長成單層屏障時(shí)，按照細(xì)胞分組的方法分組和給藥，并移除培養(yǎng)基，用PBS(1×)清洗3次，4%多聚甲醛溶液固定30 min，移除多聚甲醛，PBS(1×)清洗3次，加入Claudin-1抗體，室溫孵育60 min，移除Claudin-1抗體，PBS(1×)清洗，10 min×3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫避光孵育60 min,PBS(1×)清洗，10 min×3次，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2結(jié)果

2.1CMP升高TNF-α損傷的Caco-2細(xì)胞跨膜電阻值(TER)100 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞24 h，TER值明顯下降，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)圖2，表明TNF-α損傷了Caco-2細(xì)胞，成功建立了損傷模型；加入100 μg/ml CMP后，逆轉(zhuǎn)了TNF-α的損傷作用，給藥組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖2)，表明CMP有效逆轉(zhuǎn)了TNF-α對Caco-2細(xì)胞的損傷作用。

2.2CMP逆轉(zhuǎn)TNF-α損傷的Caco-2細(xì)胞酚紅透過率(transmittance)TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞的酚紅透過性明顯升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)，表明TNF-α使細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙增大； CMP修復(fù)了TNF-α損傷的細(xì)胞間隙，給藥組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。這與單層細(xì)胞跨膜電阻實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，都表明TNF-α損傷了Caco-2細(xì)胞， CMP對其損傷具有明顯的修復(fù)作用。

圖2　CMP升高TNF-α損傷的Caco-2細(xì)胞跨膜電阻值Fig.2　CMP increaces TER of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.01,D vs.M

圖3　CMP逆轉(zhuǎn)TNF-α損傷的Caco-2細(xì)胞酚紅透過率Fig.3　Repair effect of CMP to phenol red transmittance of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.01,D vs.M.

2.3CMP修復(fù)TNF-α損傷的Caco-2細(xì)胞Claudin-1蛋白表達(dá)100 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞24 h，Claudin-1蛋白表達(dá)明顯下降，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4A)，表明TNF-α破壞了緊密連接，成功建立了Caco-2細(xì)胞緊密連接損傷模型；加入100 μg/ml CMP后，逆轉(zhuǎn)了TNF-α的損傷作用，給藥組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4B)，表明 CMP有效修復(fù)了TNF-α對Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin-1的損傷。

2.4CMP修復(fù)TNF-α損傷的Caco-2細(xì)胞Claudin-1蛋白表達(dá)正常對照組 Claudin-1 蛋白沿著細(xì)胞膜呈蜂巢樣線性分布，熒光強(qiáng)度很強(qiáng)(圖5C)。

圖4　Claudin-1蛋白表達(dá)Fig.4　Expression of Claudin-1 proteinNote: A.Claudin-1 protein expression in different groups;B.Relative expression ratio of claudin-1 protein with GAPDH.C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.*.P<0.01,M vs.C;#.P<0.05,D vs.M.

圖5　CMP修復(fù)TNF-α損傷的Caco-2細(xì)胞claudin-1蛋白分布Fig.5　Repair effect of CMP to clauidn-1 protein′s distribution of Caco-2 cell induced by TNF-αNote: C.Normal group;M.Induced with 100 ng/ml TNF-α;D.Treat with 100 μg/ml CMP for 24 hours.

TNF-α誘導(dǎo)的腸道黏膜屏障損傷組，Claudin-1蛋白的分布變得毛糙、鋸齒樣改變、熒光強(qiáng)度變?nèi)?圖5,M)，提示TNF-α損傷了Caco-2細(xì)胞Claudin-1蛋白的分布。給予 CMP干預(yù)后，逆轉(zhuǎn)了TNF-α的損傷，Claudin-1蛋白分布變得光滑，熒光信號強(qiáng)度較強(qiáng)(圖5D)，表明 CMP修復(fù)了Claudin-1蛋白的表達(dá)。

3討論

IBD在國外是常見的疾病，患病率約為40/10萬～100/10萬。在我國，該病的患病率有逐年增加的趨勢[6]，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確。由腸道黏膜免疫系統(tǒng)紊亂所致的炎癥反應(yīng)在IBD的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要的作用[7]。腸黏膜屏障主要由腸黏膜表層的黏液層、上皮細(xì)胞層、黏膜基底膜構(gòu)成，主要包括機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障，其阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、食物抗原等物質(zhì)與腸黏膜固有層免疫細(xì)胞接觸，預(yù)防固有層免疫細(xì)胞激活[8,9]。腸黏膜細(xì)胞間的連接復(fù)合體包括緊密連接(Tightjunction,TJ)、黏附連接(Adhesion junction,AJ)、縫隙連接(Gapjunction,GJ)及橋粒(Desmosome)等，其中TJ位于靠近頂側(cè)的細(xì)胞側(cè)面，由多種動(dòng)態(tài)變化的蛋白組成，對維持腸黏膜屏障功能起著重要作用。TJ一旦受到損傷，腸腔內(nèi)的細(xì)菌等有毒大分子物質(zhì)穿過黏膜屏障進(jìn)入體循環(huán)，引起包括炎癥性腸病在內(nèi)的許多疾病。研究表明TNF-α等細(xì)胞因子調(diào)控著緊密連接的動(dòng)態(tài)變化[10]。本實(shí)驗(yàn)以TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞，其跨膜電阻值降低、酚紅透過率升高，表明使Caco-2細(xì)胞間的空隙增大，成功建立了損傷模型。在TNF-α誘導(dǎo)下，Claudin-1蛋白表達(dá)降低，Claudin-1蛋白分布毛糙、鋸齒樣改變、熒光信號強(qiáng)度變?nèi)?，同時(shí)證明了造模成功，并且表明這種對Caco-2細(xì)胞損傷與TJ上的Claudin-1蛋白表達(dá)和分布有關(guān)。

四君子湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草組成，是益氣健脾，補(bǔ)益正氣的經(jīng)典方劑，對消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)具有很好的調(diào)節(jié)作用。隨著對四君子湯研究的深入，發(fā)現(xiàn)茯苓具有較好治療胃腸疾病、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用。 CMP是茯苓的有效成分β-茯苓聚糖在堿性條件下與氯乙酸反應(yīng)的產(chǎn)物，其與茯苓、茯苓多糖、β-茯苓聚糖相比水溶性良好，因此更有利于臨床應(yīng)用。張曉丹等[11]研究發(fā)現(xiàn)，茯苓能夠部分恢復(fù)脾氣虛大鼠模型胃腸脹氣、胃腸壁變薄、大腸充血水腫，并能升高小腸推進(jìn)率，對脾氣虛腹瀉大鼠胃腸形態(tài)及水液代謝皆有改善作用。韓凌等[12,13]發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖對大鼠小腸上皮細(xì)胞株IEC-6細(xì)胞具有促增殖抗遷移的作用。雖然茯苓和茯苓多糖已經(jīng)證明能夠有效治療、預(yù)防胃腸疾病，但是 CMP治療胃腸疾病的研究仍是空白。本實(shí)驗(yàn)以 CMP干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞損傷模型為中心展開研究。 CMP上調(diào)損傷模型中單層跨膜電阻值和降低酚紅的透過率，表明 CMP有可能減小Caco-2細(xì)胞與細(xì)胞間的空隙，有效的阻止腸腔內(nèi)細(xì)菌、內(nèi)毒素等有害物質(zhì)穿過屏障與腸黏膜固有層免疫細(xì)胞接觸，引發(fā)固有層免疫細(xì)胞激活，從而可以有效避免IBD的發(fā)生、發(fā)展。為了進(jìn)一步研究 CMP干預(yù)的作用機(jī)理，我們進(jìn)一步做了TJ結(jié)構(gòu)上Claudin-1蛋白的免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明 CMP修復(fù)了TNF-α損傷的TJ結(jié)構(gòu)上Claudin-1的表達(dá)和分布，使其表達(dá)增加，分布變得光滑、熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此，我們認(rèn)為 CMP能夠有效逆轉(zhuǎn)TNF-α調(diào)控的體外Caco-2細(xì)胞系生物學(xué)特性，可能與Caco-2細(xì)胞TJ結(jié)構(gòu)上Claudin-1蛋白表達(dá)和分布有關(guān)，是治療IBD的潛在藥物。

腸上皮細(xì)胞間的TJ由50多種蛋白構(gòu)成，分為結(jié)構(gòu)蛋白(Claudin、Occludin、JAM等)和功能蛋白(E鈣黏素、肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、Cingulin、胞內(nèi)連接蛋白Z0-1等)，結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)骨架，功能蛋白連接細(xì)胞骨架和膜蛋白，并傳遞信號[14,15]。本實(shí)驗(yàn)初步證明， CMP具有有效修復(fù)受損的腸道黏膜屏障的作用，這一作用與恢復(fù)TJ結(jié)構(gòu)上Claudin-1蛋白有關(guān)。我們將繼續(xù)研究 CMP對TJ的其它蛋白的影響以及信號通路的機(jī)制。

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[收稿2015-10-24修回2015-11-06]

(編輯許四平)

Effect of Carboxytmethylpachymaran on tumor necrosis factor alpha′s control in vitro Caco-2 cell biological characteristics

ZHANGJin-Wei,LUYue,ZHONGXiao-Qin,HEYu-Hua,HANLing.

TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTCM/GuangdongProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China

[Abstract]Objective:To research the effect of Carboxytmethylpachymaran on tumor necrosis factor alpha′s control in vitro Caco - 2 cell biological characteristics and to preli minary discussion on its mechanism.Methods: Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) induce Caco-2 cells to establish damaged model,and then 100 μg/ml CMP intervenes the above model.So we evaluatod model and CMP intervention from TER,phenol red transmittance,tight junction protein claudin-1 expression and distribution.Results: TNF-α induced Caco-2 cells TER decreased obviously(P<0.01),phenol red transmittance increased obviously(P<0.01),expression of claudin-1 protein decreases and protein of claudin-1 changed in distribution was breaked,fluorescence intensity weaken,suggesting building success.TER increased obviously(P<0.01),phenol red transmittance decreases obviously(P<0.01),expression of claudin-1 protein decreases(P<0.05),protein of claudin-1 becomes smooth and stronger fluorescence intensity with CMP intervenes.Conclusion: CMP can effectively repair Caco-2 cells′ damage,which may be associated with recovery claudin-1 protein expression and distribution,and CMP could be potentially effective drugs for the treatment of inflammatory bowel disease.

[Key words]CMP;Intestinal mucosal barrier;IBD;TJ

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.014

作者簡介：張金衛(wèi)(1988年-)，男，在讀碩士，主要從事免疫相關(guān)研究。通訊作者及指導(dǎo)教師：韓凌(1974年-)，女，博士，副研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事補(bǔ)益藥的免疫藥理相關(guān)研究，E-mail:linghan36@163.com。

中圖分類號R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0665-04

①本文受國家自然科學(xué)基金(81202635)資助。

②廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州510006。