程　芮　朱圣韜　郭水龍　李　鵬　郭慶東　張澍田

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科　國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心　首都醫(yī)科大學(xué)消化病學(xué)系　消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京 100050)

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過表達DBHS家族基因可促進食管鱗癌細胞的遷移侵襲

程芮朱圣韜郭水龍李鵬郭慶東張澍田*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心首都醫(yī)科大學(xué)消化病學(xué)系消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京 100050)

【摘要】目的研究人類剪切蛋白(drosophila behavior human splicing，DBHS)家族基因，包括p5nrb、PSF、PSPC1基因，對食管鱗狀細胞癌(以下簡稱食管磷癌)細胞系TE-8細胞系遷移、侵襲能力的影響。方法構(gòu)建p54nrb、PSF、PSPC1基因過表達載體，通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染TE-8細胞，轉(zhuǎn)染48 h后qRT-PCR和Western blotting檢測各組細胞p54nrb、PSF、PSPC1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。細胞劃痕實驗及覆蓋有Matrigel的Transwell小室檢測食管鱗癌細胞的遷移、侵襲能力。結(jié)果過表達p54nrb、PSF、PSPC1后，qRT-PCR和Western blotting檢測證實食管鱗癌TE-8細胞中上述基因表達在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均明顯上調(diào)，細胞劃痕實驗及Transwell小室實驗證實食管鱗癌TE-8細胞過表達p54nrb、PSF、PSPC1后，其遷移、侵襲能力增強。結(jié)論過表達DBHS家族基因可促進食管鱗癌細胞的遷移侵襲。

【關(guān)鍵詞】食管鱗癌；人類剪切蛋白；p54nrb；PSF；PSPC1；侵襲；遷移

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，主要分為兩種病理類型，分別為：食管鱗狀細胞癌(以下簡稱食管磷癌)和食管腺癌，其中90%以上為食管鱗癌，在亞洲人群中，特別是中國地區(qū)，有較高的發(fā)病率和病死率，侵襲轉(zhuǎn)移較快是其預(yù)后不良主要原因[1]。盡管手術(shù)方式、放射治療和化學(xué)藥物治療技術(shù)近年來發(fā)展迅速，但食管鱗癌術(shù)后5年生存率仍較低[2-3]。因此，研究食管鱗癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找抗癌藥物的作用靶點有助于建立新的治療方法。最初Hanke等[4]在小鼠B細胞白血病細胞系中發(fā)現(xiàn)一種可結(jié)合到DNA、RNA的核蛋白，可參與多種生物學(xué)過程。此后Dong等[5]在Hela細胞系中發(fā)現(xiàn)由471個氨基酸殘基組成的，相對分子質(zhì)量約為54 000的核RNA結(jié)合蛋白(nuclear RNA-binding protein of 54 000，p54nrb)，與Hanke等[4]在小鼠中發(fā)現(xiàn)蛋白存在很高的同源性，隨著進一步的研究發(fā)現(xiàn)p54nrb與人類多聚嘧啶束結(jié)合蛋白相關(guān)剪切因子 (polypyramidine tract binding protein-associated splicing factor， PSF)、 細胞核內(nèi)亞細胞器核旁斑點蛋白1(paraspeckle protein 1， PSPC1)，有著高度保守的氨基端同源區(qū)，這些蛋白被歸屬于人類剪切(drosophila behavior human splicing，DBHS)蛋白家族[6-9]，該家族的成員之間可形成同源或異源二聚體，參與各種生物學(xué)反應(yīng)，發(fā)揮多種功能[10-12]。既往研究[13-18]發(fā)現(xiàn)主要參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等過程的調(diào)節(jié)。此外，DBHS家族蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中作用受到越來越多關(guān)注，與前列腺癌、黑色素瘤、白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究[19]發(fā)現(xiàn)，DBHS蛋白在多種 腫瘤細胞中高表達，在腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。然而其對食管鱗癌的相關(guān)研究仍沒有報道過。本研究運用基因轉(zhuǎn)染方法在食管鱗癌細胞系中過表達DBHS家族基因，通過細胞劃痕實驗、Transwell小室等方法，探討食管鱗癌細胞體外遷移、侵襲能力的變化，為食管鱗癌患者的早期診斷和治療提供新的分子指標。

1材料與方法

1.1 材料

1)細胞系：人食管鱗癌細胞系TE-8，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，由本實驗室保存。

2)主要試劑：小鼠抗人Flag單克隆抗體購自Sigma公司(美國)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋有限公司(中國)；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Corning公司(美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司(美國)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑SYBR Green購于Applied Biosystems公司(美國)；pCMV-P54nrb-Flag、pCMV-PSF-Flag、pCMV-PSPC1-Flag過表達載體購自Addgene公司(美國)。

1.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

1)細胞培養(yǎng)：食管鱗癌細胞系TE-8用含10%(體積分數(shù))胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于 37 ℃、5% (體積分數(shù))CO2的細胞培養(yǎng)箱中。細胞密度達80%～90%時，用胰蛋白酶消化傳代。

2)細胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的TE-8細胞接種于6孔板，4×105細胞/孔，參照Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染pCMV空載體、pCMV-P54nrb-Flag、pCMV-PSF-Flag、pCMV-PSPC1-Flag過表達載體。轉(zhuǎn)染6 h后，換為全培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h后，收集細胞。實驗分4組: 轉(zhuǎn)染空載體組(陰性對照組negative control，NC)和p54nrb、PSF、PSPC1過表達載體轉(zhuǎn)染組。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3 qRT-PCR檢測細胞系p54nrb、PSF、PSPC1 mRNA的過表達水平

將上述轉(zhuǎn)染48 h的細胞，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3遍(1 min/次)， Trizol法提取各組細胞總RNA，用Invitrogen轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA。分別擴增目的基因p54nrb、PSF、PSPC1和對照內(nèi)參GAPDH。隨后應(yīng)用SYBR-fast方法，進行實時熒光定量 PCR循環(huán)擴增。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1。反應(yīng)條件為: 95 ℃，5 min預(yù)變性；95 ℃，20 s；60 ℃，1 min，擴增 40個循環(huán)。2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達量，以GAPDH為內(nèi)參。

表1　實時熒光定量PCR引物列表

qRT-PCR: real time quantitative PCR;p54nrb: nuclear RNA-binding protein of 54 000； PSF： polypyramidine tract binding protein-associated splicing factor； PSPC1： paraspeckle protein 1；GAPDH： glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.4Western blotting檢測細胞系p54nrb、PSF、PSPC1蛋白的過表達水平

將上述轉(zhuǎn)染48 h的細胞，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3遍(1 min/次)，加入RIPA中性裂解液，超聲裂解3次(10 s/次)后，冰上裂解細胞，4 ℃、15 000 r/min離心10 min后收集上清，獲得轉(zhuǎn)染細胞的總蛋白。用BCA法行蛋白質(zhì)定量，以調(diào)整蛋白質(zhì)樣品濃度，使每孔蛋白質(zhì)上樣量一致。8%(質(zhì)量分數(shù))SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜儀、PVDF膜恒壓轉(zhuǎn)膜60 min， 5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂牛奶稀釋的小鼠抗人Flag單克隆抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜后加入 HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶8 000)室溫孵育1 h， 經(jīng)過ECL試劑中反應(yīng)1 min，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中進行顯色反應(yīng)，觀察蛋白表達，β-actin作為內(nèi)對照。

速度力量是短跑項目運動員最典型和最重要的力量，也是力量訓(xùn)練中爭議最多的方法之一。短跑項目發(fā)展速度力量主要以發(fā)展爆發(fā)力為主。爆發(fā)力的公式是：爆發(fā)力=F×V即爆發(fā)力是由肌肉力量和肌肉收縮速度兩個因素界定的。在訓(xùn)練中，為了提高爆發(fā)力，應(yīng)著重于肌肉力量和肌肉收縮速度兩個方面的訓(xùn)練。跳深練習(xí)被普遍認為是發(fā)展爆發(fā)力的最好辦法，從一定高度的凳子、跳箱上跳下，落地后即刻向前上方跳起，跳深高度應(yīng)根據(jù)跳馬技術(shù)起跳動作的膝關(guān)節(jié)最大被動緩沖角度制定，踏跳時間控制在0.1～0.4秒左右，練習(xí)時可負重，負重一般為體重的20%較好。

1.5劃痕實驗檢測細胞遷移能力

按照上述轉(zhuǎn)染方法，得到轉(zhuǎn)染24 h的TE-8細胞，PBS洗滌細胞后，胰蛋白酶消化，用含有10%(體積分數(shù))胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細胞懸液，按8×105個/孔的密度接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，用20 μL槍頭沿著板底部劃豎的“1”字形劃痕，PBS洗細胞3遍，顯微鏡下拍照記錄，為0 h，并做好標記，每組細胞取6個點，劃痕后24 h，細胞換液，在做標記的6個點再次進行顯微鏡下照相。

1.6Transwell小室侵襲實驗

提前10 min將覆蓋有Matrigel的小室置于室溫解凍，在24孔板中放入常溫?zé)o血清RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL，用滅菌的鑷子將小室置入其中，在上層加入常溫?zé)o血清RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL，37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2孵育2 h進行水化，之后將培養(yǎng)基吸除。將上述轉(zhuǎn)染24 h的各組細胞用PBS洗滌細胞后，胰蛋白酶消化，用不含血清RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細胞懸液，并接種于鋪有Matrigel膠的小室中。上室加500 μL (2×105個/室)應(yīng)用不含血清RPMI-1640培養(yǎng)基制成的細胞懸液，下室加750 μL含10%(體積分數(shù))血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2孵育。36 h后取出小室，甲醇固定5 min，使用棉簽去除濾膜表面未穿膜細胞，用DAPI進行染色，熒光顯微鏡下隨機選取10個視野，計數(shù)每個視野中的穿膜細胞數(shù)。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1qRT-PCR檢測過表達p54nrb、PSF、PSPC1 mRNA水平

采用qRT-PCR檢測p54nrb、PSF、PSPC1 mRNA水平過表達效率， 食管鱗癌細胞系TE-8中轉(zhuǎn)染外源性過表達p54nrb、PSF、PSPC1載體48 h后，實驗組p54nrb、PSF、PSPC1 mRNA水平均高于空載體組，以空載體組mRNA水平為對照，其外源性過表達p54nrb、PSF、PSPC1后升高的倍數(shù)分別為：17.35±2.24，35.17±3.23，24.35±1.78(圖1)，表明p54nrb、PSF、PSPC1過表達質(zhì)粒成功導(dǎo)入TE-8細胞系中，并在RNA水平表達。

圖1　TE-8轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒NC，過表達質(zhì)粒

**P<0.01vsNC.WB：Western blotting；NC： negative control； p54nrb： nuclear RNA-binding protein of 54 000； PSF： polypyramidine tract binding protein-associated splicing factor； PSPC1： paraspeckle protein 1； N： numbers.

2.2Western blotting 方法檢測過表達p54nrb、PSF、PSPC1蛋白水平

DBHS家族基因過表達載體含有Flag標簽蛋白，為融合表達蛋白，與目的基因同時表達，通過檢測到Flag的蛋白水平，可反映出p54nrb、PSF、PSPC1過表達蛋白水平。在6孔板中接種TE-8細胞使細胞密度達90%，按照以上轉(zhuǎn)染步驟進行細胞轉(zhuǎn)染，48 h后收集細胞裂解液，Western blotting檢測各組細胞Flag蛋白表達水平，結(jié)果顯示分別在約54 000、100 000、 59 000得到特異性條帶，與預(yù)期蛋白大小一致，表明p54nrb、PSF、PSPC1過表達質(zhì)粒成功導(dǎo)入TE-8細胞系中，并在蛋白水平表達(圖2)。

圖2　TE-8轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒NC，過表達質(zhì)粒Flag-p54nrb、

WB：Western blotting; NC： negative control； p54nrb： nuclear RNA-binding protein of 54 000； PSF： polypyramidine tract binding protein-associated splicing factor； PSPC1： paraspeckle protein 1.

2.3過表達p54nrb、PSF、PSPC1后對TE-8細胞遷移能力的影響

應(yīng)用Photoshop軟件的直方圖功能分析各組細胞

遷移面積的比較:空載體組和p54nrb、PSF、PSPC1轉(zhuǎn)染組細胞24 h后遷移的面積的分別為 6 135.5±140.7 、 11 891.5±268.0、10 777±188.1、7 402.5±314.7，以空載體組作為對照組，設(shè)定為1，得到p54nrb、PSF、PSPC1過表達各組細胞遷移倍數(shù)，與空載質(zhì)粒組的比較，細胞在劃痕兩側(cè)逐漸向中間遷移， p54nrb、PSF、PSPC1轉(zhuǎn)染組的TE-8細胞向劃痕中間遷移的速度明顯增快，劃痕間距離較近，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.3過表達p54nrb、PSF、PSPC1后對TE-8細胞侵襲能力的影響

通過應(yīng)用覆蓋有Matrigel的Transwell小室檢測選取p54nrb、PSF、PSPC1過表達后對TE-8細胞的侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，與空載體組比較，TE-8細胞過表達p54nrb、PSF、PSPC1后，食管鱗癌細胞的穿膜細胞數(shù)明顯增多，侵襲能力均明顯增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖3　p54nrb、PSF、PSPC1過表達食管鱗癌細胞的遷移實驗結(jié)果

A: results of wound healing assay; B:statistical graph;*P<0.05,**P<0.01; NC： negative control； p54nrb： nuclear RNA-binding protein of 54 000； PSF： polypyramidine tract binding protein-associated splicing factor； PSPC1： paraspeckle protein 1； N: numbers.

圖4　p54nrb、PSF、PSPC1過表達后可增強食管鱗癌細胞TE-8的侵襲能力

A:esults of wound healing assay; B:statistical graph;*P<0.05,**P<0.01; NC: negative control； p54nrb: nuclear RNA-binding protein of 54 000； PSF: polypyramidine tract binding protein-associated splicing factor； PSPC1: paraspeckle protein 1； N: numbers.

3討論

食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其病理類型主要包括鱗癌與腺癌兩種。食管腺癌在歐美國家常見，我國90%以上都是食管鱗癌。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要 特點之一，也是導(dǎo)致大部分腫瘤預(yù)后差的原因之一。惡性腫瘤的侵襲過程是動態(tài)連續(xù)的過程。原發(fā)腫瘤形成后，首先侵襲細胞外基質(zhì)，侵襲臨近的血管進入血液循環(huán)中，再經(jīng)血管壁到其他部位，形成腫瘤的轉(zhuǎn)移灶。食管鱗癌轉(zhuǎn)移快，預(yù)后差，研究其侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機制至關(guān)重要。

P54nrb、PSF、PSPC1基因?qū)儆贒BHS家族，其中，p54nrb與PSF、PSPC1常以同源或異源二聚體的形式參與多種核內(nèi)過程[6-7]，DBHS家族基因在腫瘤方面的研究近年來受到很多關(guān)注，p54nrb在惡性黑色素瘤細胞系和組織中呈高表達，體外實驗[19]顯示p54nrb可作為黑色素瘤抑制活性(melanoma inhibitory activity， MIA)蛋白的靶蛋白對惡性黑色素瘤細胞具有促進腫瘤細胞增生和遷移的作用，此外在膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)p54nrb可促進腫瘤細胞對血管的侵襲作用。PSF可以于人類腫瘤細胞系中的多種基因結(jié)合并通過抑制其轉(zhuǎn)錄活性影響腫瘤細胞的增生等功能，如人宮頸癌細胞系Hela細胞中存在編碼PSF的DNA結(jié)合域基因缺失，可能與Hela細胞癌變相關(guān)[20]。PSF與癌基因Hakai在腫瘤細胞核中存在共定位，通過DNA結(jié)合域結(jié)合，過表達Hakai可增強PSF與某些mRNA結(jié)合能力，這些mRNA可編碼腫瘤生成、細胞黏附等功能，如腫瘤及血管生成因子PAI-RBP1的mRNA，骨架蛋白α-catenin的mRNA，在這過程中促進了某些腫瘤的形成及侵襲、遷移能力[21-23]。關(guān)于另一個分子PSPC1蛋白的功能報道較少，僅有少量研究報道表示PSPC1可參與基因表達調(diào)控或RNA生成過程。然而DBHS家族基因與食管鱗癌的侵襲遷移功能仍沒有報道過。

本研究首次揭示了p54nrb、PSF、PSPC1對食管鱗癌細胞侵襲、遷移能力的增強作用。本研究通過qRT-PCR和Western blotting方法證實過表達p54nrb、PSF、PSPC1后，食管鱗癌細胞系TE-8中p54nrb、PSF、PSPC1表達在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均明顯升高，通過細胞劃痕及Transwell小室的侵襲和遷移實驗表明，p54nrb、PSF、PSPC1過表達后，食管鱗癌細胞系TE-8細胞遷移、侵襲能力增強。實驗結(jié)果證實，p54nrb、PSF、PSPC1在食管鱗癌細胞系TE-8中發(fā)揮著促癌作用，推測DBHS家族基因很有可能作為食管鱗癌的新的腫瘤標志物，將為腫瘤的治療提供新思路。然而，對于促進食管鱗癌細胞的侵襲和遷移的具體機制，尚待進一步研究。

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編輯慕萌

Effect ofDBHSfamily members on migration and invasion of esophageal squamous cell carcinoma

Cheng Rui，Zhu Shengtao，Guo Shuilong，Li Peng，Guo Qingdong，Zhang Shutian*

(DepartmentofGastroenterology，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity;NationalClinicalResearchCenterforDigestiveDiseases;FacultyofGastroenterologyinCapitalMedicalUniversity;BeijingKeyLaboratoryforPrecancerousLesionofDigestiveDiseases，Beijing100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of drosophila behavior human splicing(DBHS) family members， including p54nrb， PSF and PSPC1， on regulation of migration and invasion in human esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cell line TE-8.MethodsAfter transfection with p54nrb， PSF and PSPC1 plasmids， the expression of mRNA and protein in human ESCC cell line TE-8 were determined by qRT-PCR and Western blotting， respectively. Wound healing and Matrigel invasion test were used to detect the effects of p54nrb， PSF and PSPC1 overexpression on migration and invasion of the cells， respectively. ResultsAfter 48 h of transfection with p54nrb， PSF and PSPC1 plasmids， the expression of relatives p54nrb， PSF and PSPC1 mRNA and protein levels were increased (P<0.05)， respectiveIy. The migration rate was measured by wound healing after overexpression of p54nrb， PSF and PSPC1， was promoted significantly (P<0.05). Matrigel invasion of the cells were significantly increased after p54nrb， PSF and PSPC1 plasmids transfection (P<0.05). ConclusionOverexpression of DBHS family members could promote both migration and invasion of ESCC cell line.

【Key words】esophageal squamous cell carcinoma；drosophila behavior human splicing(DBHS)；p54nrb；PSF；PSPC1；invasion；migration

(收稿日期：2015-12-25)

【中圖分類號】R 655.4

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.002]

*Corresponding author， E-mail：zhangshutian@ccmu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81302160， 81272447)，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心基金(2015BAI13B09)，北京市自然科學(xué)基金(7152043)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81302160， 81272447)， National Clinical Research Center for Digestive Diseases (2015BAI13B09)， Natural Science Foundation of Beijing (7152043).

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-2718∶00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1800.024.html

· 消化系統(tǒng)重大疾病的全鏈條研究 ·