胡海燕++++++劉植華

[摘要] 目的 觀察全反式維甲酸（ATRA）對宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討其分子機制。 方法 分別用不同濃度ATRA（1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L）處理對數(shù)生長期HeLa/MMC細(xì)胞，以Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化；采用CCK-8法檢測經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L ATRA處理后的細(xì)胞增殖情況；通過流式細(xì)胞儀觀察1×10-6 mol/L ATRA處理HeLa/MMC細(xì)胞3、7 d后細(xì)胞周期的變化；半定量RT-PCR檢測1×10-6 mol/L ATRA處理HeLa/MMC細(xì)胞3、7 d后細(xì)胞c-myc mRNA水平變化。 結(jié)果 ①Transwell小室結(jié)果顯示，1×10-7 mol/L ATRA組、1×10-6 mol/L ATRA組、1×10-5 mol/L ATRA組細(xì)胞侵襲數(shù)、轉(zhuǎn)移數(shù)[（40±6）、（73±7）個，（26±4）、（61±4）個，（16±3）、（49±5）個）]均減少，與對照組[（63±9）、（89±9）個]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。②CCK-8法檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，隨著全反式維甲酸藥物濃度的遞增，HeLa/MMC細(xì)胞增殖逐漸被抑制；實驗各組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。③流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，全反式維甲酸使進(jìn)入S期耐藥細(xì)胞數(shù)減少。1×10-6 mol/L ATRA處理3、7 d S期細(xì)胞比例分別為（14.90±0.21）%、（6.48±0.18）%；兩個實驗組與對照組（16.28±0.12）%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。④RT-PCR結(jié)果顯示，全反式維甲酸下調(diào)癌基因c-myc的轉(zhuǎn)錄。1×10-6 mol/L ATRA處理3、7 d c-myc mRNA相對表達(dá)量分別為（0.5406±0.0011）、（0.4312±0.0009）；兩個實驗組與對照組（0.6804±0.0012）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 全反式維甲酸可抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移，其機制可能通過下調(diào)癌基因c-myc轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)。

[關(guān)鍵詞] 宮頸腫瘤；維甲酸；轉(zhuǎn)移；侵襲

[中圖分類號] R737.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（c）-0018-04

全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是由維生素A在人體內(nèi)代謝生成的高活性衍生物，對胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞分化以及機體的生長、發(fā)育均具有重要調(diào)節(jié)作用[1]。到目前為止，ATRA用于急性早幼粒白血病治療的基礎(chǔ)與臨床研究較為深入[2-3]，而有關(guān)人體實體瘤的分化研究，已見報道的有結(jié)腸癌、胃癌、肺鱗狀上皮癌、乳腺癌等[4-5]。本課題組的前期研究顯示，ATRA能有效抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa增殖并誘導(dǎo)其分化，且能提高宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC對化療的敏感性[6]。宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC較其親本細(xì)胞HeLa增殖更快、惡性度更高。本研究以宮頸癌耐絲裂霉素細(xì)胞株HeLa/MMC為研究對象，體外觀察ATRA對宮頸癌耐藥細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響，探討其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ATRA、二甲基亞砜（DMSO）、PI、CCK-8試劑盒、RNase（Sigma公司、美國）。Transwell小室（Corning公司、美國）。SV總RNA分離試劑盒（Promega公司、美國）。One step RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司、中國）。引物由中國上海Invitrogen公司合成。

1.2 耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC的建立

耐藥細(xì)胞株由武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤研究所惠贈。通過連續(xù)性給藥，間歇性增加藥量，逐步提高宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)液中絲裂霉素濃度，獲得對絲裂霉素5.02倍耐藥，對順鉑2倍耐藥的HeLa/MMC細(xì)胞株。該細(xì)胞株對長春新堿、5-氟尿嘧啶、阿霉素保持敏感。

1.3 方法

1.3.1 耐藥細(xì)胞的培養(yǎng) HeLa/MMC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中加入絲裂霉素維持其耐藥性，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。視細(xì)胞生長情況隔天換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2 Transwell小室檢測耐藥細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL。細(xì)胞轉(zhuǎn)移試驗中，在Transwell小室的上室中加入100 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞侵襲實驗，用無血清預(yù)冷的DMEM稀釋Matrigel膠（3∶1）。加30 μL稀釋的Matrigel于Transwell小室的上室，37℃放置過夜。上室加入100 μL細(xì)胞懸液，設(shè)3個復(fù)孔。實驗組加入三種濃度ATRA（1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L）。下室中加入含有10%滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。陰性對照組加入相應(yīng)體積培養(yǎng)液。置于5%CO2、37℃、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。取出小室，用棉簽拭去小室內(nèi)細(xì)胞和Matrigel膠，PBS沖洗，10%甲醛固定15 min，PBS沖洗，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，清水沖洗后倒置顯微鏡下觀察計數(shù)。每個樣本隨機取5個高倍鏡視野（200×）計細(xì)胞數(shù)，取其平均值。

1.3.3 CCK-8法檢測耐藥細(xì)胞的增殖情況 將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔5×103個細(xì)胞，實驗組分別加入不同濃度的ATRA（1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L），陰性對照組不加藥物，空白對照組無細(xì)胞，僅加入相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，各組均設(shè)3個復(fù)孔。共培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加含CCK-8 10 μL的完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，用酶聯(lián)儀測450 nm處的OD值。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期 用胰酶將1×10-6 mol/L ATRA分別作用3、7 d的實驗組細(xì)胞及對照組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，預(yù)冷過的70%乙醇固定細(xì)胞，4℃冰箱保存。上流式細(xì)胞儀檢測前棄乙醇，加入RNA酶作用30 min，100 μg/mL PI染色液4℃避光染色30 min，細(xì)胞經(jīng)300目過濾網(wǎng)后上機檢測。各組測1×104個細(xì)胞，經(jīng)計算機軟件處理得出細(xì)胞周期各時相百分比（%）。實驗重復(fù)3次。

1.3.5 半定量RT-PCR分析耐藥細(xì)胞的c-myc基因表達(dá) 收集1×10-6 mol/LATRA分別作用3、7 d的細(xì)胞及對照組細(xì)胞，按SV總RNA分離試劑盒說明提取細(xì)胞RNA。引物序列設(shè)計如下：c-myc上游5'-CTC TCA ACG ACA GCA GCC CG-3'，下游5'-AGG TGA TCC AGA CTC TGA CC-3'；β-actin上游5'-CGT CTG GAC CTG GCT GGC CGG GAC C-3'，下游5'-CTA GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT G-3'。擴(kuò)增DNA片段大?。篶-myc 250 bp，β-actin 600 bp。依據(jù)TaKaRa公司的one step RT-PCR試劑盒的操作說明，將反應(yīng)體系置于DNA循環(huán)儀中，42℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，合成互補DNA。95℃預(yù)變性5 min，再進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR循環(huán)條件：95℃變性1 min、56℃退火1 min、72℃延伸1 min。共計30個循環(huán)后，72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測拍照記錄結(jié)果。采用HPIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)掃描測定，以基因β-actin作為內(nèi)參照，計算c-myc mRNA的相對表達(dá)量并比較表達(dá)差異。實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用one-way ANOVA做多組均數(shù)比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化

Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力結(jié)果顯示：經(jīng)ATRA處理過的HeLa/MMC細(xì)胞侵襲數(shù)及轉(zhuǎn)移數(shù)均明顯減少，且隨著藥物濃度增加，細(xì)胞侵襲數(shù)及轉(zhuǎn)移數(shù)減少。與對照組比較，ATRA各濃度實驗組的侵襲細(xì)胞數(shù)、轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。說明ATRA能抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞HeLa/MMC的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。見表1。

表1 全反式維甲酸對HeLa/MMC細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響（個，x±s）

注：與陰性對照組比較，*P < 0.05

2.2 CCK-8法測定耐藥細(xì)胞的增殖情況

實驗組經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6、5×10-6、1×10-5 mol/L ATRA處理后的HeLa/MMC細(xì)胞，細(xì)胞增殖被抑制。ATRA在1×10-7 mol/L的低濃度下就有抑制耐藥細(xì)胞株增殖作用，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），且隨著濃度遞增，抑制作用逐漸增強。ATRA抑制耐藥細(xì)胞增殖的作用存在一定的劑量依賴關(guān)系。見表2。

表2 全反式維甲酸對HeLa/MMC細(xì)胞的生長抑制作用（x±s）

注：與陰性對照組比較，*P < 0.05

2.3 流式細(xì)胞儀檢測耐藥細(xì)胞細(xì)胞周期的變化

HeLa/MMC細(xì)胞經(jīng)1×10-6 mol/L ATRA處理3 d后細(xì)胞周期分布的變化，表現(xiàn)在細(xì)胞堆積在G1/G0期，而進(jìn)入S期細(xì)胞相應(yīng)減少。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。隨著ATRA藥物作用時間的延長，堆積在G1/G0期的細(xì)胞比例逐步升高，進(jìn)入S期的細(xì)胞比例相應(yīng)降低。提示ATRA能阻止HeLa/MMC細(xì)胞由G1/G0期進(jìn)入S期。見表3。

表3 HeLa/MMC細(xì)胞周期分布（%，x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05；ATRA1實驗組：1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理3 d；ATRA2實驗組：1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理7 d

2.4 c-myc基因RT-PCR擴(kuò)增片段的電泳結(jié)果

實驗組和對照組（圖1）均可見兩條基因片段：250 bp的c-myc（目的基因）和600 bp的β-actin（內(nèi)參基因）。經(jīng)1×10-6 mol/LATRA分別處理3、7 d后的HeLa/MMC細(xì)胞c-myc mRNA相對表達(dá)量較對照組減少（見圖1c、d）。

a.marker；b.對照組；c.經(jīng)1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理3 d實驗組；d.經(jīng)1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理7 d實驗組

圖1 c-myc基因RT-PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.5 c-myc基因RT-PCR擴(kuò)增片段的半定量結(jié)果

對照組細(xì)胞c-myc mRNA相對表達(dá)量為（0.6804±0.0012）。細(xì)胞經(jīng)1×10-6 mol/LATRA處理3 d后的c-myc mRNA相對表達(dá)量為（0.5406±0.0011），低于對照組。細(xì)胞經(jīng)1×10-6 mol/LATRA作用至7 d時，c-myc mRNA相對表達(dá)量降至（0.4312±0.0009）。實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），這提示ATRA抑制了c-myc癌基因的轉(zhuǎn)錄。見表4。

表4 c-myc基因RT-PCR擴(kuò)增片段半定量結(jié)果（x±s）

注：與對照組比較，*P < 0.05；ATRA1實驗組：1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理3 d；ATRA2實驗組：1×10-6 mol/L全反式維甲酸處理7 d

3 討論

子宮頸癌是發(fā)生于宮頸上皮的惡性腫瘤，是女性最常見的生殖道惡性腫瘤。發(fā)病率近年來呈上升趨勢，發(fā)病年齡趨于年輕化[7]，危害年輕女性的生殖健康。化療可以縮小腫瘤病灶，控制轉(zhuǎn)移灶，在晚期宮頸癌的治療中占有重要地位[8-9]。而且術(shù)前的新輔助化療已可替代術(shù)前放療，提高手術(shù)成功率，同時避免放療引起女性卵巢功能的衰退?；熉?lián)合手術(shù)、放療的綜合治療，對于晚期宮頸癌患者改善預(yù)后、延長患者生存時間非常重要。然而化療失敗的主要原因是患者化療過程中出現(xiàn)腫瘤耐藥，化療藥無法殺滅腫瘤細(xì)胞。而且治療過程中，容易出現(xiàn)腫瘤的播散、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，影響患者預(yù)后。ATRA作為誘導(dǎo)分化劑，對于調(diào)節(jié)組織器官的功能和細(xì)胞的增殖、代謝、形態(tài)分化具有重要作用，以及調(diào)控機體生長發(fā)育以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用[10]。國內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ATRA可抑制兔頸動脈粥樣硬化斑塊中血管平滑肌細(xì)胞的遷徙轉(zhuǎn)移，從而抑制兔頸動脈管腔的狹窄。其作用的分子機制是下調(diào)c-myc的表達(dá)[11]。本研究旨在觀察ATRA對宮頸癌耐藥細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響及癌基因c-myc轉(zhuǎn)錄水平的變化，探討ATRA應(yīng)對宮頸癌化療耐藥的可行性及其作用的分子靶點。

惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是其區(qū)別于正常細(xì)胞的生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致惡性腫瘤患者腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因。本研究應(yīng)用Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力結(jié)果顯示，ATRA可抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞HeLa/MMC的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，隨著藥物濃度的遞增，腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移數(shù)減少。本研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度ATRA能抑制HeLa/MMC細(xì)胞增殖，降低其惡性度。CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，1×10-7～1×10-5 mol/L的ATRA對耐藥腫瘤細(xì)胞HeLa/MMC細(xì)胞的增殖有抑制作用，且這種抑制作用呈劑量依賴性。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，ATRA將腫瘤耐藥細(xì)胞阻滯于G1期，使進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)明顯減少。這從另一個角度說明ATRA使腫瘤耐藥細(xì)胞阻滯于G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。

已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中存在癌基因的異常過表達(dá)[8]。不同學(xué)者研究證實人宮頸癌及癌旁組織均有c-myc基因擴(kuò)增，癌組織的擴(kuò)增倍數(shù)高于癌旁組織。c-myc基因的激活和異常表達(dá)與宮頸鱗狀上皮癌變過程密切相關(guān)[12]。筆者前期研究顯示，耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC的惡性程度顯著高于宮頸癌細(xì)胞HeLa。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是個多階段、多步驟過程，受多個基因、多個信號分子在時間、空間效應(yīng)上的共同調(diào)節(jié)。經(jīng)典癌基因c-myc位于人8號染色體，其編碼的c-myc核蛋白，參與酪氨酸激酶信號通路，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移腫瘤耐藥中起重要作用[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)ATRA下調(diào)耐藥細(xì)胞癌基因c-myc的轉(zhuǎn)錄。隨著ATRA作用時間的延長，HeLa/MMC細(xì)胞內(nèi)癌基因c-mycmRNA的水平逐漸降低。故推測，ATRA可能通過轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)HeLa/MMC細(xì)胞c-myc的表達(dá)，發(fā)揮其抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力，同時誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯、抑制細(xì)胞增殖。由此，本研究認(rèn)為c-myc基因是ATRA發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵“靶點”基因。

腫瘤化療耐藥是臨床治療惡性腫瘤的難點，也是惡性腫瘤患者預(yù)后差的重要原因。鑒于ATRA能抑制宮頸癌耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC的侵襲、轉(zhuǎn)移，可以認(rèn)為ATRA是一種很有前景的治療耐藥宮頸惡性腫瘤的藥物，值得在其調(diào)控腫瘤耐藥細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及作用機制方面的進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2014-10-16 本文編輯：張瑜杰）