趙中新　?！∧取∩w菁菁　田　蕾　李麗英

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系‘肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)’北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

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激活大麻素受體1誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞J774A.1的遷移依賴RNA結(jié)合蛋白HuR

趙中新常娜蓋菁菁田蕾李麗英*

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系‘肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)’北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

【摘要】目的研究大麻素受體1(cannabinoid receptor 1， CB1)在單核巨噬細(xì)胞遷移中的重要作用以及RNA結(jié)合蛋白人抗原R (human antigen R， HuR)參與其中的可能機(jī)制。方法選用單核巨噬細(xì)胞系J774A.1，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳和免疫熒光染色技術(shù)鑒定J774A.1中CB1以及HuR的表達(dá)；ACEA和AM281分別為CB1的藥理學(xué)激動(dòng)劑和拮抗劑，應(yīng)用Boyden chamber法檢測(cè)ACEA和AM281對(duì)J774A.1遷移活性的影響。HuR的基因干擾用于確定激活CB1誘導(dǎo)的J774A.1遷移功能是否依賴HuR；胞質(zhì)蛋白的分離用于探究激活CB1是否能引起J774A.1胞質(zhì)中HuR的富集；RT-qPCR和Western blotting法檢測(cè)CB1和HuR mRNA和蛋白質(zhì)的變化情況。結(jié)果該研究證明J774A.1在基因和蛋白質(zhì)水平上均表達(dá)CB1和HuR；激活CB1能夠促進(jìn)J774A.1的遷移(P<0.01)并且能夠被其藥理學(xué)拮抗劑AM281所抑制；激活CB1誘導(dǎo)的J774A.1的遷移依賴HuR；激活CB1促進(jìn)了J774A.1胞質(zhì)中HuR的富集進(jìn)一步影響了CB1的表達(dá)，由此HuR參與了激活CB1誘導(dǎo)的J774A.1的遷移。結(jié)論激活CB1能夠誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞系J774A.1的遷移，且此過(guò)程依賴RNA結(jié)合蛋白HuR。

【關(guān)鍵詞】人抗原R；大麻素受體1；細(xì)胞遷移

內(nèi)源性大麻素是一種酰胺、酯類(lèi)和長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸組成的脂質(zhì)分子，在神經(jīng)退行性病變、疼痛和抑郁、心血管系統(tǒng)疾病、肥胖和能量代謝性等疾病中發(fā)揮重要的作用[1-3]。大麻素受體是七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，能夠介導(dǎo)大麻素的多種生物學(xué)效應(yīng)。大麻素受體1(cannabinoid receptor 1， CB1)是內(nèi)源性大麻素物質(zhì)花生四烯酸乙醇胺(anandamide， AEA)的受體。目前已有文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道CB1 能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞的遷移，CB1在體外可以通過(guò)PI3K-Akt通路介導(dǎo)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的遷移，CB1還可以介導(dǎo)人胚腎293細(xì)胞的遷移。然而CB1是否介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞的遷移還不清楚。

人抗原R (human antigen R， HuR)是胚胎致死異常視覺(jué)(embryonic lethal abnormal vision， ELAVL)蛋白家族中的一員，廣泛表達(dá)在各種組織和細(xì)胞中，是最為典型的RNA結(jié)合蛋白。正常情況下，HuR主要定位于細(xì)胞核中，而發(fā)揮功能主要在細(xì)胞質(zhì)中[6]。HuR通過(guò)與特定的靶mRNA結(jié)合，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化、細(xì)胞代謝、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞凋亡等生理進(jìn)程。但HuR是否影響單核巨噬細(xì)胞的遷移卻還不清楚。因此本研究擬采用小鼠單核巨噬細(xì)胞系J774A.1為研究對(duì)象，以CB1和HuR為靶分子，以此探討激活CB1對(duì)J774A.1遷移的影響以及HuR參與其中的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠單核巨噬細(xì)胞J774A.1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco 公司，美國(guó))；胎牛血清(Excell公司，中國(guó))；ACEA和 AM281(TOCRIS/R&D公司，美國(guó))；兔抗CB1多克隆抗體(Cayman Chemical公司， 美國(guó))，抗HuR單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))，抗β-Tubulin 單克隆抗體(全式金公司，中國(guó))；山羊抗鼠二抗(CST公司，美國(guó))。FITC標(biāo)記的二抗(Jackson Immunoresearch公司，美國(guó))；Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen公司，美國(guó))；Boyden chamber(BD公司，美國(guó))；RNeasy Mimi Kit(Quagen公司，德國(guó))；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))；SYBR Green PCR Master Mix， Taqman Universal PCR Master Mix(ABI公司，美國(guó))。

德國(guó) Heraeus 公司CO2培養(yǎng)箱 (BB16)；德國(guó)Leica公司熒光倒置顯微鏡；美國(guó) LI-COR 公司Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)；美國(guó) Bio-Rad 公司Gel-Doc 凝膠成像系統(tǒng)；美國(guó)ABI公司Real-time PCR儀(AB Prism 7300)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

J774A.1采用含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))雙抗的DMEM培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4瓊脂糖凝膠電泳鑒定J774A.1中CB1、HuR 的表達(dá)

J774A.1的CB1和HuR的RT-PCR產(chǎn)物DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%， 100 V恒壓電泳30～40 min，暗室內(nèi)紫外燈照射觀察拍照。RT-PCR所用引物見(jiàn)表1。

表1　引物序列

HuR:human antigen R； CB1: cannabinoid receptor 1.

1.5細(xì)胞免疫熒光鑒定J774A.1中CB1、HuR的表達(dá)

接種J774A.1 5 000個(gè)/孔于96孔板中，細(xì)胞過(guò)夜貼壁，用4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛4 ℃固定細(xì)胞30 min。PBS洗3次，每次5 min。0.5%(體積分?jǐn)?shù))的PBST室溫打孔15 min，2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白37 ℃封閉30 min，分別用一抗CB1(1∶50)、HuR(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5 min。FITC標(biāo)記的二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。DAPI染色5 min，熒光顯微鏡獲取圖像。

1.6Boyden chamber法檢測(cè)J774A.1的遷移能力

J774A.1提前饑餓24 h，收集細(xì)胞，并用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM重懸并進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。以4×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種到Boyden chamber小室中，小室下層加入700 μL無(wú)血清培養(yǎng)基(ACEA作為刺激因子加入下室)，37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2遷移6 h，遷移結(jié)束后，冷甲醇固定30 min，PBS洗3次。蘇木精染色1 h，PBS沖洗3次，并用醫(yī)用棉簽擦去上層未遷移至底面的細(xì)胞。在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，每孔拍5個(gè)視野，取平均值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7RNA的干擾實(shí)驗(yàn)

RNA干擾的靶向基因?yàn)镠uR，同時(shí)采用一個(gè)與其他已知的哺乳動(dòng)物基因序列不具有同源性的siRNA序列作為陰性對(duì)照(表2)。其序列均由奧科公司設(shè)計(jì)與合成。轉(zhuǎn)染前一天將3×105個(gè)細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，使細(xì)胞在24 h內(nèi)匯合達(dá)到50%～60%。

表2　siRNA序列

HuR: human antigen R.

1.8Western blotting檢測(cè)HuR和CB1的表達(dá)

提取總蛋白：收取細(xì)胞， 利用RIPA裂解液提取總蛋白，參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白進(jìn)行定量， 每孔上樣70 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上， 室溫?fù)u床封閉1 h， anti-HuR按1∶1 000稀釋?zhuān)?anti-Tublin按1∶1 000稀釋?zhuān)?anti-CB1按1∶200稀釋。 4 ℃孵育過(guò)夜， TBS洗滌3次， 每次5 min。山羊抗鼠或者山羊抗兔二抗按 1∶10 000稀釋?zhuān)?室溫1 h， TBS洗滌3次， 每次5 min， Odyssey 紅外熒光掃描成像。

提取胞質(zhì)蛋白具體步驟參照之前的文獻(xiàn)[7]。

1.9RT-qPCR

處理后的細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗，加入350 μL裂解液，收集裂解底物提取全細(xì)胞RNA，定量后取0.5 μg

反轉(zhuǎn)錄(不加反轉(zhuǎn)錄酶作為陰性對(duì)照，即NO-RT)，cDNA稀釋后進(jìn)行PCR反應(yīng)(引物序列見(jiàn)表1)。檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始濃度的間接指標(biāo)，溶解曲線分析采用默認(rèn)條件。結(jié)果以18S rRNA 進(jìn)行校正，用ΔΔCt 法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1J774A.1在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均表達(dá)HuR和CB1

為了檢測(cè)J774A.1在mRNA水平上表達(dá)HuR和CB1，取細(xì)胞中的HuR和CB1的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。NO-RT為陰性對(duì)照，電泳結(jié)果顯示在115 bp處有CB1條帶。在127bp處有HuR條帶(圖1A)。

為了進(jìn)一步確認(rèn)J774A.1在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)HuR和CB1。采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法。J774A.1細(xì)胞在蛋白質(zhì)水平上明顯表達(dá)CB1(綠色熒光)和HuR(綠色熒光)，且可以看出CB1在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而HuR主要在細(xì)胞核中表達(dá)(圖1B)。

圖1　J774A.1在基因和蛋白質(zhì)水平上均表達(dá)HuR和CB1

A：RT-PCR production of CB1 or HuR was size fractionated in a 2% agarose gel； B：Representative images of J774A.1 for CB1 or HuR (green) were showed by immunofluorescence. Nuclei were stained with DAPI. Scale bars: 25 μm； CB1: cannabinoid receptor 1；HuR:human antigen R.

2.2 激活CB1促進(jìn)了J774A.1的遷移

為了探究CB1在單核巨噬細(xì)胞遷移過(guò)程中的重要作用，應(yīng)用Boyden chamber法檢測(cè)，下室分別加入不同濃度的CB1激動(dòng)劑ACEA誘導(dǎo)遷移，遷移6 h之后顯微鏡下觀察拍照計(jì)數(shù)。遷移實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖所示，與對(duì)照組相比，加入100 nmol/L、300 nmol/L的ACEA均能夠促進(jìn)J774A.1的遷移。其中300 nmol/L的濃度促遷移能力最大，上調(diào)為對(duì)照組的1.7倍 (P<0.01)(圖2)。

圖2　激活CB1促進(jìn)了J774A.1的遷移

Boyden chamber assay was performed in J774A.1 unstimulated and stimulated with ACEA (CB1 agonist). The migratory effects with ACEA of indicated concentrations on J774A.1 were estimated. Migration values were determined by counting five fields per chamber after fixing the membrane in cold methanol and staining with hematoxyllin. **P<0.01vscontrol,n=3； CB1: cannabinoid receptor 1.

2.3AM281抑制了激活CB1誘導(dǎo)的J774A.1的遷移

進(jìn)一步的，在藥理上失活J774A.1的CB1受體，然后用300 nmol/L濃度的ACEA誘導(dǎo)遷移。CB1受體的拮抗劑AM281在10 μmol/L的濃度上幾乎完全抑制了ACEA對(duì)J774A.1的促遷移作用。這些都提示了CB1受體的激活介導(dǎo)了J774A.1的遷移(圖3)。

2.4RNA結(jié)合蛋白HuR參與了激活CB1誘導(dǎo)的J774A.1的遷移

HuR是一種在各種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)的RNA結(jié)合蛋白，它通過(guò)與靶mRNA結(jié)合來(lái)調(diào)控其表達(dá)進(jìn)而參與到了細(xì)胞遷移、細(xì)胞生長(zhǎng)與分化等各種細(xì)胞生理進(jìn)程中。為了探討HuR是否參與到了激活CB1誘導(dǎo)的J774A.1遷移過(guò)程中。采用RNA干擾方法，干擾的靶向基因?yàn)镠uR。J774A.1分別轉(zhuǎn)染HuR

圖3　AM281抑制了激活CB1促進(jìn)的J774A.1的遷移

Cells were pretreated with or without 10 μmol/L AM281(CB1 antagonist) for 1 h and Boyden chamber assay was performed in J774A.1 unstimulated and stimulated with 300 nmol/L ACEA. Migration values were determined by counting five fields per chamber after fixing the membrane in cold methanol and staining with hematoxyllin.**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsthe group treated with ACEA；n=3； CB1: cannabinoid receptor 1.

siRNA和對(duì)照 siRNA(陰性對(duì)照)，轉(zhuǎn)染48 h后，分別把細(xì)胞吹打下來(lái)重新接種到Boyden小室中，并在下室加入300 nmol/L ACEA進(jìn)行誘導(dǎo)遷移。遷移6 h進(jìn)行觀察拍照計(jì)數(shù)。Boyden chamber法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)在下室加入300 nmol/L的ACEA后，和對(duì)照組相比J774A.1遷移數(shù)目明顯增多。而將 HuR 敲減之后，同樣在下室加入300 nmol/L ACEA進(jìn)行誘導(dǎo)，ACEA促遷移作用明顯被抑制。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明， RNA結(jié)合蛋白HuR參與了激活CB1誘導(dǎo)的 J774A.1的遷移(圖4)。

2.5激活CB1促進(jìn)了HuR在細(xì)胞質(zhì)中的富集

為了進(jìn)一步探討HuR參與ACEA誘導(dǎo)的J774A.1遷移的可能的機(jī)制，檢測(cè)了ACEA對(duì)HuR表達(dá)的影響。Western blotting結(jié)果顯示：ACEA刺激 J774A.1 6 h后，細(xì)胞中HuR總量表達(dá)無(wú)明顯變化。這說(shuō)明激活CB1不會(huì)影響J774A.1中 HuR的表達(dá)。由于HuR主要定位在細(xì)胞核中，而發(fā)揮功能要轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，所以胞質(zhì)中HuR的富集是HuR發(fā)揮功能的先決條件。接著檢測(cè)了ACEA刺激下胞質(zhì)中HuR的變化。結(jié)果顯示：ACEA刺激能夠明顯增加胞質(zhì)中的HuR。上述結(jié)果提示激活CB1能夠促進(jìn)HuR在胞質(zhì)中的富集并發(fā)揮一定的功能(圖5)。

2.6HuR參與了ACEA誘導(dǎo)的CB1表達(dá)的上調(diào)

已經(jīng)證明了ACEA能夠促進(jìn)胞質(zhì)中HuR的富集，為了進(jìn)一步探討胞質(zhì)中HuR的富集是否影響了

圖4　HuR 參與了激活CB1誘導(dǎo)的J774A.1的遷移

J774A.1 migration stimulated with ACEA (300 nmol/L) with HuR siRNA or control siRNA was measured by Boyden chamber assay. The representative images of J774A.1 migration were revealed. Migration values were determined by counting five fields per chamber after fixing the membrane in cold methanol and staining with hematoxylin. Scale bars: 50 μm;**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsthe group treated with ACEA alone；n=3； CB1: cannabinoid receptor 1；HuR:human antigen R； SCR：scramble.

圖5　激活CB1促進(jìn)了J774A.1中HuR的富集

J774A.1 cells were treated with ACEA (300 nmol/L). Six hours later， HuR protein was evaluated by Western blotting (left). Cytoplasmic lysates were prepared and subjected to Western blotting analysis of HuR. β-tubulin served as loading controls； CB1: cannabinoid receptor 1；HuR:human antigen R.

CB1的表達(dá)，將J774A.1轉(zhuǎn)染HuR siRNA和對(duì)照siRNA，48 h后，ACEA刺激細(xì)胞24 h。轉(zhuǎn)染HuR siRNA組和對(duì)照siRNA組相比，HuR mRNA(圖6A)和蛋白質(zhì)表達(dá)(圖6B)明顯降低。這說(shuō)明HuR siRNA是非常有效的。如圖6C和圖6D，ACEA刺激后，CB1表達(dá)有所增加。但當(dāng)HuR敲減之后，ACEA引起的CB1表達(dá)的上調(diào)明顯被抑制。這提示HuR參與了ACEA誘導(dǎo)的CB1表達(dá)的上調(diào)。

3討論

巨噬細(xì)胞在固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要的作用。單核巨噬細(xì)胞被招募到炎性損傷或者感染部位對(duì)于炎性反應(yīng)和抗菌免疫反應(yīng)是非常關(guān)鍵的一步[8-9]。本課題組前期研究[10]也已經(jīng)證明，骨髓來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞可以被招募至肝臟受損部

位，并且發(fā)現(xiàn)減少骨髓來(lái)源的單核巨噬細(xì)胞在肝臟中的募集將改善肝臟的炎性反應(yīng)和纖維化。于是本研究選用小鼠單核巨噬細(xì)胞系J774A.1，利用Boyden chamber法模擬體內(nèi)巨噬細(xì)胞的遷移，并探討其遷移機(jī)制。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)主要包括：花生四烯酸乙醇胺(anandamide，AEA)和2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)及其合成酶和降解酶；兩種受體：CB1 和CB2[11]。CB2 在免疫細(xì)胞中高表達(dá)，CB1 在免疫系統(tǒng)中表達(dá)較低，因此探討CB1和炎性反應(yīng)細(xì)胞的關(guān)系也較少[12]。然而近期有文獻(xiàn)[13]報(bào)道，CB1 也可調(diào)控單核巨噬細(xì)胞功能，使用CB1受體阻斷劑明顯地阻斷巨噬細(xì)胞在粥樣斑塊中的聚集并能顯著改善動(dòng)脈粥樣硬化。本課題組研究首先明確了小鼠單核巨噬細(xì)胞系J774A.1明顯表達(dá)CB1。并且發(fā)現(xiàn)CB1激動(dòng)劑ACEA促進(jìn)J774A.1的遷移。用CB1拮抗劑AM281預(yù)處理J774A.1后，ACEA誘導(dǎo)的J774A.1的遷移活性明顯被抑制。這一結(jié)果提示激活CB1能夠促進(jìn)J774A.1的遷移。

RNA結(jié)合蛋白HuR是一種非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白，廣泛表達(dá)在各種組織和細(xì)胞中。它主要通過(guò)與靶mRNA 3’UTR結(jié)合來(lái)穩(wěn)定靶mRNA，從而調(diào)控所編碼蛋白質(zhì)的功能。HuR參與調(diào)節(jié)了慢性炎性反應(yīng)、心血管疾病和腫瘤等多種病理過(guò)程[14-15]。有文獻(xiàn)[16]報(bào)道，在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中，HuR能夠調(diào)控cox-2的表達(dá)進(jìn)一步影響細(xì)胞的遷移從而參與了血管重塑這一過(guò)程。而對(duì)于HuR參與單核巨噬細(xì)胞的遷移，

圖6　HuR參與了ACEA誘導(dǎo)的CB1表達(dá)的上調(diào)

Effects of HuR siRNA on CB1 mRNA and protein levels in J774A.1 cells stimulated with ACEA (300 nmol/L) for 24 h. mRNA (A) and Protein (B) levels of HuR were detected to confirm the efficiency of HuR knockdown. CB1 mRNA (C) and protein(D) levels were also evaluated by Real-time RT-PCR and Western blotting analysis. β-actin served as loading controls.**P<0.05vscontrol；#P<0.05vsthe group treated with ACEA alone；n=3； CB1: cannabinoid receptor 1；HuR:human antigen R； SCR：scramble.

還未有報(bào)道。為了探討HuR是否參與了ACEA誘導(dǎo)的J774A.1的遷移，將J774A.1細(xì)胞中HuR敲減。結(jié)果顯示，HuR敲減之后，ACEA誘導(dǎo)的J774A.1的遷移活性明顯下降。這一結(jié)果表明ACEA誘導(dǎo)的J774A.1的遷移依賴HuR。正常情況下，HuR主要定位于細(xì)胞核中，而發(fā)揮功能是在細(xì)胞質(zhì)中，因此， HuR的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)被認(rèn)為是HuR穩(wěn)定靶mRNA的先決條件和關(guān)鍵步驟。有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，影響HuR胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)通路主要有p38-MAPK、PKC、ERK等。本課題組研究結(jié)果顯示，CB1激動(dòng)劑ACEA能夠促進(jìn)HuR在胞質(zhì)中的富集，并且進(jìn)一步影響了CB1的表達(dá)。CB1受體是G蛋白偶聯(lián)受體。激活CB1之后是否可以激活下游信號(hào)通路從而影響HuR的出核從而調(diào)控CB1的表達(dá)從而形成一個(gè)正反饋信號(hào)通路，目前還不清楚，還需要進(jìn)一步證實(shí)。這可能是HuR參與ACEA誘導(dǎo)的J774A.1的遷移的一個(gè)非常重要的機(jī)制。但是對(duì)于HuR對(duì)于CB1表達(dá)的調(diào)控是直接關(guān)系還是間接關(guān)系，還需要進(jìn)一步的研究與探討。

本研究在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了，HuR通過(guò)調(diào)控CB1的表達(dá)介導(dǎo)了ACEA誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞系J774A.1的遷移，為CB1參與炎性反應(yīng)提供了新機(jī)制。

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編輯孫超淵

Mouse monocyte/macrophage cell line J774A.1 migration induced by the activation of CB1 depends on HuR

Zhao Zhongxin， Chang Na， Ge Jingjing， Tian Lei， Li Liying*

(DepartmentofCellBiology，SchoolofBasicMedicalSciences，MunicipalLaboratoryforLiverProtectionandRegulationofRegeneration，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of activation of CB1 on J774A.1 migration and to know whether HuR is involved in the process. MethodsImmunofluorescence and agarose gel electrophoresis were used to detect the expression of cannabinoid receptor 1 (CB1) and human antigen R (HuR). Boyden chamber was used for cell migration assay. HuR siRNA transfection was used to determine whether ACEA(CB1 agonist) induced-migration depended on HuR. In order to observe its underlying mechanisms， HuR subcellular localization was assayed by Western blotting of cellular fractions from J774A.1 stimulated with ACEA.The effects of HuR siRNA on CB1 mRNA and protein levels in J774A.1 stimulated with ACEA was assayed by Western blotting. ResultsIn this study， we present evidence that J774A.1 significantly expressed HuR and CB1； the treatment of ACEA caused a increase in J774A.1 migration(P<0.01)， and pharmacological inhibition of CB1 markedly attenuated ACEA-induced migration； ACEA-induced J774A.1 migration depended on HuR. Furthermore， we demonstrated ACEA increased HuR cytoplasmic translocation， and HuR regulated the expression of CB1. ConclusionThe activation of CB1 induces J774A.1 migration and HuR is involved in the process.

【Key words】human antigen R； cannabinoid receptor 1； cell migration

(收稿日期：2015-07-09)

【中圖分類(lèi)號(hào)】Q 7

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.015]

*Corresponding author， E-mail：liliying@ccmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81170407，31301154)， 北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IDHT20150502)。 This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81170407， 31301154)， The Project of Construction of Innovative Teams and Teacher Career Development for Universities and Colleges Under Beijing Municipality (IDHT20150502).

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-2718∶10網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1810.040.html

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