郭水龍　朱圣韜　程　芮　邵琳琳　孫秀梅　張澍田

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科 國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 首都醫(yī)科大學(xué)消化病學(xué)系 消化疾病癌前病變北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

?

miR-365通過靶向E2F2抑制胃癌細(xì)胞增生和腫瘤形成

郭水龍朱圣韜程芮邵琳琳孫秀梅張澍田*

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化內(nèi)科 國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 首都醫(yī)科大學(xué)消化病學(xué)系 消化疾病癌前病變北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

【摘要】目的研究胃癌相關(guān)miR-365調(diào)控胃癌細(xì)胞增生和腫瘤發(fā)生的功能，并通過驗(yàn)證下游靶分子E2F2研究miR-365的作用機(jī)制。方法采用Northern blotting法檢測miR-365在小鼠各組織器官中的表達(dá)譜；real-time PCR檢測miR-365在人胃癌組織中的表達(dá)變化；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)研究miR-365過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增生的抑制作用；生物信息學(xué)分析miR-365下游靶分子E2F2；構(gòu)建E2F2 3’UTR 野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體，并利用雙熒光素酶活性分析檢測miR-365對E2F2基因表達(dá)的調(diào)控和結(jié)合位點(diǎn)；Western blotting法檢測miR-365對E2F2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。 結(jié)果miR-365在包括胃在內(nèi)的多種消化道組織中表達(dá)； miR-365在人胃癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)；miR-365過表達(dá)顯著抑制多種胃癌細(xì)胞的增生和裸鼠皮下的成瘤能力；E2F2是miR-365的靶分子，miR-365通過E2F2 3’UTR上的結(jié)合位點(diǎn)抑制E2F2的蛋白表達(dá)。結(jié)論miR-365 在人胃癌組織和小鼠胃癌模型中表達(dá)下調(diào)，并通過下游靶分子E2F2抑制胃癌細(xì)胞增生和腫瘤形成。

【關(guān)鍵詞】E2F2；miR-365；胃癌；microRNA

胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤，名列全球第二大癌癥死亡原因[1]。我國是胃癌高發(fā)國，每年新發(fā)胃癌患者40萬人，發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居首位，死亡人數(shù)達(dá)30萬，約占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的25%～30%[2]。miR-365作為一種抑癌miRNA，廣泛參與多種消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3-5]。E2F家族是調(diào)控細(xì)胞周期與凋亡的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與各種組織和器官的腫瘤發(fā)生過程[6]。在消化系統(tǒng)腫瘤中，目前對E2F1研究較多，其作為抑癌基因在食管癌、胃癌和結(jié)直腸癌中具有重要的診斷價(jià)值[7]。目前對E2F2在消化道腫瘤中的功能研究主要集中在結(jié)直腸癌，其在胃癌發(fā)生中的功能機(jī)制仍不清楚。本研究從多個(gè)方面證實(shí)miR-365可靶向抑制E2F2表達(dá)，并抑制胃癌細(xì)胞增生和腫瘤形成，揭示了胃癌發(fā)生、發(fā)展的新的調(diào)控機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

miR-365 Luciferase報(bào)告載體pGL3-CM 由pGL3-control改構(gòu)而成。AGS、BGC-823、SGC-7901和Ges-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。E2F2抗體購自英國Abcam公司。GAPDH抗體和二抗購自中杉金橋公司。各種限制性內(nèi)切酶和T4多聚核苷酸激酶購自美國NEB公司。Taqman miRNA real-time試劑盒購自美國ABI公司。 miRNA mimic和ASO及相應(yīng)對照合成自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；引物和探針合成自美國Invitrogen公司。質(zhì)粒抽提及凝膠回收試劑盒購自德國Qiagen公司，轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國Promega公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。人胃癌標(biāo)本購自鄭州大學(xué)附屬河南腫瘤醫(yī)院腫瘤組織標(biāo)本庫。所有腫瘤標(biāo)本已經(jīng)組織學(xué)鑒定，標(biāo)本取得后迅速置于液氮中至RNA和蛋白提取。普通小鼠和裸鼠來自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK(京)2012-0023。

1.2方法

1.2.1Northern blotting法檢測小鼠各器官組織中miR-365的表達(dá)

小鼠處死后，提取各器官組織總RNA，根據(jù)文獻(xiàn)[8]描述方法進(jìn)行Northern blotting檢測。具體步驟為：25 μg RNA經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、固定和預(yù)雜交后，與p32標(biāo)記的 miR-365或U6特異探針室溫雜交過夜，經(jīng)洗膜后壓片顯影。

1.2.2人胃腺癌組織中檢測miR-365的表達(dá)

使用ABI公司的Taqman試劑盒進(jìn)行miRNA的定量檢測，具體方法是Trizol法提取人胃癌組織中總RNA，經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)后，依據(jù)說明書進(jìn)行Real-time PCR。

1.2.3細(xì)胞增生檢測

2×104細(xì)胞/孔接種到24孔板中，培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miRNA mimic或ASO濃度為50 nmol/L。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染72 h后，去除上清，胰蛋白酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化。加入臺盼藍(lán)染液標(biāo)記死亡細(xì)胞，光鏡下對活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.4裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)增長期的1×106個(gè)對照細(xì)胞或miR-365穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BGC-823細(xì)胞分別注射到8只雌性裸鼠(4～5周)的左右背部皮下。飼養(yǎng)4周后處死裸鼠，分離背部皮下腫瘤組織，分別測量左右兩側(cè)腫瘤組織的質(zhì)量。

1.2.5miR-365靶向E2F2的生物信息學(xué)預(yù)測

使用microRNA在線靶點(diǎn)分析工具TargetScan(www.targetscan.org)分析人E2F2基因3’UTR。1.2.6熒光素酶活性分析檢測miR-365對E2F2的靶向作用

使用上下游引物5′-CCGCTCGAGTTTTCTTTAGGGACCAGG-3′和5′-CCGACGCGTGCAGTTTAATGTTTAATGCC-3′ 擴(kuò)增人E2F2基因的3’UTR序列，并克隆到 pGL3-CM質(zhì)粒構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體(野生型)。采用引物5′-CCGGAATTCAATTTTTCAGTGTAGTTTGTTGTT-3′ 和5′-CCGACGCGTCCTCCTTGTATTGAGATAATTG-3′將E2F2 3’UTR的 miR-365潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體(突變型)。將報(bào)告載體與miR-365過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h后裂解細(xì)胞，根據(jù)試劑說明書進(jìn)行檢測。檢測儀器為LB 960 Centro XS3 Luminometer。

1.2.7Western blotting蛋白檢測

使用RIPA裂解細(xì)胞提取蛋白并檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為25 μg到50 μg。半干法轉(zhuǎn)膜，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶封閉，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，HRP偶聯(lián)二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 miR-365在小鼠胃及其他組織中特異表達(dá)

Northern blotting檢測結(jié)果顯示，miR-365在包括胃在內(nèi)的多種組織中表達(dá)，尤其在胃腸道系統(tǒng)中的胃、食管、小腸和結(jié)腸中都有表達(dá)，提示miR-365可能在這些組織中具有重要的生理功能(圖1)。

圖1　Northern blotting 檢測miR-365在小鼠組織中的表達(dá)譜

2.2人胃腺癌組織中miR-365表達(dá)顯著下調(diào)

Real-time PCR結(jié)果顯示，與對應(yīng)的癌旁正常組織相比，28例人胃癌組織中，20例明顯下調(diào)，下調(diào)的比例達(dá)到71%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，人胃癌組織中miR-365的平均表達(dá)水平只相當(dāng)于正常胃組織中的38% (P<0.001，圖2)。這一結(jié)果表明，miR-365的下調(diào)在人胃癌中較為常見，提示其下調(diào)可能與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

圖2　miR-365在人胃癌組織中表達(dá)檢測

2.3過表達(dá)miR-365抑制胃癌細(xì)胞增生

在3種胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC-823、SGC-7901和1種胃上皮正常細(xì)胞系GES-1中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-365 mimics，72 h后，與對照組(NC)相比，miR-365過表達(dá)明顯抑制4種細(xì)胞系的細(xì)胞增生，抑制率達(dá)35%～50%(P<0.01，圖3)。

2.4過表達(dá)miR-365抑制胃癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤

裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，右側(cè)miR-365過表達(dá)組的腫瘤明顯小于左側(cè)對照細(xì)胞組，證明miR-365可顯著抑制胃癌細(xì)胞的成瘤能力(P<0.01，圖4)。

圖3　miR-365過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增生

**P<0.01vsNC group； NC:normal control.

圖4　miR-365過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的成瘤性

2.5miR-365直接靶向人E2F2基因3’UTR，抑制人E2F2基因的表達(dá)

如圖5所示，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在人E2F2基因mRNA 3’UTR上存在1處miR-365潛在結(jié)合位點(diǎn)，提示miR-365與E2F2之間存在可能的靶向關(guān)系。進(jìn)一步的熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示， miR-365過表達(dá)可以明顯抑制E2F2 3’UTR報(bào)告載體的熒光素酶活性，約為對照組的60%(P<0.01)，表明miR-365通過結(jié)合3’UTR區(qū)可抑制E2F2基因的表達(dá)。將預(yù)測的miR-365結(jié)合位點(diǎn)突變，可顯著消除miR-365過表達(dá)導(dǎo)致的熒光素酶活性降低 (P>0.05，圖6)。

圖5　人E2F2 3’UTR 上miR-365結(jié)合位點(diǎn)分析

圖6　熒光素酶活性分析檢測各組報(bào)告載體表達(dá)

*P<0.01vsNC group； NC:normal control.

2.6miR-365抑制E2F2蛋白表達(dá)

Western blotting檢測結(jié)果顯示，在胃癌細(xì)胞AGS中過表達(dá)miR-365， E2F2的蛋白表達(dá)水平明顯下降，而用ASO敲低BGC-823細(xì)胞內(nèi)源性的miR-365水平后，E2F2表達(dá)明顯上調(diào)(圖7)。此外，與野生型小鼠相比，在pten基因特異敲除的小鼠胃癌組織中，miR-365表達(dá)下調(diào)，同時(shí)E2F2蛋白表達(dá)水平顯著上升(圖8)。這些結(jié)果表明，miR-365負(fù)向調(diào)節(jié)E2F2的蛋白表達(dá)，E2F2可能是miR-365的直接靶基因。

圖7　Western blotting檢測各組細(xì)胞E2F2蛋白表達(dá)

圖8　PTEN基因敲除小鼠(PTENfl/fl)胃癌組織中

3討論

MicroRNA (miRNA)是一類22bp左右的非編碼小RNA，通過序列互補(bǔ)與特異mRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并在腫瘤診斷和治療方面具有很大的應(yīng)用前景[9-10]。大量研究[11-14]結(jié)果顯示，miR-365在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，并通過不同靶分子促進(jìn)腫瘤的增生和遷移。筆者的表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-365在多種小鼠消化道組織中高表達(dá)，提示其可能在消化道腫瘤中發(fā)揮了重要作用。而研究結(jié)果表明，miR-365的確在人胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，并通過其新的靶分子E2F2促進(jìn)胃癌細(xì)胞增生和腫瘤形成。E2F2是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，其主要以細(xì)胞周期依賴性的模式與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRB結(jié)合，調(diào)控下游細(xì)胞周期與增生相關(guān)蛋白的表達(dá)[15]。最新的研究[16]結(jié)果顯示，E2F1和E2F2共同與P53蛋白維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，其失衡將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。筆者與國外課題組的前期研究[5， 17-19]結(jié)果顯示，miR-365主要通過調(diào)控細(xì)胞周期抑制腫瘤細(xì)胞增生，其主要靶分子為cyclin D1和CDK4/6，而E2F家族則是cyclin D1和CDK4/6下游重要的轉(zhuǎn)錄因子。新靶分子E2F2的發(fā)現(xiàn)，不僅使得miR-365調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加完善和精確，也提示該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

隨著個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療的興起，國內(nèi)外研究者都在開發(fā)新的胃癌早期診斷標(biāo)志物和藥物作用靶點(diǎn)，而miRNA和周期調(diào)控蛋白是其中的兩大熱點(diǎn)[15， 20-23]。本研究的結(jié)果為胃癌早期篩查和治療提供了新的潛在靶分子，并為下一步的臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

4參考文獻(xiàn)

[1]Kamangar F， Dores G M， Anderson W F. Patterns of cancer incidence， mortality， and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world[J]. J Clin Oncol， 2006， 24(14): 2137-2150.

[2]Yang L. Incidence and mortality of gastric cancer in China[J]. World J Gastroenterol， 2006， 12(1): 17-20.

[3]Guo S L， Ye H， Teng Y， et al. Akt-p53-miR-365-cyclin D1/cdc25A axis contributes to gastric tumorigenesis induced by PTEN deficiency[J]. Nat Commun， 2013， 4: 2544.

[4]Zhou X， Xu X， Wang J， et al. Identifying miRNA/mRNA negative regulation pairs in colorectal cancer[J]. Sci Rep， 2015， 5: 12995.

[5]Nie J， Liu L， Zheng W， et al. microRNA-365， down-regulated in colon cancer， inhibits cell cycle progression and promotes apoptosis of colon cancer cells by probably targeting Cyclin D1 and Bcl-2[J]. Carcinogenesis， 2012， 33(1): 220-225.

[6]Indovina P， Pentimalli F， Casini N， et al. RB1 dual role in proliferation and apoptosis: cell fate control and implications for cancer therapy[J]. Oncotarget， 2015， 6(20): 17873-17890.

[7]Xanthoulis A， Tiniakos D G. E2F transcription factors and digestive system malignancies: how much do we know?[J]. World J Gastroenterol， 2013， 19(21): 3189-3198.

[8]Sun Q， Zhang Y， Yang G， et al. Transforming growth factor-beta-regulated miR-24 promotes skeletal muscle differentiation[J]. Nucleic Acids Res， 2008， 36(8): 2690-2699.

[9]Liu J， Zhang L， Lei J， et al. MicroRNA-responsive cancer cell imaging and therapy with functionalized gold nanoprobe[J]. ACS Appl Mater Interfaces， 2015， 7(34): 19016-19023.

[10]Zhang Z， Li Z， Li Y， et al. MicroRNA and signaling pathways in gastric cancer[J]. Cancer Gene Ther， 2014， 21(8): 305-316.

[11]Bai J， Zhang Z， Li X， et al. MicroRNA-365 inhibits growth， invasion and metastasis of malignant melanoma by targeting NRP1 expression[J]. Cancer Biomark， 2015， 15(5): 599-608.

[12]Bai J， Zhang Z， Li X， et al. MicroRNA-365 inhibits growth， invasion and metastasis of malignant melanoma by targeting NRP1 expression[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2015， 8(5): 4913-4922.

[13]Chen Z， Huang Z， Ye Q， et al. Prognostic significance and anti-proliferation effect of microRNA-365 in hepatocellular carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2015， 8(2): 1705-1711.

[14]Kang S M， Lee H J， Cho J Y. MicroRNA-365 regulates NKX2-1， a key mediator of lung cancer[J]. Cancer Lett， 2013， 335(2): 487-494.

[15]Evangelou K， Havaki S， Kotsinas A. E2F transcription factors and digestive system malignancies: how much do we know?[J]. World J Gastroenterol， 2014， 20(29): 10212-10216.

[16]Iglesias-Ara A，Zenarruzabeitia O， Buelta L， et al. E2F1 and E2F2 prevent replicative stress and subsequent p53-dependent organ involution[J]. Cell Death Differ， 2015， 22(10): 1577-1589.

[17]Zhang P， Zheng C， Ye H， et al. MicroRNA-365 inhibits vascular smooth muscle cell proliferation through targeting cyclin D1[J]. Int J Med Sci， 2014， 11(8): 765-770.

[18]Zhou L， Wang Y， Ou C， et al. microRNA-365-targeted nuclear factor I/B transcriptionally represses cyclin-dependent kinase 6 and 4 to inhibit the progression of cutaneous squamous cell carcinoma[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2015， 65: 182-191.

[19]Guo S L， Ye H， Teng Y， et al. Akt-p53-miR-365-cyclin D1/cdc25A axis contributes to gastric tumorigenesis induced by PTEN deficiency[J]. Nat Commun， 2013， 4: 2544.

[20]Tong F， Cao P， Yin Y， et al. MicroRNAs in gastric cancer: from benchtop to bedside[J]. Dig Dis Sci， 2014， 59(1): 24-30.

[21]Kanat O， O’Neil B， Shahda S. Targeted therapy for advanced gastric cancer: A review of current status and future prospects[J]. World J Gastrointest Oncol， 2015， 7(12): 401-410.

[22]李龍,李靜,黃東蘭,等. 胃癌患病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)鍵基因篩選[J]. 中華腫瘤防治雜志，2014，21(2)：95-99.

[23]李立平,吳煒景,趙亞剛. microRNA與胃癌的研究進(jìn)展[J]. 中華腫瘤防治雜志. 2013,20(4):312-316.

編輯陳瑞芳

miR-365 inhibited the proliferation and tumorigenicity of gastric cancer cells by targeting E2F2

Guo Shuilong， Zhu Shengtao， Cheng Rui， Shao Linlin， Sun Xiumei， Zhang Shutian*

(DepartmentofGastroenterology，BeijingFriendshipHospital，CapitalMedicalUniversity;NationalClinicalResearchCenterforDigestiveDiseases;FacultyofGastroenterologyofCapitalMedicalUniversity;BeijingKeyLaboratoryforPrecancerousLesionofDigestiveDiseases，Beijing100050，China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the regulatory role of miR-365 on proliferation and tumorigenicity of gastric cancer cells， and explore the functional mechanism of miR-365 by verifying its target molecule E2F2 protein. MethodsThe expression profile of miR-365 in mouse tissues was checked by Northern blotting. The expression of miR-365 in human gastric cancer tissues was detected by Real-Time PCR. The regulatory role of miR-365 on gastric cancer cell proliferation and tumorigenicity were explored with cells experiment and nude mouse tumorigenicity assay; The potential binding site of miR-365 in the E2F2 3′ untranslated region (3′UTR) was predicted with the bioinformatic tools; The luciferase report plasmids containing the wild type and mutated binding site of E2F2 3′UTR were constructed， and were used to study the regulation mechanism and identify the binding sites of miR-365 by luciferase activity analysis; The regulation effect of miR-365 on E2F2 protein expression was checked by Western blotting. Results The specific expression of miR-365 was detected in various digestive tissues including stomach; miR-365 was down-regulated in human gastric cancer tissues; miR-365 inhibited the expression of E2F2 protein by recognizing the specific binding site on the 3′UTR of E2F2 mRNA. ConclusionmiR-365 was down-regulated in gastric cancer tissues of human and mouse model， and suppressed the proliferation and tumorigenicity of gastric cancer cells by inhibiting the expression of E2F2.

【Key words】E2F2; miR-365; gastric cancer; microRNA

(收稿日期：2015-12-25)

【中圖分類號】R 735.2

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.001]

*Corresponding author， E-mail：zhangshutian@ccmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81302160， 81272447)，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心基金(2015BAI13B09)，北京市自然科學(xué)基金(7152043)。 This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81302160， 81272447)， National Clinical Research Center for Digestive Diseases (2015BAI13B09)， Natural Science Foundation of Beijing (7152043).

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-2714∶37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1437.002.html

· 消化系統(tǒng)重大疾病的全鏈條研究 ·