姜文靜，張忠獻(xiàn)，王堯河，石海亮，趙瑞華，宗　紅#，曹風(fēng)雨#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052　2)鄭州大學(xué)中英分子腫瘤學(xué)研究中心 鄭州 450052

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腹水來(lái)源胃癌原代細(xì)胞的建立及鑒定*

姜文靜1)，張忠獻(xiàn)2)，王堯河2)，石海亮2)，趙瑞華1)，宗紅1)#，曹風(fēng)雨2)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 4500522)鄭州大學(xué)中英分子腫瘤學(xué)研究中心 鄭州 450052

摘要目的：以胃癌患者腹水來(lái)源的胃癌細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探索出一種相對(duì)成熟的腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)及鑒定方法。方法：對(duì)腹水來(lái)源胃癌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，通過(guò)低濃度胰蛋白酶消化法及差速貼壁法進(jìn)行原代細(xì)胞純化，獲得能夠穩(wěn)定傳代的胃癌轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞系，并通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)、免疫熒光檢測(cè)、繪制細(xì)胞增殖曲線、構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果：獲得1例能夠穩(wěn)定傳代的腹水來(lái)源胃腺癌細(xì)胞株(命名為CFJ)，細(xì)胞形態(tài)一致，表達(dá)上皮性生物標(biāo)志物，細(xì)胞核呈現(xiàn)明顯的異型性，能在裸鼠皮下成功構(gòu)建移植瘤模型，增殖和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，可見(jiàn)裸鼠縱隔、腋窩等多處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)論：胃癌轉(zhuǎn)移性腹水可以成為建立原代腫瘤細(xì)胞的很好來(lái)源。

胃癌是全球人口的第三大惡性腫瘤死亡原因[1]。胃癌在中國(guó)的發(fā)病率及病死率仍穩(wěn)居所有腫瘤的第2位[2]，5 a生存率也只有大約20%[3]。許多經(jīng)過(guò)胃根治性切除手術(shù)的胃癌患者依舊會(huì)發(fā)生腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。其中，腹膜轉(zhuǎn)移就是最常見(jiàn)的胃癌根治性手術(shù)患者治療失敗的原因，占總復(fù)發(fā)率的20.0%～53.5%[4-6]。胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者都會(huì)產(chǎn)生惡性腹水。原代細(xì)胞培養(yǎng)就是將取得的腫瘤組織或細(xì)胞在體外進(jìn)行首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時(shí)間短，性狀與體內(nèi)相似，為腫瘤的研究提供了一個(gè)有效平臺(tái)。然而，手術(shù)標(biāo)本獲取不易，而且許多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期，喪失了手術(shù)治療的時(shí)機(jī)，使得通過(guò)原發(fā)腫瘤進(jìn)行原代培養(yǎng)獲取腫瘤細(xì)胞株變得比較困難。而獲得進(jìn)展期胃癌患者的腹水相對(duì)容易，給患者帶來(lái)的痛苦更小，可以成為建立原代腫瘤細(xì)胞很好的來(lái)源。由此，作者選擇腹水來(lái)源胃癌細(xì)胞為研究對(duì)象，獲得1例能夠穩(wěn)定傳代的胃癌轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞株，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus Optical 公司)，超凈工作臺(tái)(德國(guó)Thermo公司)，低速離心機(jī)(德國(guó)Thermo公司)，RTCA細(xì)胞功能分析儀(杭州ACEA公司)，DMEM/F12+GlutaMAXTM-1細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)，Matrigel(美國(guó)Gibco公司)。4～5周的BALB/c(nu/nu)雌性裸鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2腹水來(lái)源胃癌患者細(xì)胞的分離及培養(yǎng)胃癌患者腹水的搜集獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。用離心管收集腹膜轉(zhuǎn)移進(jìn)展期胃癌患者的新鮮腹水100～200 mL，1 000 r/min離心5 min后棄上清(血性腹水視情況于離心管中加入適量肝素抗凝)。用含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(加入氫化可的松、上皮生長(zhǎng)因子)重懸沉淀后轉(zhuǎn)入底面積為25～75 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3純化方法原代培養(yǎng)非常容易受到成纖維細(xì)胞的污染，而腹水中除了成纖維細(xì)胞外，往往混有大量脫落的間皮細(xì)胞，為腹水來(lái)源的腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)帶來(lái)嚴(yán)重的干擾，需及時(shí)清除[7-9]，可采用差速貼壁法和低濃度胰蛋白酶消化法。

1.3.1差速貼壁法根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，把含有混合細(xì)胞的細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃培養(yǎng)箱靜置30 min后，取出上清置于另一個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)[10]。當(dāng)混雜細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到一定數(shù)量后，消化傳代時(shí)再重復(fù)差速貼壁。

1.3.2低濃度胰蛋白酶消化法 選擇低濃度的胰蛋白酶消化，在倒置顯微鏡下觀察并輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，當(dāng)大多數(shù)成纖維細(xì)胞脫落而腫瘤細(xì)胞克隆未脫落的時(shí)候立即終止消化，去上清，加條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)[10]。

1.4純化腫瘤細(xì)胞的鑒定

1.4.1免疫熒光檢測(cè)采用免疫熒光檢測(cè)方法測(cè)定純化細(xì)胞CFJ中特異性的生物標(biāo)志物的表達(dá)。細(xì)胞角蛋白(CK)是上皮細(xì)胞最常見(jiàn)標(biāo)記物，但是部分間皮細(xì)胞CK也可以呈陽(yáng)性表達(dá)。而癌細(xì)胞只表達(dá)CK，抗鈣視網(wǎng)膜蛋白(CR)表達(dá)為陰性。

于24孔板中培養(yǎng)CFJ至80%融合；PBS洗2次，5 min/次；后用40 g/L多聚甲醛固定細(xì)胞15 min；PBS洗2次，5 min/次；加入100 μL體積分?jǐn)?shù)0.25%的Triton X-100，室溫放置5 min；PBS洗2次，5 min/次；一抗室溫孵育2 h；PBS洗3次，5 min/次；加入TRITC標(biāo)記的熒光二抗100 μL，室溫避光孵育1 h；PBS洗3次， 5 min/次；加入含有DAPI的封片液100 μL/孔，置于倒置顯微鏡下觀察。即用型鼠單抗CK和兔單抗CR均購(gòu)于上海杰浩生物技術(shù)有限公司，熒光二抗山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔IgG購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

1.4.2細(xì)胞形態(tài)觀察將培養(yǎng)不同階段的細(xì)胞于倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.4.3細(xì)胞增殖、遷移實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：首先制備CFJ細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為5×104mL-1。在96孔培養(yǎng)板中加入50 μL培養(yǎng)基(共4個(gè)復(fù)孔)，將其放到RTCA細(xì)胞功能分析儀上，經(jīng)過(guò)RTCA系統(tǒng)自動(dòng)掃描和基線檢測(cè)，保證所有孔的細(xì)胞指數(shù)低于0.063。取出96孔板，在孔中加入100 μL混合均勻的CFJ細(xì)胞懸液，放回培養(yǎng)箱中的RTCA細(xì)胞功能分析儀上，系統(tǒng)將定時(shí)自動(dòng)掃描檢測(cè)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：首先進(jìn)行CIM-Plate遷移浸潤(rùn)檢測(cè)板裝配[下室的孔中加入165 μL培養(yǎng)基，CFJ細(xì)胞陰性對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，CFJ細(xì)胞組及A549細(xì)胞組(陽(yáng)性對(duì)照)加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清培養(yǎng)基，在上室中加入30 μL無(wú)血清培養(yǎng)基]，制備CFJ與A549細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為4×105mL-1。向CIM-Plate上室加入100 μL細(xì)胞懸液，室溫靜置30 min待細(xì)胞沉降后放回RTCA儀的檢測(cè)臺(tái)，進(jìn)行細(xì)胞遷移的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，自動(dòng)繪制細(xì)胞遷移曲線。

2結(jié)果

2.1患者病例資料患者，男，63歲，河南省南陽(yáng)市人。(胃底)腺癌，Lauren分型為混合型。腹腔穿刺腹水細(xì)胞病理學(xué)檢查結(jié)果：發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，傾向腺癌。腹水離心沉渣涂片鏡下見(jiàn)少量團(tuán)狀排列的核大深染細(xì)胞，并見(jiàn)中等量間皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(圖1)。

2.2細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。其中圖2A為純化前的原代細(xì)胞，鏡下觀察可見(jiàn)較多貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，但細(xì)胞大小、形態(tài)差異明顯，為不同種類細(xì)胞的混合生長(zhǎng)；圖2B為通過(guò)低濃度胰蛋白酶消化法純化后的細(xì)胞，大部分成纖維細(xì)胞已經(jīng)脫落，鏡下可觀察到上皮性細(xì)胞克隆，細(xì)胞折光性強(qiáng)，飽滿、立體感強(qiáng)；圖2C為純化后擴(kuò)增的上皮性細(xì)胞克隆，細(xì)胞形態(tài)一致，折光性強(qiáng)，飽滿、立體感強(qiáng)。純化細(xì)胞無(wú)細(xì)菌、真菌及支原體污染。

圖1　患者腹水HE染色發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞(×200)

A：純化前的原代細(xì)胞(×100)；B：通過(guò)低濃度胰蛋白酶消化法純化后的細(xì)胞(×100)；C：純化后擴(kuò)增的上皮性細(xì)胞克隆(×200)。圖2　原代培養(yǎng)不同階段的細(xì)胞形態(tài)

2.3免疫熒光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。純化過(guò)的細(xì)胞CK呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而CR不表達(dá)，證實(shí)為上皮來(lái)源的癌細(xì)胞。

A、B：CK呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；C、D：CR不表達(dá)。圖3　CFJ的免疫熒光染色結(jié)果(×200)

2.4CFJ細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CFJ體外增殖能力強(qiáng)，但遷移能力較弱,見(jiàn)圖4。

左：CFJ細(xì)胞的增殖曲線；右：CFJ細(xì)胞的遷移曲線。圖4　CFJ細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5裸鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型構(gòu)建成功，細(xì)胞佐以Matrigel時(shí)成瘤率可達(dá)100%。長(zhǎng)時(shí)間觀察可見(jiàn)裸鼠腋窩、縱隔等多處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，見(jiàn)圖5。裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖6。

A：該患者原發(fā)腫瘤組織HE染色，可見(jiàn)到呈腺樣排列的癌組織(×100)；B：裸鼠皮下移植瘤HE染色，1為裸鼠表皮，2為癌組織，3為毛囊和皮脂腺，癌組織呈腺樣及實(shí)體狀排列(×100)；C：裸鼠皮下移植瘤瘤體HE染色，箭頭示癌細(xì)胞病理性核分裂像(×400)；D：裸鼠縱隔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)HE染色，1為轉(zhuǎn)移癌，2為殘余淋巴組織(×100)； E：CFJ細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤。圖5　患者原發(fā)腫瘤及裸鼠皮下移植瘤模型

圖6　裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)曲線

3討論

胃癌的發(fā)病率和病死率均較高，由于大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已發(fā)展為局部晚期或已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，因此平均生存時(shí)間很少超過(guò)12個(gè)月，5 a生存率小于7%[11]。近20 a來(lái)胃癌診斷、治療等方面取得了較大進(jìn)展，但胃癌患者的總體預(yù)后仍不理想[12]。

該研究對(duì)腹水來(lái)源胃癌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，通過(guò)低濃度胰蛋白酶消化法及差速貼壁法進(jìn)行原代細(xì)胞純化，獲得能夠穩(wěn)定傳代的胃癌轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞系。并通過(guò)免疫熒光檢測(cè)、繪制細(xì)胞增殖曲線、構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，逐步找到一種相對(duì)成熟的腹水來(lái)源胃癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定方法，成功獲得1例能夠穩(wěn)定傳代的腹水胃腺癌細(xì)胞株CFJ。該胃癌細(xì)胞能在裸鼠皮下構(gòu)建移植瘤模型，腫瘤細(xì)胞在裸鼠皮下生長(zhǎng)迅速，并可見(jiàn)腋窩、縱隔等多處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶，證明該細(xì)胞在體內(nèi)有較強(qiáng)的增殖和遷移、轉(zhuǎn)移能力。體外遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果卻顯示其遷移能力很弱，體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的差異，提示應(yīng)改進(jìn)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。對(duì)此作者將結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)，希望可以發(fā)現(xiàn)分子傳導(dǎo)信號(hào)關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步解釋這種差異的原因。

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(2016-03-03收稿責(zé)任編輯姜春霞)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.016

#通信作者：宗紅，女，1968年4月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤，E-mail：zonghong522@126.com；曹風(fēng)雨，女，1976年12月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤基因治療，E-mail：9175539@qq.com

中圖分類號(hào)R73-3

關(guān)鍵詞腹水；胃癌；原代培養(yǎng)；轉(zhuǎn)化；成瘤

Primary cell culture and identification of ascites-derived gastric cancer cells

JIANG Wenjing1)，ZHANG Zhongxian2)，WANG Yaohe2)，SHI Hailiang2)，ZHAO Ruihua1)，ZONG Hong1)，CAO Fengyu2)

1)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500522)Sino-BritishResearchCenterforMolecularOncology,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsascites;gastric cancer;primary cell culture;transformation;tumourgenesis

AbstractAim: To develop an optimal system for primary cell culture and identification technique with the ascites-derived gastric cancer cells as the research object.Methods: The ascites-derived gastric cancer cells were cultured and purified through the combination of digestion with low concentration trypsin and differential attachment. And the cell morphology was observed by HE and immunocytochemical staining.The cellular proliferation was detected. The tumor growth of established cell line in vivo was also investigated by the subcutaneous transplantation in nude mice model.Results: An ascites-derived gastric adenocarcinoma cell line(named as CFJ) that could passage steadily had been successfully developed. The cells were consistent in morphology with obvious atypia nuclei and with cytoplasm expressing epithelial biomarkers. Furthermore, it succeeded in establishing the subcutaneous transplantation model in nude mice, and found the cells could locally metastasize to the lymph nodes of mediastinum and axilla in the mice.Conclusion: Metastatic ascites of gastric cancer patients could be a good source of the primary cell culture.

*國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目81272525；鄭州市科學(xué)技術(shù)局科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目131PCXTD633；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目201202001