王建昌，　王金鳳，　李　靜，　孫曉霞，　陳瑞春（河北省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北石家莊050051）

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基于內(nèi)參的志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測

王建昌，王金鳳，李靜，孫曉霞，陳瑞春*
（河北省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北石家莊050051）

摘要：根據(jù)Genbank已公布的志賀氏菌基因組序列，篩選特異性靶基因ipaH，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，并在體系中加入內(nèi)參（IAC），通過標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的TaqMan探針來監(jiān)測IAC，進(jìn)而實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR反應(yīng)過程。按照人工污染樣品，以評價(jià)所建立反應(yīng)體系的性能。以志賀氏菌基因組DNA為模板，最低檢測限為1 pg/uL；以10倍梯度稀釋的菌液用水煮法提取DNA為模板，最低檢測限為9×103CFU/mL；以含有ipaH的質(zhì)粒為模板，最低檢測限可以達(dá)到103考貝/uL；建立ipaH和ipaH-IAC標(biāo)準(zhǔn)曲線，Ct值與模板拷貝數(shù)均呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999）；人工污染初始菌量為10 CFU/25 g羊肉時(shí)，志賀氏菌在增菌6 h后即可檢出（水洗加試劑盒法）。作者建立的ipaH-IAC實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，既能有效檢測食品中志賀氏菌，又能實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)過程，有效防止"假陰性"的發(fā)生，進(jìn)一步保證了結(jié)果的可靠性，有利于實(shí)現(xiàn)樣品中志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化。

關(guān)鍵詞：志賀氏菌；ipaH；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；內(nèi)參

志賀氏菌（Shigella）是引起人類細(xì)菌性痢疾的主要病原菌，通稱痢疾桿菌，為兼性厭氧菌，按照抗原結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)的不同分為痢疾（A群）、福氏（B群）、鮑氏（C群）和宋內(nèi)氏（D群）志賀氏菌。該菌可引起食源性暴發(fā)，臨床表現(xiàn)通常為帶血腹瀉，在發(fā)達(dá)國家志賀氏菌感染主要為D群，而在我國流行菌株則以B群為主[1-4]。志賀氏菌引起痢疾的傳染源主要為病人和帶菌者，主要是通過污染了志賀氏菌的食物、飲水等經(jīng)口感染，具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[5]。全世界每年志賀氏菌污染食品引起的發(fā)病數(shù)超過2億，其中死亡人數(shù)達(dá)65萬[6]。據(jù)報(bào)道，在美國志賀氏菌是繼1997年沙門氏菌和空腸彎曲桿菌之后的引起食源性疾病的主要病因[7]，尤其兒童易引起感染性腹瀉[8-9]。

目前志賀氏菌常規(guī)檢測方法是生化檢測方法GB 4789.5-2012，首先對樣品進(jìn)行增菌，分離培養(yǎng)，通過生化反應(yīng)、溶血試驗(yàn)以及協(xié)同溶血試驗(yàn)對可以菌落進(jìn)行鑒定分析，如果確定為志賀氏菌則要進(jìn)行進(jìn)一步血清型試驗(yàn)。該檢驗(yàn)步驟繁瑣、耗時(shí)長、準(zhǔn)確性低，且一次檢測的樣品數(shù)較少。免疫學(xué)方法檢測相對常規(guī)方法具有靈敏度提高，操作簡便。鐘青萍等[10]建立了雙抗夾心ELISA法檢測志賀氏菌，對37℃、1 h純培養(yǎng)的菌液檢出限為105CFU/mL，但ELISA由于實(shí)驗(yàn)影響因素較多，會(huì)引起假陽性，需要其他方法輔助檢測。分子檢測方法的建立，給致病菌的檢測提供了一個(gè)快捷、高效、靈敏的檢測平臺。Kenia[11]建立了以志賀氏菌ipaH基因?yàn)闄z測靶點(diǎn)的具有擴(kuò)增內(nèi)參的多重PCR方法，該檢測方法的檢測限為104 CFU/mL。Barletta[12]以志賀氏菌ipaH、沙門氏菌invA、空腸彎曲菌16S rRNA基因建立多重RT-PCR方法，檢測限為103CFU/g，而在臨床糞便樣品中的檢測線為104CFU/g。上述PCR方法多數(shù)僅對純培養(yǎng)的志賀氏菌進(jìn)行了分析，而未對增菌后的樣品提取核酸進(jìn)行研究評估。在PCR檢測方法的實(shí)際應(yīng)用中，部分樣品基質(zhì)復(fù)雜，存在大量未知的復(fù)雜成分，可能會(huì)存在影響PCR擴(kuò)增的物質(zhì)，同時(shí)核酸提取過程中殘留的物質(zhì)也可能導(dǎo)致PCR擴(kuò)增的抑制，從而出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果或定量值較低。

作者所建立的志賀氏菌檢測方法是一種基于內(nèi)參（Internal Amplification Control，IAC）的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，在反應(yīng)體系中添加IAC以對整個(gè)反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，從而有效的防止“假陰性”結(jié)果的產(chǎn)生，并通過水煮法和商業(yè)化試劑盒法對增菌后樣品提取核酸進(jìn)行靶基因檢測，均取得了良好的檢測結(jié)果，同時(shí)有效推動(dòng)了志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用菌株

實(shí)驗(yàn)所用菌株見表1。

1.2主要試劑和儀器

木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂，志賀氏菌增菌肉湯：北京陸橋公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒：2×Taq PCR Master Mix，天根生化科技公司產(chǎn)品；Premix Ex Taq，pMD○R 19 -T Simple Vector：TaKaRa公司產(chǎn)品；核酸蛋白分析儀：Eppendorf公司產(chǎn)品；PCR儀：TECHNE公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：ABI公司產(chǎn)品。

1.3引物和探針的設(shè)計(jì)

通過查找相關(guān)文獻(xiàn)[9，13]，選擇ipaH作為志賀氏菌檢測靶基因。從GeneBank中下載ipaH靶序列，應(yīng)用DNAstar軟件對下載的多個(gè)靶序列進(jìn)行比對，查找保守序列。用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)引物和探針，用BLAST工具進(jìn)行比對，分析其特異性，將探針的5‘端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記Eclipse。引物和探針序列詳見表2。

表1　實(shí)驗(yàn)所用菌株Table 1 Strains in this study

表2　實(shí)驗(yàn)中所用引物探針序列信息Table 2 Information about the primers and probes

1.4擴(kuò)增內(nèi)參的構(gòu)建

采用復(fù)合引物法[14]構(gòu)建擴(kuò)增內(nèi)參（IAC），選擇乳倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）的Nmi基因作為內(nèi)參基因，使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增內(nèi)參引物和探針（序列見表2），將內(nèi)參探針標(biāo)記CY5熒光基團(tuán)，在內(nèi)參引物5’末端分別連接上ipaH檢測引物，形成一對內(nèi)參引物和目標(biāo)引物的長引物，經(jīng)長引物擴(kuò)增后得到擴(kuò)增內(nèi)參。內(nèi)參片段連接載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，測序驗(yàn)證；提取質(zhì)粒，測定濃度，-20℃保存?zhèn)溆?，菌液于甘油?80℃保存。

2　方法

2.1志賀氏菌基因組DNA的提取

本研究中志賀氏菌（福氏志賀氏菌CICC21678，下同）基因組DNA的提取分別采用以下2種方法進(jìn)行。

2.1.1水煮法將1 mL菌液轉(zhuǎn)入1.5 mL Eppendorf離心管中5 000～8 000 r/min離心5 min，棄上清收集菌體。加入200 μL無菌去離子水，振蕩混勻，100℃水浴10 min后，12 000 r/min離心10 min，上清作為DNA模板-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2水洗法加天根提取試劑盒法取增菌液樣品1 mL，放入1.5 mL離心管中，800 r/min離心5 min或靜置5～10 min，沉淀培養(yǎng)物中的食品殘?jiān)?。取上清液，? 000 r/min離心5 min，收集菌體。倒去上清液后，用無菌雙蒸水重懸浮菌體，離心洗滌3次，然后將沉淀用試劑盒進(jìn)行DNA提取。

2.2志賀氏菌ipaH實(shí)時(shí)熒光定量PCR中引物和探針濃度的優(yōu)化

以志賀氏菌基因組DNA作為模板，取不同濃度的引物和探針組合，以能給出最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度的組合為最佳組合。反應(yīng)體系為25 μL：2× Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物設(shè)定終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L，探針設(shè)定終濃度為0.12、0.16、0.18、0.2 μmol/L，ROXⅡ0.5 uL，模板DNA 50～100 ng，用dd H2O補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃35 s，40個(gè)循環(huán)。60℃時(shí)收集熒光。

2.3志賀氏菌ipaH實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)2.2中確立的最佳引物探針濃度和反應(yīng)條件，水作為空白對照，提取表1中志賀氏菌和其他病原菌的基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，通過觀察擴(kuò)增曲線驗(yàn)證所建立的志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性。

2.4志賀氏菌ipaH實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中IAC探針濃度和添加量的優(yōu)化

在2.2中確定的靶基因最佳引物探針濃度基礎(chǔ)上，對反應(yīng)體系中內(nèi)參探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。探針終濃度分別設(shè)0.12、0.14、0.16、0.18 μmol/L，反應(yīng)體系中包含106考貝的IAC，反應(yīng)條件同前，以能給出最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度的最小IAC探針濃度為最佳濃度。

IAC添加量過多會(huì)抑制靶基因的擴(kuò)增，需要對IAC添加量進(jìn)行優(yōu)化。在其他條件已確定的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中添加102、103、104、105、106考貝的IAC，選取能獲得IAC擴(kuò)增陽性信號，同時(shí)又不影響靶基因擴(kuò)增的添加量作為IAC最佳添加量。

2.5IAC對志賀氏菌ipaH實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性影響

根據(jù)2.4中確定的IAC最佳探針濃度和添加量，建立加入IAC后的志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR （ipaH-IAC）反應(yīng)體系。對表1中菌株提取基因組DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，確定IAC添加后所建立的反應(yīng)體系對志賀氏菌檢測的特異性影響。

2.6 ipaH-IAC實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的靈敏性和定量范圍

2.6.1靈敏性檢測將已知濃度的志賀氏菌基因組DNA做10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度各取1 μL為模板，按照ipaH-IAC實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能得到擴(kuò)增曲線的最低濃度即為該反應(yīng)體系檢測的最高靈敏度。

2.6.2定量范圍檢測將志賀氏菌經(jīng)過夜純培養(yǎng)后，用滅菌PBS作10倍梯度稀釋，并選擇105、106、1073個(gè)稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，以此計(jì)算原始菌落數(shù)。每個(gè)稀釋度各取1 mL菌液，用水煮法提取基因組DNA，用50 μL滅菌水溶解DNA，取1 μL為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.7志賀氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

以志賀氏菌基因組DNA為模板，擴(kuò)增ipaH靶基因，凝膠回收，連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，將菌液送上海生工測序進(jìn)行鑒定。

將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，并測定濃度，計(jì)算對應(yīng)的拷貝數(shù)，做10倍列稀釋，最終至1考貝/ uL，制成標(biāo)準(zhǔn)模板溶液，分別取1 μL作為模板進(jìn)行ipaH和ipaH-IAC實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，通過不同Ct值和濃度，分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終得到線性方程。分析比較兩種方法的檢測結(jié)果，確認(rèn)IAC對志賀氏菌檢測精確度的影響。

2.8 ipaH-IAC實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將志賀氏菌純培養(yǎng)物按10倍梯度稀釋，取4個(gè)稀釋度的樣本分別作3個(gè)重復(fù)，用以上建立的方法在ABI7500進(jìn)行擴(kuò)增檢測，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)，評價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。將試劑配制成試劑盒，考察試劑盒在-20℃條件下儲(chǔ)存6個(gè)月后的穩(wěn)定性。

2.9 ipaH-IAC實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對志賀氏菌模擬污染樣本的檢測

Establishment of Fluorescence Quantitative PCR Assay in Detection of Shigella Based on Internal Reference

WANG Jianchang，WANG Jinfeng，LI Jing，SUN Xiaoxia，CHEN Ruichun*
（The Technical center of Hebei entry-exit inspection and quarantine bureau，Shijiazhuang 050051，China）

Abstract：According to Shigella gene sequences published by Genbank，we selected specific target genes，designed specific primers and probes and optimized the reaction system. An internal amplification control（IAC）was added to reaction system. This IAC was detected by TaqMan probes labeled with different fluorophore. 5～50 CFU/25 g artificially contaminated sample was added to evaluate the performance of reaction system. The assay was could be used reliably for detection of Shigella with a sensitivity of 1pg/uL. For the 10 -fold dilutions bacteria DNA extracted by cooking water，the lowest detection limit was 9×103cfu/mL. But for the plasmid with ipaH，the lowest detection limit can reach 103copies /uL. The standard curve of ipaH and ipaH-IAC was established，and the quantification was linear between Ct and template copy number（R2=0.999）. While the initial sample amount of artificially contaminated bacteria was 10 CFU/25 g mutton，the Shigella could bebook=67,ebook=69detected after 6 hours culture. The ipaH-IAC fluorescence quantitative PCR assay was developed. It could not only be applied for detection of Shigella in food，but also monitor the PCR reaction system and prevent the false negatives. Therefore，the ipaH-IAC fluorescence quantitative PCR assay further ensures the reliability of the results and is conducive to the realization of standardized quantitative PCR method for Shigella in samples.

Keywords：Shigella，ipaH，Real Time PCR，IAC

*通信作者：陳瑞春（1963—），男，河北承德人，研究員，主要從事食品安全研究。E-mail：crcde@163.com

作者簡介：王建昌（1981—），男，山東臨朐人，農(nóng)學(xué)博士，獸醫(yī)師，主要從事食源性微生物、動(dòng)物疫病病原的分子生物學(xué)檢測研究。E-mail：18630135980@163.com

基金項(xiàng)目：質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201310126）。

收稿日期：2014-00-00

中圖分類號：

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0066—11