柯　野，　李嘉盛，　曾松榮，　朱兆靜，　黃小惠（韶關學院英東生命科學學院，廣東韶關512005）

?

米曲霉酸性蛋白酶Ap的結構分析

柯野，李嘉盛，曾松榮，朱兆靜，黃小惠
（韶關學院英東生命科學學院，廣東韶關512005）

摘要：米曲霉（Aspergillus oryzae）酸性蛋白酶與部分商品化的蛋白酶相比，具有對大豆蛋白水解效率高且水解產物苦味弱的特性。作者采用RT-PCR技術克隆獲得酸性蛋白酶（Ap）基因，結合生物信息學手段，對Ap進行分析與預測。結果表明：Ap基因對密碼子使用頻率具有偏好性，特別是第3位密碼子對GC堿基的使用頻率高，達到74%；編碼404個氨基酸殘基。Ap屬于胞外天冬氨酸蛋白酶。以海棗曲霉（A. phoenicis）的酸性蛋白酶（PDB code：1IBQ）作為模板同源建模結果可知，Ap分子至少能與2個Zn2+結合，內含1個二硫鍵、163個氫鍵、35個鹽堿。該酶與1IBQ相比空間結構總體相似，部分重要位點（如flap環(huán)、轉角和ψ-loops）的氨基酸殘基較為保守。

關鍵詞：米曲霉；酸性蛋白酶；結構分析

蛋白酶是一類重要的工業(yè)酶，占整個酶制劑總量的60%以上，廣泛應用于醫(yī)藥、皮革、食品和化工等多種行業(yè)[1]。目前商品化的蛋白酶制劑主要來源于細菌和植物；而霉菌源蛋白酶主要來自于毛霉和曲霉，且商品化相對較少。霉菌蛋白酶對植物蛋白的水解效率高、無苦味，水解產物具有多種生理活性，具有其他商品化蛋白酶無可比擬的優(yōu)勢而日趨受到關注[2]。

米曲霉（Aspergillus oryzae）是生物技術中重要的一種曲霉。該菌廣泛應用于傳統(tǒng)的酒類、醬油和豆醬等食品發(fā)酵工業(yè)；主要是由于米曲霉能產生多種蛋白酶，這些蛋白酶對大豆蛋白的水解效率高、水解產物苦味少以及對獨特風味起關鍵作用[1，3]，對提高食品發(fā)酵行業(yè)原料蛋白質的氨基酸態(tài)氮轉化率和利用率起重要作用；因此，米曲霉蛋白酶受到科研工作者的普遍關注。目前，國內外學者的研究主要集中于利用傳統(tǒng)的育種手段和優(yōu)化發(fā)酵條件方式來提高米曲霉的產蛋白酶量；或分離純化蛋白酶，對其酶學性質方面的研究[4]。對于蛋白酶的分子生物學方面的研究，主要體現(xiàn)在對米曲霉全基因組的測序；據2007年全基因組的測序結果預測可知，該菌一共編碼134個蛋白酶，其中65個內肽酶、69個外肽酶，只有少數幾個蛋白酶的功能與性質有所掌握，而絕大多數蛋白酶的結構與功能方面的研究鮮見報道。因此，作者根據Genbank中報道的米曲霉酸性蛋白酶（Ap）的基因序列，對該基因進行RTPCR克隆及測序；利用生物信息學對該基因及其推導編碼的酶學性質、結構與功能等方面進行分析，以期對該酶的結構功能、外源表達和定向改造等方面的研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株米曲霉（A. oryzae）：購自上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司。

1.1.2工具酶和試劑PCR擴增引物：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；RT-PCR試劑：購自寶生物（大連）有限公司；Trizol試劑：購自Invitrogen公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2試驗方法

1.2.1米曲霉的培養(yǎng)在麩皮固體培養(yǎng)基平板上先鋪上滅菌后的玻璃紙，然后接種米曲霉，25.0℃培養(yǎng)48 h后收集菌絲體。麩皮培養(yǎng)基成分的具體組成如下（質量分數）：0.74% KH2PO4，0.06% FeSO4· 7H2O，1.56%蛋白胨，0.23%麥芽糖，96.41%麩皮，培養(yǎng)基初始含水量為1.0～1.5 mL/g。

1.2.2 RNA的提取將收集的菌絲體浸泡在液氮中進行研磨至粉末，根據Trizol試劑盒的操作手冊提取并鑒定總RNA質量，將提取的總RNA放置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA的合成利用寶生物（大連）有限公司的反轉錄試劑盒，按照試劑盒的操作手冊，對RNA反轉錄生成cDNA。

1.2.4 Ap基因的克隆由Genbank數據庫中報道的米曲霉Ap基因序列（登錄號：XM_001824123），利用Oligo 6.0軟件設計引物，上游引物：5’-CTATGGTTATCTTGAGCAAAG-3’，下游引物：5’-ATTAGTCAGGCATTTAAG-3’，以1.2.3的cDNA作為模板，采用上下游引物進行PCR反應。反應程序如下：94℃預變性4 min；94℃變性15 s，50℃退火15 s，72℃延伸2.5 min，30個循環(huán)；然后72℃保溫5 min。電泳鑒定PCR產物，對PCR產物回收加A后，克隆至載體pMD18-T上，化轉于大腸桿菌DH5α菌株中，篩選陽性轉化子測序確認。

1.2.5 Ap基因的分析利用Bio-Edit 7.0軟件進行序列比對，http：//www.expasy.org/中的部分程序對酶序列的功能位點進行初步分析，http：//www.cbs. dtu.dk/services /TargetP/的信號肽分析，http：// swissmodel.expasy.org/進行空間結構的預測，http：// swift.cmbi.ru.nl/ servers/html/分析拉曼圖對結構合理性的評價，Swiss -Pdb Viewer 4.0.3和Discovery studio 2.5等軟件進行酶空間的比對分析，http：// swift.cmbi.ru.nl/servers/html/的程序對酶的氫鍵數、鹽鍵數和溶劑可及表面積等方面的預測分析。

2　結果與分析

2.1米曲霉的總RNA提取及Ap基因全長cDNA的克隆結果

米曲霉的總RNA提取結果見圖1。圖1可見，28s rRNA和18s rRNA條帶清晰可見，28s rRNA的寬度和亮度分別約為18s rRNA亮度的1倍和2倍，且RNA未見明顯降解；該結果表明提取的RNA質量較高，達到RT-PCR的質量要求。

利用Ap基因的引物和以cDNA為模板，獲得預期的PCR產物（見圖2）。該PCR產物測序結果表明，Ap核苷酸序列與GenBank數據庫報道的同源性達到99 %以上，僅核苷酸T981突變?yōu)镃；而相應的氨基酸殘基未突變。利用http：//www.kazusa.or.jp/ codon/對A. oryzae的12 388條CDS序列的密碼子使用頻率分析可知，該菌對密碼子使用存在偏好性，即第1位、第2位和第3位的密碼子GC使用頻率分別為56.53 %、43.87 %和55.88 %；對Ap基因而言，第1位、第2位和第3位的密碼子GC使用頻率分別為58.0%、46.0%和74.0%。在一般情況下，密碼子在同一生物存在相似的密碼子偏好性；該結果也表明Ap基因的密碼子使用偏好性與米曲霉中基因密碼子使用偏好性較一致。

2.2 Ap的一級結構分析

Ap是由404個氨基酸殘基組成，其中Met和Cys殘基數最少（2個），Gly殘基數最多（44個）。G、S、T、C、Y、N和Q極性氨基酸為162個，A、V、L、I、F、W、M和P非極性氨基酸殘基數為167個；該結果表明極性和非極性氨基酸殘基的含量較一致。氨基酸殘基序列中1-20氨基酸序列為信號肽，21-78氨基酸序列為前導肽，79-404氨基酸序列為成熟肽；成熟肽的理論等電點為4.03，該酶屬于胞外的天冬氨酸蛋白酶。利用http：//www.expasy.org/prosite對活性位點的預測可知，Ap的活性位點殘基為D111和D293。

圖1　米曲霉的總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of isolated RNA from A. oryzae

圖2　Ap基因的PCR產物電泳Fig. 2 Electrophoresis of PCR products of Ap gene

2.3 Ap的同源建模及二級結構分析

用Ap的成熟肽序列（即Ap全長氨基酸序列的第79-404肽鏈）與海棗曲霉（A. phoenicis）酸性蛋白酶的序列（該序列是PDB數據庫（http：//www.rcsb. org/pdb/home/home.do）中提供的成熟蛋白酶晶體結構的全長氨基酸序列，該酶晶體結構的編號為1IBQ）同源性達到73.375%，（見圖3）；據序列同源性達到30%以上可以進行同源建模的原則，這表明1IBQ可以作為Ap的模板進行同源建模。模擬的Ap結構見圖4，利用Ramachandran對該模型分析，結果表明其主鏈ψ和φ角均在合理范圍之內，這表明構建的3-D結構合理。

圖3　Ap與海棗曲霉酸性蛋白酶（PDB code：1IBQ：B）的序列比對及二級結構分析Fig. 3 Comparison of sequences and secondary structures of Ap and acid protease（PDB code：1IBQ.B）from A. phoenicis

圖4　Ap的3-D結構模型Fig. 4 Overall 3-D structure model of Ap

由圖4可見，Ap是由兩個明顯的C-端和N-端結構域的β-barrel構成。N-端結構域和C-端結構域中均分別包含3個β折疊，即1N、2N、3N、1C、2C 和3C；N-端結構域與C-端結構域是由6個β折疊鏈連接在一起，并且兩結構域之間形成的cleft是底物結合區(qū)域[5]，此外Ap中還包含3個310-螺旋和5 個α螺旋?；钚晕稽c殘基D33（根據Ap的成熟肽序列編號，下同）和D215分別位于N-端結構域與C-端結構域上。由Y75-G78殘基片段形成的β發(fā)夾結構為flap結構，該結構保護活性殘基免受溶劑的攻擊[6]。Ap與模板1IBQ的結構比較可知，雖然這兩種蛋白酶的結構大體相似，但是部分二級結構的長短和連接二級結構間的loop環(huán)等方面的殘基具有差異，這些差異可能是導致兩種酶性質不同的原因之一[7]。

2.4 Ap保守殘基的分析

通過對多種蛋白酶（如PDB code：1IBQ、3APP、4APE和2APR等）的分析可知：在這些酶中，部分位點的氨基酸非常保守，且這些位點主要位于N-端結構域，少數位于C-端結構域；如24、35、76、78、83、120、123、168、177、217和302位點均是G，該G對酶二級結構中的轉角構象起重要作用。33-35片段和215-217片段形成保守的活性位點“DTG”Motif結構；在酶的空間結構中，T34和T216殘基的側鏈羥基分別與對面活性位點“DTG”Motif結構中活性殘基D的上一個殘基主鏈上的N或O形成氫鍵，因此，該氫鍵鏈接兩個ψ-loops環(huán)，維持和穩(wěn)定活性位點區(qū)域的局部結構具有重要作用，該結構被稱為“fireman’s grip”結構[6]。Y17、W40、S60、Y75、D88、Q100和A323等位點較為保守，這些殘基間通過氫鍵作用連接或調控相鄰的loop環(huán)或鏈，具有維持局部結構穩(wěn)定的作用，如N-端結構域β鏈上的Y17側鏈上的H與鄰近β鏈上K158主鏈上的羰基O形成了氫鍵，這個氫鍵維持兩個β鏈間的穩(wěn)定性起到重要作用。

2.5 Ap中Zn2+和二硫鍵分析

Zn2+離子在較多的酶中具有催化或維持結構穩(wěn)定的作用[8]。對于1IBQ而言，該酶結合了4個Zn2+結合（見圖5）；其中2個Zn2+（即Zn1和Zn2）位于酶分子的內部，另外2個Zn2+（即Zn3和Zn4）位于酶分子表面，該兩個Zn2+調控對稱的兩個酶分子間的接觸。對于Zn1而言，Zn2+位于1IBQ結構中的H28、D55和D119殘基之間，并且Zn2+與D55側鏈上的O結合；在Ap中，D55和D119的殘基均保守，N28殘基的側鏈基團比1IBQ中的H殘基的側鏈基團小，占用的空間位置也就相應的減少，因此在該空間中能容納Zn2+，Ap在Zn1位點能夠結合Zn2+（見圖5 b）。對于Zn2而言，Zn2+位于模板1IBQ的活性殘基D33和D215間，Zn2+與D214側鏈上的O結合；在Ap中，活性位點D32和D215殘基為保守殘基，空間大小和距離均與1IBQ一致，這表明Ap在Zn2位點能結合Zn2+。對于Zn3而言，Zn2+位于1IBQ 的D149與Ser2之間，且Zn2+與D149的殘基側鏈相結合；對于Ap，在位點1具有S殘基，但空間結構的預測中未含S1殘基，因此無法判斷是否結合Zn2+。對于Zn4而言，Zn2+位于1IBQ的E233位點；在Ap中為K殘基，K殘基的側鏈基團比E長，占據了Zn2+空間，因此Ap可能Zn4位點無Zn2+結合。

在一般情況下，二硫鍵利于酶的熱穩(wěn)定性與結構穩(wěn)定性[9]。在1IBQ中C251和C281殘基間形成二硫鍵；在Ap中該2位點也有C殘基，且其與1IBQ的空間結構一致，因此Ap中該2個C之間形成一個二硫鍵。

2.6 Ap氫鍵和鹽鍵的分析

酶中的氫鍵對酶整體結構的穩(wěn)定性具有極其重要的作用；相對而言，鹽鍵更有助于局部結構的穩(wěn)定性[10]。利用http：//swift.cmbi.ru.nl/servers/html/中的Optimal Hydrogen Bonding Network算法可知，1IBQ B的氫鍵數為164個，Ap為163個。1個鹽鍵的定義：以相距為7.0?以內且?guī)喾措姾傻?個殘基之間可形成1個鹽鍵，H殘基定義為帶正電荷；因此，1IBQ B的鹽鍵數為41個，Ap為35個；在這些鹽鍵中，大部分位點的鹽鍵較保守，對酶的穩(wěn)定性起重要的作用，如位于N端結構域的D14殘基和位于C端結構域的K307殘基間形成1個鹽鍵，該鹽鍵對兩結構域間的相對穩(wěn)定性起到一定的作用。由上可知，兩種酶間的氫鍵和鹽鍵的位置與數量具有一定的差異，這種差異可能是導致兩種酶穩(wěn)定性不同的原因之一。

圖5　Ap與海棗曲霉酸性蛋白酶的Zn2+結合位點分析Fig. 5 Analysis of the zinc binding sites of Ap and acid protease（PDB code：1IBQ.B）from A. phoenicis

2.7 Ap活性位點的溶劑可及表面積的分析

天冬氨酸蛋白酶的催化機制是：利用一個活性催化殘基D側鏈的O原子和溶液中的H2O結合后激活H2O分子，激活后的H2O對底物肽鏈骨架中羰基的C原子進行親核攻擊，另一個催化殘基D對底物的質子化導致底物肽鏈的切斷[11]。溶劑可及表面積表明酶與底物和H2O等的接觸情況，對酶的催化效率和催化環(huán)境的適應性等方面具有重要的影響[12]。對兩種酶的活性位點殘基的溶劑可及表面積計算可知：兩種酶活性位點殘基主鏈的溶劑可及表面積均為0；而側鏈的溶劑可及表面積的差異較大，Ap的活性位點殘基的側鏈溶劑可及表面積均高于1IBQ，這就表明Ap的側鏈基團更易與H2O結合，可能更利于親核攻擊，提高酶的催化活性。

2.8 Ap底物結合區(qū)域的ψ-loop結構分析

酶的底物結合區(qū)域與底物結合后，才能對底物進行水解切割；因此，底物結合區(qū)域對酶的肽鍵選擇性、水解特性和水解效率等方面起關鍵性的作用[13]。由圖3-4可知，兩個靈活的ψ-loops分別均是Ap和1IBQ B的底物結合區(qū)域S1’-S2的重要組成部分；這兩個ψ-loops均位于酶的1C區(qū)域，每個ψloop均包含2個β鏈。一個ψ-loop稱為ψin環(huán)，主要由211-223位點的殘基片段構成；活性位點“DTG”Motif結構位于ψin結構的轉角。在兩種酶的比較可知，轉角部分的殘基保守，而β鏈頂部的2個殘基具有突變，即1IBQ是S211-A212和I221-L222，在Ap中分別突變?yōu)門G和VM，而該幾個突變殘基的空間結構相似，且離活性位點相對較遠，對酶的性質影響較小。另一個稱為ψout環(huán)，主要由完全保守的289～302位點的殘基片段構成，該環(huán)突出于酶表面，部分覆蓋了酶的活性cleft，環(huán)中的L296 和L298殘基對S1’-S2底物結合區(qū)域的構型起重要的作用。

3　結語

克隆獲得米曲霉的酸性蛋白酶（Ap）基因，然后對Ap的結構進行了預測與分析。結果表明：Ap基因對密碼子使用頻率具有明顯的偏好性。Ap屬于胞外天冬氨酸蛋白酶，且Ap分子至少能與2個Zn2+結合，含1個二硫鍵、163個氫鍵、35個鹽堿。該酶的部分重要位點（如flap環(huán)、轉角和ψ-loops）的氨基

參考文獻：酸殘基較為保守，研究可為該酶的結構功能、異源表達和定向改造等方面的研究提供參考。

[1]A Sumantha，C Larroche，A Pandey. Microbiology and industrial biotechnology of food-grade proteases：a perspective[J]. Food Technology and Biotechnology，2006，44（2）：211-220.

[2]潘進權.蛋白酶脫除大豆蛋白水解物苦味的研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（5）：167-171. PAN Jinquan. Research progress on the debittering of soy protein hydrolysate with proteases[J]. Food Research And Development，2011，32（5）：167-171.（in Chinese）

[3]T Nakadai，S Nasuno，N Iguchi. The action of peptidases from A.oryzae in digestion of soybean proteins[J]. Agricultural and Biological Chemistry，1972，36（2）：261-268.

[4]J Chutmanop，S Chuichulcherm，Y Chisti，et al. Protease production by Aspergillus oryzae in solidstate fermentation using agroindustrial substrates[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2008，83（7）：1012-1018.

[5]SW Cho，NJ Kim，MU Choi，et al. Structure of aspergillopepsin I from Aspergillus phoenicis：variations of the S1'-S2 subsite in aspartic proteinases[J]. Acta Crystallographica Section D（Biological Crystallography），2001（57）：948-956.

[6]JB Cooper，G Khan，G Taylor，et al. X-ray analyses of aspartic proteinases. II. Three-dimensional structure of the hexagonal crystal form of porcine pepsin at 2.3 ? resolution[J]. Journal of Molecular Biology，1990，214（1）：199-222.

[7]JS Roland，M de V William，A M L Jack，et al. Homology modelling and protein engineering strategy of subtilases，the family of subtilisin-like serineproteinases[J]. Protein Engineering Design＆Selection，1991，4（7）：719-737.

[8]IL Alberts，K Nadassy，SJ Wodak. Analysis of zinc binding sites in protein crystal structures[J]. Protein Science，1998，7（8）：1700-1716.

[9]Han Zhen-lin，Han Shuang-yan，Zheng Sui-ping，et al. Enhancing thermostability of a Rhizomucor miehei lipase by engineering a disulfide bond and displaying on the yeast cell surface[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，85（1）：117-126.

[10]J Arnórsdottir，M M Kristjánsson，R Ficner. Crystal structure of a subtilisin-like serine proteinase from a psychrotrophic vibrio species reveals structural aspects of cold adaptation[J]. Federation of European Biochemical Societies Journal，2005，272（3）：832-845．

[11]S Chitpinityol，MJC Crabbe. Chymosin and aspartic proteinases[J]. Food Chemistry，1998，61（4）：395-418.

[12]AH Deng，J Wu，GQ Zhang，et al. Molecular and structural characterization of a surfactant-stable high-alkaline protease AprB with a novel structural feature unique to subtilisinfamily[J]. Biochimie，2011，93（4）：783-791.

[13]LM Liang，ZH Meng，F(xiàn)P Ye，et al. The crystal structures of two cuticle-degrading proteases from nematophagous fungi and their contribution to infection against nematodes[J]. Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2010，24（5）：1391-1400.

Structural Analysis of Acid Protease ( Ap) from Aspergillus oryzae

KE Ye，LI Jiasheng，ZENG Songrong，ZHU Zhaojing，HUANG Xiaohui
（Yingdong college of life sciences，Shaoguan University，Shaoguan 512005，China）

Abstract：Compared with some commercial proteases，acid protease（Ap）from Aspergillus oryzae has high hydrolysis efficiency and produces soy hydrosates with weaker bitterness. In order to uncover the structural characteristics，Ap gene from A. oryzae was cloned by RT-PCR technology，and then was analyzed with bioinformatics technology. Results showed that Ap gene had a preference for codon usage，especially for the third codon with the 74% usage frequency of GC base，and encoded 404 amino acid residues. Ap was an extracellular aspartic proteinase. According to the structure obtained by homology modeling with acid protease from A. phoenicis（PDB code：1IBQ），Ap was found to possess at least two Zn2+binding sites，one disulfide bond，163 hydrogen bonds，35 salt bonds，and two solvent accessible surfaces of D33（4.7849?2）and D215（3.5941?2）. Though the spatial structures of Ap and 1IBQ were similar，residues of some important sites（such as flap ring，angle and ψ-loops）were conservative.

Keywords：Aspergillus oryzae，acid protease，structural analysis

作者簡介：柯野（1977—），男，四川瀘縣人，理學博士，副教授，主要從事微生物學與酶工程的研究。E-mail：keye518@163.com

基金項目：廣東省科技計劃項目（2011B010500018）；韶關市科技專項資金資助項目（2013CX/K83）；韶關學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃省級立項項目（1057613-003）；韶關學院大學生科技創(chuàng)新培育項目（2015-6）。

收稿日期：2014-08-21

中圖分類號：Q 816；Q 71

文獻標志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0095—06